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方法文章

体外骨髓来源巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬作用

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DOI：

10.3791/56322

⸱

2017年12月30日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

本文内容

摘要

我们介绍了利用荧光标记的髓鞘碎片和细胞内脂滴染色来评估原代小鼠骨髓来源巨噬细胞吞噬能力的方法。

摘要

骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是一类成熟的白细胞，作为专业的吞噬细胞，在清除多种颗粒物质方面发挥关键的生理作用。正常情况下，BMDMs 被限制在中枢神经系统（CNS）之外，但在发生损伤后，它们可迅速浸润进入 CNS。一旦进入受损的中枢神经系统组织，BMDMs 即成为清除损伤来源的细胞碎片的主要细胞类型，包括大量富含脂质的髓鞘碎片。BMDM 浸润及其对髓鞘碎片的吞噬作用在中枢神经系统中引发的神经病理学影响复杂，目前尚未完全明确。本文所述的实验方案可用于直接 体外 在中枢神经系统损伤背景下对BMDMs的研究。本文涵盖了小鼠BMDM的分离与培养、髓鞘碎片的制备，以及评估BMDM吞噬髓鞘碎片能力的实验方法。这些技术可产生稳定且可量化的结果，无需大量专用设备或材料，同时可根据研究人员的具体需求进行灵活调整。

引言

骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是连接先天免疫系统与适应性免疫系统的重要环节。作为抗原呈递细胞（APCs），它们可通过抗原呈递和细胞因子释放与淋巴细胞进行通讯1,2,3。然而，作为专业的吞噬细胞，其主要功能是清除病原体、衰老细胞及细胞碎片1,4。在脊髓损伤（SCI）后，大量髓鞘碎片由负责中枢神经系统（CNS）轴突髓鞘形成的少突胶质细胞死亡而产生5。我们及其他研究团队已证实，髓鞘碎片的清除主要由浸润的BMDMs负责5,6,7。然而，在脊髓损伤部位，吞噬髓鞘碎片可能促使这些原本具有抗炎特性的细胞转变为促炎状态5,8,9。由于BMDMs在损伤脊髓中是神经炎症的关键介导者，因此成为重要的临床干预靶点。

为了帮助研究BMDMs在损伤脊髓中的作用，我们开发了一种 体外 用于直接研究BMDM对髓鞘碎片的反应。为提高生物学相关性，这些研究中使用了原代小鼠BMDM和新鲜分离的髓鞘碎片。因此，本文所述方法还包括原代小鼠BMDM的分离与培养，以及一种改良的蔗糖梯度法用于分离小鼠中枢神经系统来源的髓鞘碎片10,11,12髓鞘碎片可轻易用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行标记，以追踪其被骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的内化过程。CFSE 非常适用于此应用，因其无细胞毒性，且具有狭窄的荧光发射光谱，可与其他荧光探针进行多重标记。13,14吞噬作用发生后，髓鞘碎片中的脂质通过溶酶体转运，并以中性脂质形式包裹进入细胞内脂滴5为定量分析这种细胞内脂质蓄积，我们提供了一种经优化用于定量图像分析的油红O（ORO）染色方法。该染色方法简便，结果稳定且可重复，并可实现定量。15这些方法可在有限的专用设备条件下，促进对髓鞘碎片吞噬作用及脂质滞留的研究。

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方案

本文及第2节所述方法已获得佛罗里达州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循以下指南中规定的要求： 实验动物护理和使用的指南，8th 版本本方案中使用的所有动物在使用前均饲养于专用的实验动物设施中。无 在体 在动物处死前完成实验操作。动物数量根据实验需求确定，以平均细胞和髓鞘采集量为参考，以尽量减少使用数量。

注意：本实验方案描述了骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的制备（第1节）、荧光标记脑源性髓鞘碎片的制备（第2节）、分析髓鞘碎片吞噬作用的一般流程（第3节），以及分析髓鞘碎片脂质积累的一般流程（第4节）。试剂配制、细胞收获与操作、髓鞘收集与标记以及实验操作均应在层流生物安全柜中完成。

