我们介绍一种简便、快速且相对经济的基因敲除Streptococcus mutans菌株的构建方法；该技术可适用于多种物种基因敲除菌株的构建。
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摘要
摘要
阐明特定基因功能的常用方法包括对野生型菌株和目标基因被破坏的菌株进行表型比较分析。含有合适抗生素抗性标记基因的基因破坏DNA构建体可用于在细菌中构建基因破坏菌株。然而，传统的构建方法需要基因克隆步骤，涉及复杂且耗时的操作流程。本文介绍一种相对简便、快速且成本较低的针对Streptococcus mutans的靶向基因破坏方法。该方法利用两步融合聚合酶链式反应（PCR）生成破坏构建体，并通过电穿孔实现遗传转化。该方法除PCR外无需任何酶促反应，同时在破坏构建体的设计上具有更高的灵活性。采用电穿孔技术有助于感受态细胞的制备，并提高转化效率。本方法可适用于多种物种基因破坏菌株的构建。
引言
基因功能分析通常涉及对野生型菌株与特定目标基因被破坏的突变菌株之间的表型比较。这种基因破坏技术已广泛应用于从细菌到哺乳动物等多个分类群的基因功能研究中。构建基因破坏菌株需要使用基因破坏载体；该脱氧核糖核酸（DNA）载体由抗生素抗性标记基因与目标基因上下游侧翼序列融合而成，并通过同源重组整合至基因组中。利用含有相应抗生素的选择性培养基可筛选获得基因破坏菌株。传统构建基因破坏菌株的方法包括多个复杂步骤，例如通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因、将基因连接至合适的质粒载体、限制性内切酶消化以及重新连接以插入抗生素抗性基因。该过程耗时较长，通常需要数天至数周，具体时间取决于各步骤的成败。此外，破坏载体的设计依赖于目标基因的限制性酶切位点。为解决上述问题，已有研究报道了基于PCR的DNA拼接方法1,2，用于构建Dictyostelium discoideum3和Synechocystis sp. PCC68034的基因破坏突变体。本研究建立了一种相对快速、简便且经济的方法，用于生成链球菌基因破坏菌株，该方法采用一种改良的基于PCR的两步融合PCR技术构建破坏载体，并通过电穿孔实现遗传转化。
两步融合PCR需要基因组DNA、抗生素抗性标记基因作为PCR模板，以及四对设计合理的寡核苷酸引物。第一步（1st PCR），通过PCR扩增目标基因的1-kb上游侧翼区、目标基因的1-kb下游侧翼区以及抗生素抗性标记基因。用于扩增上游和下游侧翼区的反向引物和正向引物的5'端，分别包含15个与标记基因末端互补的碱基。同样，用于扩增标记基因的正向和反向引物的5'端，分别包含15个与目标基因上游侧翼区下端和下游侧翼区上端互补的碱基。因此，这三个扩增片段在融合位点处含有30个碱基对的重叠区域。第二步（2nd PCR），使用巢式PCR引物对之前通过1扩增出的三个片段进行PCR扩增st PCR 作为模板。模板的互补区域还通过 2 相互连接nd PCR。最后，通过电穿孔将用于同源重组的构建体导入野生型菌株。可使用特异性引物通过PCR验证基因敲除是否成功。尽管使用高保真DNA聚合酶扩增敲除构建体，但无需额外的酶促反应（如DNA连接或DNA消化）即可完成构建体的制备。此外，根据引物设计，基因组上待删除或保留的区域可灵活选择。
本研究中，通过缺失Streptococcus mutans中编码葡萄糖基转移酶的gtfC基因的全部编码区，展示了在链球菌属物种中快速、简便的基因破坏方法。此外，以相同方式构建了gtfB基因破坏菌株。gtfC和gtfB基因编码的葡萄糖基转移酶均参与致龋性牙菌斑生物膜的形成5,6。对野生型菌株（S. mutans WT）、gtfC基因破坏菌株（S. mutans ΔgtfC）以及gtfB基因破坏菌株（S. mutans ΔgtfB）的生物膜形成能力进行了评估，以进行表型比较分析。该实验方案将两步法基因破坏技术的应用拓展至另一种物种，并可进一步修改用于更广泛分类群中的基因功能研究。
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方案
1. 引物设计
- 准备用于两步融合PCR及基因敲除验证的引物。
注意： 表1 显示了本方案中使用的引物序列。 图1 展示了用于生成的两步融合PCR方法的示意图 S. mutans ΔgtfC.- 设计引物以用壮观霉素抗性基因替换基因组中的目标区域（spcr)7. 该方案将整个编码区替换为 gtfC 基因与 spcr.
- 包含与上下游末端互补的15个碱基 spcr 分别位于上行反向引物和下行正向引物的5'端区域。类似地，包含15个碱基，其与上游侧翼区域的下游末端互补。 gtfC 下游侧翼区域的上端 gtfC 在5'区域 spcr-正向和 spcr-反向引物，分别（图1A).
