体外骨髓源性巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬

骨髓源性巨噬细胞 (BMDMs) 是先天和适应性免疫系统之间的重要联系。作为抗原呈递细胞 (apc), 他们可以通过抗原呈递和细胞因子释放^1,2,3与淋巴细胞进行通信。然而, 作为专业吞噬, 他们的主要功能是清除病原体, 衰老细胞和细胞碎片^1,4。继脊髓损伤 (SCI), 大量髓鞘碎片是由死亡的突, 细胞类型负责中枢神经系统轴突鞘⁵。我们和其他人已经表明, 清除髓鞘碎片主要是渗透 BMDMs 的责任^5,6,7。然而, 在脊髓损伤部位吞没髓鞘碎片被建议将这些正常的抗炎细胞转变为炎状态^5,8,9。BMDMs 是脊髓损伤中神经炎症的重要介质, 是临床的主要靶点。

为了帮助研究 BMDMs 在损伤脊髓中的影响, 我们开发了一个体外模型, 直接探讨 BMDMs 对髓鞘碎片的反应。为了提高生物学相关性, 在这些调查中使用了小鼠 BMDMs 和新近分离的髓鞘碎片。因此, 这里介绍的方法也详述了原小鼠 BMDMs 的分离和培养, 以及用于分离鼠中枢神经系统衍生髓鞘碎片的改良蔗糖梯度技术^10,11,12。髓鞘碎片可以很容易地标记为荧光染料, 羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE), 以跟踪其内部化的 BMDMs. CFSE 是非常适合这个应用, 因为它是 non-cytotoxic, 其狭窄的荧光光谱允许多路传输与其他荧光探针^13,14。继吞噬后, 髓鞘碎片脂通过溶酶体转运, 并以中性脂质包装成细胞内脂滴⁵。为了量化这种细胞内脂质的积累, 我们提出了一个油红 O (破产) 染色方法优化定量图像分析。这个简单的染色方法产生可靠的重现性结果和量化的¹⁵。这些方法有助于研究的髓鞘碎片吞噬和脂质保留与有限的专用设备。

在这里和2节中描述的方法已得到佛罗里达州立大学动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准, 并遵循《实验室动物护理和使用指南》中规定的指南, 8^th版.在这个协议中使用的所有动物都是在一个专门的实验室动物设施的房子, 直到使用。没有在体内试验是在牺牲之前进行的。动物数量是根据实验需要使用平均细胞和髓鞘收集作为指导, 以尽量减少使用。

注意:该协议描述了生成骨髓巨噬细胞 (BMDMs) (1 节), 荧光标记脑源性髓鞘碎片的制备 (2 节), 分析髓鞘碎片吞噬的一般程序 (第3节) 和髓鞘堆积物脂质积累分析的一般程序 (4 节)。在层流生物安全柜中, 应完成试剂制备、细胞采集和操作、髓鞘的收集和标记、化验性能的测定。