1. 原代骨髓来源巨噬细胞的制备

  1. 完全巨噬细胞培养基（CMCM）的制备
    注意：    从骨髓中生成巨噬细胞需要使用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。本制备方法利用L929小鼠成纤维细胞条件培养基作为M-CSF的来源。
    1. 将L929小鼠成纤维细胞在直径145 mm的培养皿中培养，每皿加入50 mL高糖（4500 mg/L L-葡萄糖） Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并补充5%新生牛血清（NCS）和青霉素/链霉素，连续培养7天以制备条件培养基。
    2. 将培养后的培养基收集至50 mL锥形离心管中，在4 °C条件下以3500 × g离心30分钟。
    3. 将上清液通过0.2 µm注射器滤器过滤至新的50 mL锥形离心管中。条件培养基可在-80 °C保存长达6个月。
    4. 向高糖DMEM中加入5%（v/v）NCS、15%（v/v）L929小鼠成纤维细胞条件DMEM以及1%青霉素/链霉素。该培养基可在4 °C保存2–3个月。使用前需预热至37 °C。
  2. 原代骨髓细胞的收集与巨噬细胞诱导
    注意：采用本方案，一只小鼠可获得约2000万个骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。
    1. 按照标准CO2窒息程序对8–10周龄小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
    2. 用70%（v/v）乙醇: H2O对动物体表进行消毒，充分浸润毛发。
    3. 在腹部切开一个小口，小心向后剥离皮肤以暴露皮下组织。注意避免刺破腹膜腔。
    4. 从髋部至踝部完整取下双侧后肢。将所获组织置于含有5–10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）并补充1%青霉素/链霉素的100 mm培养皿中。
      注意：处理多只动物时，应将培养皿置于冰上以减少组织降解。
    5. 使用解剖刀去除骨骼上的肌肉和结缔组织。仅保留股骨和胫骨用于细胞收集，腓骨可弃去。
    6. 用解剖刀切除骨两端的小段，以暴露骨髓腔。
    7. 使用25G针头，以CMCM冲洗骨髓腔，将冲洗液收集至50 mL锥形离心管中。当骨骼呈现白色时，表明冲洗充分。
    8. 收集完成后，用18G针头剧烈吹打细胞悬液30–90秒，以获得单细胞悬液。
      注意：此时可选择性进行红细胞（RBC）裂解步骤。最近有研究提示，细胞内铁含量可能影响髓鞘碎片对巨噬细胞极化的作用16。有关是否加入红细胞裂解步骤的详细信息，请参阅Trouplin et al.17。
    9. 将细胞悬液通过70 µm无菌细胞筛过滤至新的50 mL锥形离心管中。
    10. 将收集的细胞均匀接种至含有15–20 mL CMCM的145 mm细胞培养皿中。每只牺牲的小鼠约使用三个培养皿。将培养物置于37 °C、5% CO2条件下培养。
    11. 72小时后，用无菌PBS洗涤培养皿一次以去除未贴壁细胞，然后加入15–20 mL新鲜CMCM。继续在37 °C、5% CO2条件下培养4天。经过总共7天的培养后，最初分离的造血骨髓细胞将发育为成熟的BMDMs（图1）。