注意：序列为上-反向、下-正向， spcr-正向，以及 spcr- 反向引物根据破坏构建体插入位点自动确定。 - 设计上游正向引物和下游反向引物，使其包含 >1-kb 上游和下游侧翼区域 gtfC 基因，分别。设定熔解温度（Tm）上游正向引物和下游反向引物的用量应分别根据上游反向引物和下游正向引物的熔解温度确定（图1A).
注意：请参考以下公式来确定 Tm: Tm (°C) = 2(*NA + *NT) + 4(*NC + *NG) - 5，其中 *N 代表具有特定碱基类型（A、T、C 或 G）的引物核苷酸数目。 - 设计针对2的巢式引物（N_up-上游引物和N_up-下游引物）nd PCR（聚合酶链式反应）图1B).
注意：尽管最外侧的引物对（up-forward 和 down-reverse）可作为第2轮PCR的引物使用nd PCR，本方案中设计了巢式引物（N_up-上游正向引物和N_up-上游反向引物）。巢式引物通常需要用于2nd PCR，如文中详述的 代表性结果. - 设计特异性引物 spcr引物用于菌落PCR以筛选 gtfC 破坏
- 设计用于验证的引物 gtfC 破坏
注意：使用这些引物扩增的PCR产物跨越了边界区域 gtfC 或 spcr 及其上游或下游侧翼区域 gtfC引物组gtfC 向上前方 gtfC 上调-逆转' 和 'gtfC 向下-向前和 gtfC 下调-反向是特异性的 gtfC，以及“gtfC 向上-向前和 spcr2-反向' 和 'spcr2-正向和 gtfC 下调-反向是特异性的 spcr.
2. 从S. mutans中提取基因组DNA
- 划线接种菌种 S. mutan将UA159接种于脑心浸液（BHI）琼脂平板上，在37 °C厌氧条件下培养过夜。
- 使用无菌牙签挑取单个菌落，接种于5 mL BHI肉汤中。培养 S. mutan37 °C 厌氧条件下过夜培养。
- 将细菌培养物在2,000 × g条件下离心15分钟。用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀。
- 离心15分钟，2,000 × g。用200 µL PBS重悬细胞沉淀。
- 使用珠磨法基因组DNA提取试剂盒，按照制造商提供的说明书从悬浮液中提取基因组DNA。
- 将悬液转移至含有玻璃珠（试剂盒中提供）的2.0 mL样品管中。向细胞悬液中加入750 µL裂解液（试剂盒中提供）。
- 盖紧盖子，将试管对称放入珠磨破碎仪的试管架中。以最大速度处理5分钟。将珠磨后的样品在10,000 × g离心1分钟。将上清液转移至含有离心滤器（试剂盒中提供）的2.0 mL收集管中，在7,000 × g离心1分钟。.
- 向滤液中加入1,200 µL DNA结合缓冲液（试剂盒提供）。将800 µL混合液转移至离心柱（试剂盒提供）中，放入2.0 mL收集管内，于10,000 ×g离心1分钟。
- 弃去穿流液，向离心柱中加入200 µL预洗缓冲液（试剂盒提供），以洗涤柱基质，于10,000 × g离心1分钟。弃去穿流液，向离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液（试剂盒提供），以洗涤柱基质，于10,000 × g离心1分钟。
- 将离心柱放入一个新的1.5 mL微量离心管中，然后向柱基质中加入100 µL洗脱缓冲液（试剂盒中提供）。
- 以 10,000 × g 离心 30 秒 g 以洗脱基因组DNA。使用分光光度计在260 nm和280 nm处测定吸光度，估算DNA浓度和纯度，并确认A260/A280 比值大于1.8。
3. PCR 扩增
- 执行第1步st 使用 PCR 的方法 S. mutans WT 基因组与合成基因组 spcr 基因作为PCR模板（参见 表1。扩增上游侧翼区域的 gtfC 基因，下游侧翼区的 gtfC 基因，以及 spcr 使用上述三组引物扩增目的基因（图1A），根据 表 2 和 表3.
注意：PCR 引物、试剂和扩增循环条件总结如下 表1, 表2，以及 表3分别。 - 在1%琼脂糖凝胶上对每个PCR产物进行分离，并使用凝胶条带切割器切下相应的条带。
- 使用基于离心柱和硅胶膜的凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化每种扩增的DNA产物。
- 将凝胶切片转移至洁净的微量离心管中，加入500 µL结合缓冲液（试剂盒提供）。55 °C孵育15分钟，直至凝胶切片完全溶解。
- 将离心柱（试剂盒中提供）放入收集管（试剂盒中提供）中，将样品加入离心柱，于11,000 × g离心30秒。 g弃去穿流液，向离心柱中加入600 µL洗涤缓冲液（试剂盒提供），以洗涤硅胶膜，然后在11,000 × g下离心30 s。 g.