1. 原发骨髓巨噬细胞的生成

1. 全巨噬细胞培养基的制备 (CMCM)
   注:骨髓巨噬细胞的生成需要使用巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)。本制剂利用 L929 小鼠成纤维细胞条件培养基作为 M 型脑脊液的来源。
   1. 用50毫升高葡萄糖 (4500 毫克/l-葡萄糖) 培养细胞在145毫米菜肴中生成 L929 小鼠成纤维细胞条件培养基 (DMEM) Dulbecco 的改良鹰培养基补充5% 新出生的小牛血清和青霉素/链霉素7天。
   2. 收集培养基从文化到50毫升圆锥离心管和离心机30分钟在 3500 x g, 4 ° c。
   3. 过滤器清通过0.2 µm 注射器过滤器进入一个新的50毫升圆锥离心管。被适应的媒介可以被存放在-80 ° c 为6月。
   4. 对高糖 DMEM, 增加5% 卷/卷的非华语, 15% 卷/卷 L929 小鼠成纤维细胞条件 DMEM, 1% 青霉素/链霉素。介质可储存在4° c 2-3 月。使用前要预热到37° c。
2. 原发性骨髓细胞的采集与巨噬细胞诱导
   注意:使用这个协议一只老鼠将产生大约2000万骨髓来源的巨噬细胞 (BMDMs)。
   1. 安乐使用标准 CO₂窒息指南的8-10 周老鼠的期望数量, 其次是颈椎脱位。
   2. 使用 70% (卷/卷) 乙醇对动物进行消毒: H₂O, 使毛皮饱和。
   3. 在腹部切开一个小开口, 并小心地拉回皮肤, 露出底层的组织。注意不要穿刺腹膜腔。
   4. 从臀部开始, 在脚踝处切除两条后腿。将所收集的组织放入100毫米的培养皿中, 其中含有5-10 毫升无菌磷酸缓冲盐水 (PBS), 辅以1% 青霉素/链霉素。
      注意:当处理几个动物时, 一定要保持在冰上的菜肴, 以限制组织退化。
   5. 用手术刀从骨头上取出肌肉和结缔组织。只有股骨和胫骨用于细胞收集, 腓骨可以被丢弃。
   6. 通过用手术刀将每个末端的小部分修剪, 使收集到的骨骼露出骨髓腔。
   7. 使用25g 针, 冲洗骨髓腔与 CMCM 成一个50毫升圆锥离心管。一旦足够冲洗, 骨骼就会呈白色。
   8. 一旦收集完成, 煽动物与18g 针30-90 秒, 产生一个单一的细胞悬浮。
      注意:可选红细胞 (红细胞) 裂解步骤可在这一点上进行。最近有人建议, 细胞内铁含量可能影响髓鞘碎片对巨噬细胞极化的影响¹⁶。有关包含红细胞裂解步骤的信息, 请参阅 Trouplin et al。¹⁷。
   9. 将悬浮液通过70µm 无菌细胞过滤器滤入新的50毫升锥形离心管中。
   10. 种子收集的细胞均匀地成145毫米细胞培养皿包含15-20 毫升 CMCM。每只老鼠使用大约三培养皿。孵育文化在37° c, 5% CO₂。
   11. 经过72小时洗板后用无菌 PBS 去除换药细胞, 然后添加15-20mL 新鲜 CMCM。孵育文化为另外4天在37° c, 5% CO₂。经过7天的总培养, 最初孤立的造血骨髓细胞将是成熟的 BMDMs (图 1)。

2. 荧光标记脑源性髓鞘碎片的生成

注意:所有试剂可贮存在4° c, 可达1月。

1. 髓鞘碎片收集试剂的制备
   1. 准备 Tris·Cl 缓冲液。
      1. 到800mL 蒸馏去离子 H₂o (ddiH₂o) 添加 20 mL 1 米 Tris·Cl, pH 值 7.45 (20 mm 最终浓度) 和20毫升100毫米 Na₂EDTA (2 毫米最终浓度)。
      2. 调整 pH 值至7.45。通过0.2 µm 过滤单元, 通过 ddiH₂o. 过滤器解决方案将音量调整为1000毫升。
   2. 准备1米蔗糖溶液。
      1. 到100毫升的 Tris·Cl 缓冲液, 加68.46 克蔗糖。用 Tris·调节音量至200毫升Cl 缓冲液。过滤器解决方案通过0.2 µm 过滤装置。
   3. 用 Tris·稀释 1 m 溶液, 制备200毫升的0.32 米蔗糖溶液Cl 缓冲器解决方案 0.83:0. 16 (卷/卷)。
   4. 用 Tris·稀释 1 m 溶液, 制备150毫升的0.83 米蔗糖溶液Cl 缓冲器解决方案 0.83:0. 16 (卷/卷)。
2. 收集脑衍生的粗髓鞘碎片
   注意:这里描述的收集方法是为了隔离粗髓鞘碎片。
   1. 安乐10-12 只小鼠8-10 周龄使用标准 CO₂窒息指南后, 颈椎脱位。
   2. 解剖的大脑和放置在一个100毫米的菜, 其中含有10毫升的0.32 米蔗糖溶液。