2. 荧光标记的脑源性髓鞘碎片的制备

注意：所有试剂可在 4 °C 下保存长达 1 个月。

  1. 髓鞘碎片收集试剂的制备
    1. 配制 Tris·Cl 缓冲液。
      1. 向800 mL去离子蒸馏水中加入2O (ddiH2O) 加入 20 mL 1 M Tris·Cl（pH 7.45，终浓度 20 mM）和 20 mL 100 mM Na2EDTA（终浓度 2 mM）。
      2. 调节pH至7.45，用ddiH₂O定容至1000 mL2O. 使用0.2 µm滤器过滤溶液。
    2. 配制1 M蔗糖溶液。
      1. 向100 mL Tris·Cl缓冲液中加入68.46 g蔗糖，用Tris·Cl缓冲液定容至200 mL。使用0.2 µm滤器过滤溶液。
    3. 通过将1 M蔗糖溶液与Tris·Cl缓冲液以0.83:0.16（体积比）稀释，配制200 mL的0.32 M蔗糖溶液。
    4. 通过将1 M蔗糖溶液与Tris·Cl缓冲液按0.83:0.16（体积比）混合，稀释配制150 mL的0.83 M蔗糖溶液。
  2. 脑源性粗制髓鞘碎片的收集
    注意： 此处所述收集方法用于分离粗制髓鞘碎片。
    1. 使用标准的 CO₂ 安乐死法处死 10–12 只 8–10 周龄的小鼠2 窒息处死指南，随后进行颈椎脱位。
    2. 解剖脑组织，将其置于含有10 mL 0.32 M蔗糖溶液的100 mm培养皿中。将培养皿置于冰上保存。
    3. 使用无菌手术剪将脑组织切成约5 mm的碎片3 大小。
    4. 将组织转移至50 mL锥形离心管中，并加入约30 mL的0.32 M蔗糖溶液。
    5. 使用无菌手持式旋转匀浆器匀浆，直至形成均匀的溶液。
    6. 用0.32 M蔗糖溶液将匀浆后的脑组织稀释至终体积90 mL。
    7. 向6个38.5 mL的薄壁聚丙烯超速离心管中，各加入20 mL 0.83 M蔗糖溶液。
    8. 将匀浆后的脑组织溶液轻轻加至0.83 M蔗糖溶液的上层，注意避免混合两层溶液。
    9. 用0.32 M蔗糖溶液平衡各离心管。
    10. 在4°C条件下，使用适当的预冷超速离心转子，以100,000 × g离心45分钟。将转子的加速度和减速度设置为最小值，以减少髓鞘碎片的损失。
    11. 从两种蔗糖密度的界面处收集髓鞘碎片。
      注意杂质应呈现为试管中心区域的白色条带。
    12. 将粗制髓鞘碎片合并至一个50 mL锥形离心管中，并用Tris·Cl缓冲液调节体积至约35 mL。
    13. 使用无菌手持式旋转匀浆器将粗制髓鞘碎片匀浆处理30-60秒。
    14. 将悬浮液均匀分装至6支洁净的超速离心管中，并用适量的Tris·Cl缓冲液平衡。
    15. 在4°C条件下，使用适当的预冷超速离心转子，以100,000 × g离心45分钟。将转子的加速度和减速度均设置为最大值。
    16. 此时可见白色固体沉淀，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮于10–15 mL Tris·Cl缓冲溶液中。
    17. 将悬液均匀分装至2支洁净的超速离心管中，并用适量的Tris·Cl缓冲液平衡重量。
    18. 再次使用预冷的超速离心机转子，在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 45 分钟。将转子的加速度和减速度设置为最大值。
    19. 弃去上清液，将沉淀重悬于 5–6 mL 无菌 PBS 中，并将悬液分装至适当数量的预称重 1.5 mL 微量离心管中。
    20. 在 4 °C 条件下，以 22,000 x g 离心 10 分钟。
    21. 弃去上清液，称量髓鞘碎片沉淀的重量。
    22. 将沉淀重悬于PBS中，调整终浓度为100 mg/mL。
      注意10至12个脑组织足以制备10–15 mL浓度为100 mg/mL的髓鞘碎片。髓鞘碎片可在-80 °C保存6个月。
  3. 髓鞘碎片荧光标记
    1. 使用前立即配制50 µM的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）溶液。
      1. 使用无菌 PBS 将用 100% 二甲基亚砜（DMSO）配制的 5 mM CFSE 储存液稀释至终工作浓度为 50 µM。
      2. 使用 0.2 µm 注射器滤器过滤溶液。
    2. 解冻所需量的100 mg/mL髓鞘碎片，并用无菌29G针头重新悬浮。
      注意冷冻髓鞘碎片会导致其从溶液中析出，使用前需重新悬浮。
    3. 将髓鞘碎片转移至预称重的1.5 mL微量离心管中。
    4. 在 4°C 条件下以 14,800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。
    5. 将髓鞘碎片重悬于 CFSE 溶液中，每 100 µL 髓鞘碎片沉淀物加入 200 µL CFSE 溶液。
    6. 室温避光孵育30分钟。
    7. 在 4 °C 条件下，以 14,800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。
    8. 将沉淀重悬于600-800 µL洗涤缓冲液（PBS中含100 mM甘氨酸，0.2 µm滤膜过滤除菌）中。
    9. 在 4 °C 条件下，以 14,800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。
    10. 重复步骤 2.3.8–2.3.9 两次。
    11. 最后一次洗涤后，称量髓鞘碎片沉淀的重量，并用无菌 PBS 重悬至 100 mg/mL。
      注意：标记的髓鞘碎片可在 -80 °C 保存长达 6 个月。