- 弃去流穿液，以11,000 × g离心2分钟 g 干燥硅胶膜。
- 将离心柱放入一个新的1.5 mL微量离心管中，加入50 µL洗脱缓冲液（试剂盒中提供），室温孵育2 min。
- 在11,000 × g下离心2分钟 g 以洗脱扩增的DNA。使用分光光度计在260 nm和280 nm处测定吸光度，估算DNA浓度和纯度，并确认A260/A280 比值大于1.8。
- 执行第2步nd 使用三个大致等摩尔的片段作为PCR模板，进行两步融合PCR扩增 表2 和 表3.
注意：这些片段使用嵌套引物“N_up-forward 和 N_down-reverse”或最外层引物“up-forward 和 down-reverse”进行扩增和拼接（图1B）。PCR 引物、试剂和扩增循环条件总结如下 表1, 表2，以及 表3分别。 - 将十分之一的PCR反应混合物（5 µL）上样至0.8%琼脂糖凝胶，通过比较扩增条带大小与预期条带大小，确认是否生成了正确的扩增产物图1C).
- 通过乙醇沉淀浓缩剩余的最终PCR产物，无需纯化。
- 向剩余的PCR混合物中加入55 µL超纯水，调节总体积至100 µL。加入十分之一体积的3 M醋酸钠（10 µL，pH 5.2），随后加入2.5倍体积的100%乙醇（250 µL）。混匀后于-80 °C冷冻30分钟。
- 15,000 × g 离心 20 分钟 g 在 4 °C 条件下，检查管底是否有沉淀，弃去上清液。用 1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀，于 15,000 × g 离心 5 分钟 g 4 °C下离心，弃上清液。将沉淀物风干约30分钟，加入10 µL超纯水溶解。
4. 感受态细胞制备与细胞转化
- 划线接种菌种 S. mutan将UA159接种于BHI琼脂平板上，在37 °C厌氧条件下培养过夜。
- 使用无菌牙签挑取单个菌落，接种于5 mL BHI肉汤中。将培养物置于 S. mutan37 °C 厌氧条件下过夜培养。
- 转移2 mL的 S. mutan将菌种接种于50 mL BHI肉汤中，于37 °C培养6–8 h，至600 nm处的光密度（OD600在厌氧条件下，0.2–0.4 的）
- 将细胞在2,000 × g条件下离心15分钟 g 在4 °C下弃去上清液，用40 mL预冷的冰水重悬细胞并洗涤两次，随后用40 mL 10%甘油洗涤两次。
注意：残留物质会影响后续的电穿孔。 - 用巴氏吸管小心吸去上清液，因为细胞沉淀在10%甘油中的黏附性降低。将细胞重悬于1 mL新鲜的10%甘油中，取50 µL悬液分装至每支1.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存，直至使用前。
- 将50 µL预冷的感受态细胞与5 µL上述第3节所述的敲除载体混合，加入电穿孔比色皿（电极间距为0.2 cm）中。采用 金黄色葡萄球菌 电穿孔仪采用模式（1.8 kV，600 Ω，10 µF，1次脉冲）进行电穿孔。
- 电穿孔后立即将细胞重悬于500 µL BHI肉汤中，并取50 µL菌液涂布于含壮观霉素的BHI琼脂平板。
注意：电穿孔后无需额外孵育。然而，电穿孔后孵育1–2小时可提高转化效率。 - 在37 °C厌氧条件下孵育平板2-6天。
注意： S. mutans ΔgtfB 如上所述构建。整个编码区的 gtfB 基因被红霉素抗性基因取代8 在 S. mutans ΔgtfB 每个 S. mutans 菌株在37 °C的厌氧条件下于BHI肉汤中培养。
5. 基因敲除的验证与保存
- 随机挑选菌落，将其接种至PCR反应体系中，按照表2和表3进行菌落PCR。PCR引物、试剂及扩增循环条件分别总结于表1、表2和表3中。
- 将PCR反应产物上样至1%琼脂糖凝胶，以确认spcr特异性DNA条带。
- 使用灭菌牙签挑取阳性菌落，将细胞转接至10 mL含链霉素的BHI液体培养基中，在37 °C厌氧条件下培养2天。
- 验证S. mutans ΔgtfC菌株的构建。
- 将细胞悬液等量分装。提取上述步骤（2.3 至 2.5.5）中所述细胞的基因组DNA，以其作为PCR模板，使用用于验证gtfC基因敲除的引物（表1），按照表2和表3进行PCR扩增。
注：PCR引物、试剂及扩增循环条件分别总结于表1、表2和表3中。 - 将PCR产物上样至2%琼脂糖凝胶，比较扩增条带大小与预期大小，以确认获得正确的扩增片段。
- 将剩余的细胞悬液在4 °C、2,000 × g条件下离心15分钟，将菌体沉淀重悬于5 mL PBS中。
- 在4 °C、2,000 × g条件下再次离心15分钟，将菌体沉淀重悬于1.5 mL含25%甘油的BHI培养基中，于-80 °C或-20 °C保存。
- 将细胞悬液等量分装。提取上述步骤（2.3 至 2.5.5）中所述细胞的基因组DNA，以其作为PCR模板，使用用于验证gtfC基因敲除的引物（表1），按照表2和表3进行PCR扩增。
