构建无基因克隆的基因中断型Streptococcus mutans菌株

摘要

我们介绍一种简便、快速且相对经济的基因敲除Streptococcus mutans菌株的构建方法；该技术可适用于多种物种基因敲除菌株的构建。

摘要

阐明特定基因功能的常用方法包括对野生型菌株和目标基因被破坏的菌株进行表型比较分析。含有合适抗生素抗性标记基因的基因破坏DNA构建体可用于在细菌中构建基因破坏菌株。然而，传统的构建方法需要基因克隆步骤，涉及复杂且耗时的操作流程。本文介绍一种相对简便、快速且成本较低的针对Streptococcus mutans的靶向基因破坏方法。该方法利用两步融合聚合酶链式反应（PCR）生成破坏构建体，并通过电穿孔实现遗传转化。该方法除PCR外无需任何酶促反应，同时在破坏构建体的设计上具有更高的灵活性。采用电穿孔技术有助于感受态细胞的制备，并提高转化效率。本方法可适用于多种物种基因破坏菌株的构建。

引言

基因功能分析通常涉及对野生型菌株与特定目标基因被破坏的突变菌株之间的表型比较。这种基因破坏技术已广泛应用于从细菌到哺乳动物等多个分类群的基因功能研究中。构建基因破坏菌株需要使用基因破坏载体；该脱氧核糖核酸（DNA）载体由抗生素抗性标记基因与目标基因上下游侧翼序列融合而成，并通过同源重组整合至基因组中。利用含有相应抗生素的选择性培养基可筛选获得基因破坏菌株。传统构建基因破坏菌株的方法包括多个复杂步骤，例如通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因、将基因连接至合适的质粒载体、限制性内切酶消化以及重新连接以插入抗生素抗性基因。该过程耗时较长，通常需要数天至数周，具体时间取决于各步骤的成败。此外，破坏载体的设计依赖于目标基因的限制性酶切位点。为解决上述问题，已有研究报道了基于PCR的DNA拼接方法^1,2，用于构建Dictyostelium discoideum³和Synechocystis sp. PCC6803⁴的基因破坏突变体。本研究建立了一种相对快速、简便且经济的方法，用于生成链球菌基因破坏菌株，该方法采用一种改良的基于PCR的两步融合PCR技术构建破坏载体，并通过电穿孔实现遗传转化。

两步融合PCR需要基因组DNA、抗生素抗性标记....

方案

1. 引物设计

1. 准备用于两步融合PCR及基因敲除验证的引物。
   注意： 表1 显示了本方案中使用的引物序列。 图1 展示了用于生成的两步融合PCR方法的示意图 S. mutans ΔgtfC.
   1. 设计引物以用壮观霉素抗性基因替换基因组中的目标区域（spc^r)⁷. 该方案将整个编码区替换为 gtfC 基因与 spc^r.
   2. 包含与上下游末端互补的15个碱基 spc^r 分别位于上行反向引物和下行正向引物的5'端区域。类似地，包含15个碱基，其与上游侧翼区域的下游末端互补。 gtfC 下游侧翼区域的上端 gtfC 在5'区域 spc^r-正向和 spc^r-反向引物，分别（图1A).
      注意：序列为上-反向、下-正向， spc^r-正向，以及 spc^r- 反向....

结果

图2 表明每个产物的大小来自第1个^st PCR产物在1%琼脂糖凝胶上的观察结果与预期大小约1 kb相符。 图3 显示第二次扩增产物的凝胶电泳分析结果^nd PCR 图4 显示 S. mutans 经断裂构建体转化的菌落，以及菌落PCR产物的凝胶电泳分析结果。所有菌落的扩增子大小均与预期相符。 图5 显示用于验证的引物结合位点 gtfC PCR产物的断裂与凝胶电泳。通过使用引物扩增获得的PCR产物 gtfC-特异性引物组已在 S. mutans 野生型，但不在 S. mutans ΔgtfC，而使用以下方法获得的PCR产物 spc^r

讨论

在本实验方案中，用于扩增1的引物^st PCR 必须设计为扩增基因组中目标区域上下游约 1 kb 的侧翼序列。这种较长的侧翼序列对于提高同源重组效率是必需的。

引物序列（上游-反向，下游-正向， spc^r-正向，和 spc^r-反向）在此方案中，根据中断构建体的插入位点自动确定。每个引物包含15个碱基，与2末端互补^nd PCR模板的5'区域。较长的结合位点可实现更高效的敲除构建体的制备。建议在每条引物的5'区域包含至少10个互补碱基。⁹.

巢式引物（N_up-上游正向和N_up-上游反向）用于第2轮^nd PCR，而非最外侧的引物（up-forward 和 down-reverse）。在第二次PCR中使用最外侧引物^nd PCR 在某些情况下具有优势；可成功扩增断裂构建体 S. mutans Δg.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Streptococus mutans	实验室保存的菌种		野生型菌株（菌株UA159）
基因组DNA提取试剂盒	Zymo Research	D6005
珠磨破碎仪	Taitec	GM-01
合成基因	Eurofins Genomics	定制订购	链霉素和红霉素抗性基因
PCR仪	Astec	PC-708
PCR引物	Eurofins Genomics	定制订购	长度为35个碱基
DNA聚合酶	Takara	R045A	高保真DNA聚合酶
凝胶回收试剂盒	Nippon Genetics	FG-91202	从琼脂糖凝胶中提取DNA
凝胶条带切割器	Nippon Genetics	FG-830
分光光度计	Beckman Coulter	DU 800
电穿孔仪	Bio-rad	1652100
电穿孔比色皿	Bio-rad	1652086	0.2 cm间隙
厌氧袋	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	厌氧培养系统
脑心浸液肉汤	Becton, Dickinson	237500	细菌培养基
链霉素	Wako	195-11531	抗生素
红霉素	Wako	057-07151	抗生素
蔗糖	Wako	196-00015	用于生物膜形成
CBB R-250	Wako	031-17922	用于生物膜染色