3. 髓鞘碎片吞噬实验

注意： 以下是观察荧光标记髓鞘碎片吞噬作用的基本方法。其他处理和实验条件的添加需由研究人员自行优化。

  1. 处理板的制备
    1. 对于每个145 mm培养皿，使用5–6 mL含10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS，pH 7.4）将成熟的BMDM细胞收集至15 mL圆锥形离心管中。
      注意：不要使用胰蛋白酶，因为它可能会改变细胞的活化状态18。
    2. 向每管收集的细胞中加入等体积预温的CMCM培养基。
    3. 在20 °C下以180 × g离心8分钟，弃去上清液。
    4. 用CMCM重悬细胞并计数。
    5. 向24孔细胞培养板的每孔中加入1×105个细胞，体积为1 mL CMCM。
    6. 在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
  2. 髓鞘碎片处理与分析
    1. 向每孔加入10 µL 100 mg/mL CFSE标记的髓鞘碎片（终浓度为1 mg/mL）。
    2. 在37 °C、5% CO2条件下孵育1–3小时。
    3. 用无菌PBS洗涤培养板3次，以去除未被吞噬的髓鞘碎片。
    4. 向每孔加入400 µL 4%多聚甲醛溶液，在室温下孵育30分钟。
    5. 用无菌PBS洗涤培养板2次。
    6. 向每孔加入400 µL Hoechst 33258溶液，在室温下避光孵育5分钟。
    7. 用无菌PBS洗涤培养板2次。
    8. 向每孔加入200 µL含Tris缓冲液的Fluoro-gel，以减少光漂白。
    9. 使用具备倒置荧光功能的显微镜观察细胞。
      注意：CFSE的激发波长和发射波长分别为494 nm和521 nm。
    10. 通过将CFSE阳性细胞数除以细胞核数量，计算相对髓鞘碎片摄取量。
    11. 成像前，可在4 °C避光条件下将培养板保存最多7天。

4. 通过油红O染色法定量细胞内脂质

注意： 以下是观察细胞内髓鞘碎片来源脂质的基本方法。由于光谱重叠，不建议使用CFSE标记的髓鞘碎片对油红O染色进行荧光定量。其他处理方法和实验条件的添加需由研究者自行优化。

  1. 染色溶液的配制
    1. 配制0.5%油红O（ORO）染色液。
      1. 在搅拌条件下，缓慢将100 mL 100%丙二醇（1,2-丙二醇）加入0.5 g ORO（1-([4-(二甲苯基偶氮)苯基]偶氮)-2-萘酚）中。
      2. 在95 °C下加热溶液15分钟，或加热至所有大颗粒完全溶解。
        注意：加热温度不得超过 100 °C。
      3. 趁热将溶液通过滤纸过滤至新容器中。
      4. 让溶液在室温下静置过夜冷却。溶液可在室温下保存长达1年。
    2. 配制85%的丙二醇溶液。
      1. 将85 mL的100%丙二醇加入15 mL的ddiH₂O中2O. 搅拌至混合均匀。溶液可在室温下保存长达1年。
  2. 处理板的制备
    1. 按照第3节所述方法准备24孔板。
    2. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 24小时。
  3. 髓鞘碎片处理
    1. 每孔加入10 µL 100 mg/mL的髓鞘碎片（终浓度为1 mg/mL）。
    2. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1–3 小时2.
    3. 用无菌 PBS 洗涤平板 3 次，以去除未消化的髓鞘碎片。
      注意：此时，培养板可立即进行固定，或加入新鲜的CMCM，将细胞继续孵育以获取其他时间点的数据。
    4. 每孔加入 400 µL 4% 多聚甲醛，室温孵育 30 分钟。
    5. 用无菌 PBS 洗涤平板 2 次，然后进行染色。
  4. ORO染色与分析
    1. 用去离子水洗涤固定后的培养板3次2O.
    2. 向每个孔中加入 400 µL 100% 丙二醇，在室温下孵育 5 分钟。
      注意：这将减少ddiH的残留2O.
    3. 吸出丙二醇，向每孔加入 400 µL ORO 溶液。
    4. 在 60 °C 下孵育 8 分钟。
    5. 吸除 ORO 溶液。然后每孔加入 400 µL 85% 丙二醇，在室温下孵育 5 分钟。
    6. 用ddiH2O洗涤平板3次2O.
    7. 每孔加入 400 µL Hoechst 33258 溶液，在室温避光孵育 5 分钟。
    8. 用无菌 PBS 洗涤平板 2 次。
    9. 每孔加入 200 µL 含 Tris 缓冲液的 Fluoro-gel。
    10. 使用倒置荧光显微镜对细胞进行成像。ORO 可使用标准的 Texas Red 或 DsRed 滤光片组进行成像。
    11. 通过测定每张图像视野中油红O阳性区域面积，并将其除以细胞核数量，来量化相对脂质滞留量。
    12. 将培养板置于4 °C避光保存7天。