3. 髓鞘碎片吞噬试验

注意:下面是观察荧光标记髓鞘碎片吞噬功能的基本方法。其他的治疗和实验条件的增加将需要由调查员优化。

1. 处理板的制备
   1. 对于每145毫米板, 收集成熟的 BMDMs 成一个15毫升圆锥离心管使用5-6 毫升的10毫米乙酸酸 (EDTA) 在 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dPBS) (pH 7.4)。
      注意:不要使用胰蛋白酶, 因为它可能会改变细胞的活化状态¹⁸。
   2. 在收集的细胞中加入等量的 5ml CMCM。
   3. 离心机在 180 x g 为8分钟在20° c。丢弃上清液。
   4. 重新挂起 CMCM 中的单元格并进行计数。
   5. 对24井细胞培养板的每一个井, 在1毫升的 CMCM 中添加 1x10⁵细胞。
   6. 孵育在37° c, 5% CO₂为 24 h。
2. 髓鞘碎片的处理与分析
   1. 添加10µL 100 毫克/毫升 CFSE 标记髓鞘碎片每井 (1 毫克/毫升最终浓度)。
   2. 孵育1-3 小时, 在37° c, 5% CO₂。
   3. 洗盘子3次, 用无菌 PBS 去除 non-engulfed 髓鞘碎片。
   4. 每井加400µL 4% 甲醛。在 RT 处孵育30分钟。
   5. 洗涤板2次, 无菌 PBS。
   6. 每井加400µL 赫斯特33258溶液。孵育5分钟在 RT 保护免受光。
   7. 用无菌 PBS 冲洗盘子2次。
   8. 添加200µL 的氟凝胶与三缓冲器, 以减少漂白。
   9. 使用倒置的 epi 荧光显微镜的图像细胞。
      注意:CFSE 的激发和发射波长分别为 494 nm 和 521 nm。
   10. 将 CFSE 阳性细胞数除以细胞核数, 以确定相对髓鞘碎片的摄取量。
   11. 在成像之前, 保持板长达7天, 在4° c 保护免受光。

4. 通过油红 O 染色定量测定胞内脂质

注意:下面是观察细胞内髓鞘-碎片衍生脂质的基本方法。由于光谱重叠, 不推荐使用 CFSE 标记的髓鞘碎片进行荧光定量。其他的治疗和实验条件的增加将需要由调查员优化。

1. 染色液的制备
   1. 准备0.5% 油红 O (破产) 染色液。
      1. 在搅拌时, 缓慢地将100毫升100% 丙二醇 (12-丙醇) 添加到0.5 克 (1-([4-Xylylazo) 二甲苯]-2-萘酚)。
      2. 热溶液在95° c 为 15 min 或直到所有大微粒被溶化。
         注意: 不要加热超过100° c。
      3. 过滤器解决方案通过一块滤纸, 而仍然温暖到一个新的容器。
      4. 允许解决方案在 rt 中隔夜冷却. 解决方案可在 rt 中存储长达1年。
   2. 准备85% 丙二醇溶液。
      1. 加入85毫升的100% 丙二醇到15毫升的 ddiH₂o 搅拌至混合。解决方案可在 RT 中存储多达1年。
2. 处理板的制备
   1. 按照3节中概述的方法准备一个24井板。
   2. 孵育在37° c, 5% CO₂为 24 h。
3. 髓鞘碎片治疗
   1. 每井添加10µL 100 毫克/毫升髓鞘碎片 (1 毫克/毫升最终浓度)。
   2. 孵育1-3 小时, 在37° c, 5% CO₂。
   3. 洗盘子3次, 用无菌 PBS 去除 non-digested 髓鞘碎片。
      注意: 在这一点上, 盘子可以立即进行固定或新鲜的 CMCM 可以添加, 细胞返回到孵化额外的时间点。
   4. 每井加400µL 4% 甲醛。在 RT 处孵育30分钟。
   5. 洗涤板2次, 无菌 PBS 然后增益染色。
4. 破产法染色及分析
   1. 用 ddiH₂O 清洗固定板3次。
   2. 每井加400µL 100% 丙二醇, 孵育5分钟。
      注意: 这将减少 ddiH₂O 的结转。
   3. 吸入丙二醇, 并在每口井中加入400µL 的破产解决方案。
   4. 孵育8分钟, 在60° c。
   5. 吸入破产解决方案。然后, 每井加400µL 85% 丙二醇, 在 RT 处孵育 5 minumintes。
   6. 洗涤板3次 ddiH₂O。
   7. 每井加400µL 赫斯特33258溶液。在 RT 中孵育5分钟, 免受光照。
   8. 用无菌 PBS 冲洗盘子2次。
   9. 添加200µL 的氟凝胶与三缓冲每井。
   10. 使用倒置的 epi 荧光显微镜的图像细胞。破产人可以使用标准的德州红或 DsRed 过滤器集成像。
   11. 通过确定每个图像场中的破产人阳性面积并将其除以细胞核数来量化相对脂质潴留。
   12. 在4° c 保护免受光照的7天内保持板材。

