体外骨髓来源巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬作用

摘要

我们介绍了利用荧光标记的髓鞘碎片和细胞内脂滴染色来评估原代小鼠骨髓来源巨噬细胞吞噬能力的方法。

摘要

骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是一类成熟的白细胞，作为专业的吞噬细胞，在清除多种颗粒物质方面发挥关键的生理作用。正常情况下，BMDMs 被限制在中枢神经系统（CNS）之外，但在发生损伤后，它们可迅速浸润进入 CNS。一旦进入受损的中枢神经系统组织，BMDMs 即成为清除损伤来源的细胞碎片的主要细胞类型，包括大量富含脂质的髓鞘碎片。BMDM 浸润及其对髓鞘碎片的吞噬作用在中枢神经系统中引发的神经病理学影响复杂，目前尚未完全明确。本文所述的实验方案可用于直接 体外 在中枢神经系统损伤背景下对BMDMs的研究。本文涵盖了小鼠BMDM的分离与培养、髓鞘碎片的制备，以及评估BMDM吞噬髓鞘碎片能力的实验方法。这些技术可产生稳定且可量化的结果，无需大量专用设备或材料，同时可根据研究人员的具体需求进行灵活调整。

引言

骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是连接先天免疫系统与适应性免疫系统的重要环节。作为抗原呈递细胞（APCs），它们可通过抗原呈递和细胞因子释放与淋巴细胞进行通讯^1,2,3。然而，作为专业的吞噬细胞，其主要功能是清除病原体、衰老细胞及细胞碎片^1,4。在脊髓损伤（SCI）后，大量髓鞘碎片由负责中枢神经系统（CNS）轴突髓鞘形成的少突胶质细胞死亡而产生⁵。我们及其他研究团队已证实，髓鞘碎片的清除主要由浸润的BMDMs负责^5,6,7。然而，在脊髓损伤部位，吞噬髓鞘碎片可能促使这些原本具有抗炎特性的细胞转变为促炎状态^5,8,9。由于BMDMs在损伤脊髓中是神经炎症的关键介导者，因此成为重要的临床干预靶点。

方案

本文及第2节所述方法已获得佛罗里达州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循以下指南中规定的要求： 实验动物护理和使用的指南，8^th 版本本方案中使用的所有动物在使用前均饲养于专用的实验动物设施中。无 在体 在动物处死前完成实验操作。动物数量根据实验需求确定，以平均细胞和髓鞘采集量为参考，以尽量减少使用数量。

注意：本实验方案描述了骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的制备（第1节）、荧光标记脑源性髓鞘碎片的制备（第2节）、分析髓鞘碎片吞噬作用的一般流程（第3节），以及分析髓鞘碎片脂质积累的一般流程（第4节）。试剂配制、细胞收获与操作、髓鞘收集与标记以及实验操作均应在层流生物安全柜中完成。

1. 原代骨髓来源巨噬细胞的制备

1. 完全巨噬细胞培养基（CMCM）的制备
   注意：从骨髓中生成巨噬细胞需要使用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。本制备方法利用L929小鼠成纤维细胞条件培养基作为M-CSF的来源。
   1. 将L929小鼠成纤维细胞在直径145 mm的培养皿中培养，每皿加入50 mL高糖（4500 mg/L L-葡萄糖） Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并补充5%新生牛血清（NCS）和青霉素/链霉素，连续培养7天以制备....

结果

用CFSE标记的髓鞘碎片处理BMDM应能观察到明显的内化现象（图2）。虽然3小时的相互作用时间已足以使BMDM吞噬足够量的髓鞘碎片，从而实现稳定的下游检测，但在仅1小时的相互作用后即可观察到细胞内积累。然而，洗涤后仍可能有部分髓鞘碎片残留在细胞表面，这可能是由于洗涤不充分，或在吞噬早期阶段颗粒尚未完全内化所致。

尽管BMDM能够快速内吞髓鞘碎片，但在形成油红O可染脂滴之前，需要经过溶酶体加工处理。为证明这一点，将BMDM与髓鞘碎片共孵育90分钟，随后洗涤，并在固定和染色前继续培养不同时间（图3）。图4显示，从处理开始到中性脂质出现之间存在延迟。还应注意，脂质在培养过程中并不稳定。BMDM在脂滴形成后不久即开始代谢所积累的脂质。因此，我们建议在洗去未吞噬的髓鞘碎片后，至固定前的等待时间不超过24小时。

ORO 染色面积的定量分析可反映 BMDM 中髓鞘.......

讨论

本文所述实验步骤同时使用新鲜分离的粗制中枢神经系统髓鞘碎片和原代骨髓来源的巨噬细胞。为了减少动物使用量，建议在处死小鼠时同时采集脑组织和骨髓细胞。两名研究人员可协作同时制备两种材料。 alternatively，脑组织可在含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存于 -80 °C，以备后续进行髓鞘碎片的分离。根据我们的经验，在此条件下保存长达1个月，脑组织产生髓鞘碎片的能力不会出现明显下降。

CFSE 被用于标记髓鞘碎片，因其使用简便且荧光强度高。该染料在细胞内酯酶切除分子上的乙酸基团之前保持淬灭状态¹⁴。游离的琥珀酰亚胺酯基团随后可与伯胺发生反应，从而共价结合到细胞蛋白上¹⁴。虽然 CFSE 可通过标准的绿色荧光通道激发，但目前已有多种具有不同光谱特性的衍生物商业化供应。因此，可以设计一种类似的吞噬实验，使用多种荧光染料进行标记。还应注意，由于该染料可轻易穿过质膜，因此也可用于以类似标记髓鞘碎片的方式标记凋亡细胞¹⁹。此外，尽管本方法依赖于标.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01	高糖，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠
青霉素-链霉素溶液	Corning	30-002-CI	100倍浓缩液
新生小牛血清（NCS）	Rocky Mountain Biologics	NBS-BBT-5XM	源自美国
NCTC clone 929 [L细胞，L-929，Strain L的衍生株]	ATCC	CCL-1	用于制备条件培养基的L929细胞系
24孔细胞培养板	VWR	10062-896
细胞培养皿	Greiner Bio-One	639960	聚苯乙烯，145/20 mm
CFSE细胞增殖检测试剂盒	Thermo Fisher	C34570	提供用于重悬的DMSO
含Tris缓冲液的Fluoro-gel	Electron Microscopy Sciences	17985-11
油红O	Sigma Aldrich	O0625
仪器
材料	公司	货号	备注
超速离心管	Beckman Coulter	326823	薄壁，聚丙烯，38.5 mL，25 × 89 mm
SW 32 Ti超速离心转子	Beckman Coulter	369650	SW 32 Ti转子，摆桶式，钛合金
手持式旋转匀浆器	Fisher Science	08-451-71