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结果

用CFSE标记的髓鞘碎片处理BMDM应能观察到明显的内化现象（图2）。虽然3小时的相互作用时间已足以使BMDM吞噬足够量的髓鞘碎片，从而实现稳定的下游检测，但在仅1小时的相互作用后即可观察到细胞内积累。然而，洗涤后仍可能有部分髓鞘碎片残留在细胞表面，这可能是由于洗涤不充分，或在吞噬早期阶段颗粒尚未完全内化所致。

尽管BMDM能够快速内吞髓鞘碎片，但在形成油红O可染脂滴之前，需要经过溶酶体加工处理。为证明这一点，将BMDM与髓鞘碎片共孵育90分钟，随后洗涤，并在固定和染色前继续培养不同时间（图3）。图4显示，从处理开始到中性脂质出现之间存在延迟。还应注意，脂质在培养过程中并不稳定。BMDM在脂滴形成后不久即开始代谢所积累的脂质。因此，我们建议在洗去未吞噬的髓鞘碎片后，至固定前的等待时间不超过24小时。

ORO 染色面积的定量分析可反映 BMDM 中髓鞘...

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讨论

本文所述实验步骤同时使用新鲜分离的粗制中枢神经系统髓鞘碎片和原代骨髓来源的巨噬细胞。为了减少动物使用量，建议在处死小鼠时同时采集脑组织和骨髓细胞。两名研究人员可协作同时制备两种材料。 alternatively，脑组织可在含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存于 -80 °C，以备后续进行髓鞘碎片的分离。根据我们的经验，在此条件下保存长达1个月，脑组织产生髓鞘碎片的能力不会出现明显下降。

CFSE 被用于标记髓鞘碎片，因其使用简便且荧光强度高。该染料在细胞内酯酶切除分子上的乙酸基团之前保持淬灭状态14。游离的琥珀酰亚胺酯基团随后可与伯胺发生反应，从而共价结合到细胞蛋白上14。虽然 CFSE 可通过标准的绿色荧光通道激发，但目前已有多种具有不同光谱特性的衍生物商业化供应。因此，可以设计一种类似的吞噬实验，使用多种荧光染料进行标记。还应注意，由于该染料可轻易穿过质膜，因此也可用于以类似标记髓鞘碎片的方式标记凋亡细胞19。此外，尽管本方法依赖于标...

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致谢

作者谨此感谢佛罗里达州立大学医学院媒体专家 Glenn Sanger-Hodgson 在视频制作、剪辑和配音方面所做的全部工作。

本工作由美国国立卫生研究院（R01GM100474 和 R01GM072611）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMGE Healthcare Life SciencesSH30243.01高糖，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠
青霉素-链霉素溶液Corning30-002-CI100倍浓缩液
新生小牛血清（NCS）Rocky Mountain BiologicsNBS-BBT-5XM源自美国
NCTC clone 929 [L细胞，L-929，Strain L的衍生株] ATCCCCL-1用于制备条件培养基的L929细胞系
24孔细胞培养板VWR10062-896 
细胞培养皿Greiner Bio-One639960聚苯乙烯，145/20 mm
CFSE细胞增殖检测试剂盒Thermo FisherC34570提供用于重悬的DMSO
含Tris缓冲液的Fluoro-gel Electron Microscopy Sciences17985-11
油红OSigma AldrichO0625
仪器
材料公司货号备注
超速离心管Beckman Coulter326823薄壁，聚丙烯，38.5 mL，25 × 89 mm
SW 32 Ti超速离心转子Beckman Coulter369650SW 32 Ti转子，摆桶式，钛合金
手持式旋转匀浆器Fisher Science08-451-71

参考文献

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
  3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
  4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
  5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
  6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
  7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).
  8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380(2010).
  9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
  10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
  11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
  13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
  14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
  16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
  17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
  18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
  19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48(2016).
  20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).
  21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
  22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
  23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
  24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
  25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

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体外骨髓来源巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬作用
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