BMDMs 的 CFSE 标记髓鞘碎片的治疗应产生清晰的内部化 (图 2)。虽然3小时的互动时间是足够的 BMDMs, 以吞噬足够的补充髓鞘碎片, 为强健的下游检测, 细胞内积累可以观察到, 只需1小时的互动。然而, 一些髓鞘碎片可能仍然存在于细胞表面洗涤后。这可能是由于洗涤不足, 或在吞噬的早期阶段没有完全内化的微粒。

虽然 BMDMs 可以迅速地将髓鞘碎片化, 但在破产可脂滴形成之前需要溶酶体的处理。为了证明, BMDMs 在进行固定和染色之前, 用髓鞘碎片孵育了90分钟, 洗涤和培养了更多的时间 (图 3)。图 4显示了治疗起始和中性脂质出现之间的延迟。还应注意到, 在培养期间, 脂质保持不稳定。BMDMs 将开始代谢积累的脂质不久后滴形成。因此, 我们建议在洗掉 non-engulfed 髓鞘碎片和固定之间不超过24小时。

BMDMs 的定量化表明了该区髓鞘脂代谢率 (图 5)。在90分钟的互动期之后, 细胞被重新 CMCM。在新鲜培养基的早期追逐期间, BMDMs 代谢的吞噬髓鞘碎片脂质成分转化为中性的可血脂。在交互作用后的几个小时内, 破产人积极区域的稳定增长是典型的。然而, 24 小时后, BMDMs 将有 effluxed 或代谢相当一部分的细胞内脂质。

图 1: 具有代表性的 BMDM 区域性.最初观察到的黏附细胞很少。在3天, 任何换药单元都将被移除。7天, 成熟的骨髓衍生巨噬细胞被观察。缩放 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: BMDM 髓鞘碎片吞噬试验的代表性图像.1毫克/毫升 CFSE 标记髓鞘碎片, 在洗涤和固定4% 粉煤灰之前, 细胞被治疗1小时。内化髓鞘碎片可以使用标准的 GFP 过滤装置在 epi 荧光显微镜下进行可视化。缩放 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 油红色图 (破产) 试验设计.BMDM 治疗1毫克/毫升髓鞘碎片 (1:100 稀释) 90 分钟, 其次是洗涤和文化在新鲜的媒体前固定。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: BMDM 在髓鞘碎片吞噬后的染色.在被指定的时点4% 粉煤灰固定后, BMDMs 与破产人和赫斯特33258染色。显示每个时点的代表性图像。缩放 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 对破产人染色的定量图像分析.为了定量化破产人的染色, 3 口井在20X 成像, 每井5幅图像。所有的图像采集设置都是相同的。误差线 = SEM (n=3)。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有披露。