6. 表型分析
- 将每种S. mutans菌株划线接种至BHI琼脂平板上，在37 °C厌氧条件下培养过夜。
- 使用无菌牙签挑取单个菌落，接种于2 mL BHI液体培养基中（可含或不含适当抗生素），在37 °C厌氧条件下过夜培养。
- 取20 µL过夜培养的菌液，接种至含有1%或5%蔗糖且不含抗生素的2 mL BHI液体培养基中，置于玻璃试管内；将试管倾斜放置，在37 °C厌氧条件下过夜培养。
- 将玻璃试管涡旋振荡10秒，倾去菌液，用蒸馏水清洗试管三次。加入1 mL 0.25%考马斯亮蓝（CBB）对管壁上的生物膜进行染色，染色1分钟后静置。
- 倾去染色液，用蒸馏水清洗试管三次，然后将试管干燥。
- 通过肉眼观察CBB染色后生物膜的颜色深度和覆盖范围，进行表型分析以评估其生物膜形成能力。
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结果
图2 表明每个产物的大小来自第1个st PCR产物在1%琼脂糖凝胶上的观察结果与预期大小约1 kb相符。 图3 显示第二次扩增产物的凝胶电泳分析结果nd PCR 图4 显示 S. mutans 经断裂构建体转化的菌落，以及菌落PCR产物的凝胶电泳分析结果。所有菌落的扩增子大小均与预期相符。 图5 显示用于验证的引物结合位点 gtfC PCR产物的断裂与凝胶电泳。通过使用引物扩增获得的PCR产物 gtfC-特异性引物组已在 S. mutans 野生型，但不在 S. mutans ΔgtfC，而使用以下方法获得的PCR产物 spcr
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讨论
在本实验方案中，用于扩增1的引物st PCR 必须设计为扩增基因组中目标区域上下游约 1 kb 的侧翼序列。这种较长的侧翼序列对于提高同源重组效率是必需的。
引物序列（上游-反向，下游-正向， spcr-正向，和 spcr-反向）在此方案中，根据中断构建体的插入位点自动确定。每个引物包含15个碱基，与2末端互补nd PCR模板的5'区域。较长的结合位点可实现更高效的敲除构建体的制备。建议在每条引物的5'区域包含至少10个互补碱基。9.
巢式引物（N_up-上游正向和N_up-上游反向）用于第2轮nd PCR，而非最外侧的引物（up-forward 和 down-reverse）。在第二次PCR中使用最外侧引物nd PCR 在某些情况下具有优势；可成功扩增断裂构建体 S. mutans Δg...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由日本促进科学协会资助［资助编号：16K15860（T.M.）和15K15777（N.H.）］。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Streptococus mutans | 实验室保存的菌种 | 野生型菌株（菌株UA159） | |
| 基因组DNA提取试剂盒 | Zymo Research | D6005 | |
| 珠磨破碎仪 | Taitec | GM-01 | |
| 合成基因 | Eurofins Genomics | 定制订购 | 链霉素和红霉素抗性基因 |
| PCR仪 | Astec | PC-708 | |
| PCR引物 | Eurofins Genomics | 定制订购 | 长度为35个碱基 |
| DNA聚合酶 | Takara | R045A | 高保真DNA聚合酶 |
| 凝胶回收试剂盒 | Nippon Genetics | FG-91202 | 从琼脂糖凝胶中提取DNA |
| 凝胶条带切割器 | Nippon Genetics | FG-830 | |
| 分光光度计 | Beckman Coulter | DU 800 | |
| 电穿孔仪 | Bio-rad | 1652100 | |
| 电穿孔比色皿 | Bio-rad | 1652086 | 0.2 cm间隙 |
| 厌氧袋 | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | 厌氧培养系统 |
| 脑心浸液肉汤 | Becton, Dickinson | 237500 | 细菌培养基 |
| 链霉素 | Wako | 195-11531 | 抗生素 |
| 红霉素 | Wako | 057-07151 | 抗生素 |
| 蔗糖 | Wako | 196-00015 | 用于生物膜形成 |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | 用于生物膜染色 |
参考文献
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重印与许可
