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方法文章

用于高密度脂蛋白中脂质过氧化高通量检测的无细胞生化荧光酶法测定

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DOI：

10.3791/56325

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2017年10月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

本文内容

摘要

本文介绍一种用于测定高密度脂蛋白（HDL）脂质过氧化的荧光定量无细胞生化检测方法。该方法快速且可重复，适用于大规模研究中HDL功能的评估，并有助于加深对HDL在人类疾病中作用的理解。

摘要

低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平过低是动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）最显著的独立负向预测因子之一。相比HDL-C水平，高密度脂蛋白（HDL）的结构和功能可能更能准确预测动脉粥样硬化的发生。在动脉粥样硬化等炎症状态下，HDL的蛋白质和脂质组成会发生多种改变，从而损害HDL功能。通常通过基于细胞的实验（如胆固醇外流实验）来评估HDL功能，但这类实验存在诸多缺陷，且缺乏标准化。与基于细胞的实验相比，无细胞实验可能提供更可靠的HDL功能测量结果。HDL的氧化会损害其功能，HDL在脂质过氧化物的转运中起主要作用，而高水平的脂质过氧化物与HDL功能异常相关。在解读用于测定脂质氧化状态的非酶促荧光实验结果时，应考虑脂质探针之间的相互作用。这促使我们开发了一种无细胞的生化酶学方法，用于评估导致HDL功能障碍的HDL脂质过氧化物含量（HDLox）。该方法基于辣根过氧化物酶（HRP）和荧光染料Amplex Red，可在无需胆固醇氧化酶的情况下，定量每毫克HDL-C所含的脂质过氧化物含量。本文描述了使用该荧光染料试剂测定HDL脂质过氧化的实验方案。通过严格标准化实验条件，可降低该实验的变异性。较高的HDLox值与HDL抗氧化功能下降相关。该实验的检测结果与已验证的基于细胞实验的读数、心血管疾病的替代指标、全身性炎症、免疫功能障碍以及相关的心血管和代谢风险表型均存在关联。该技术方法是一种可靠的手段，可用于评估系统性炎症、氧化应激和氧化脂质发挥关键作用的人类疾病（如动脉粥样硬化）中的HDL功能。

引言

动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）是全球最主要的死亡原因1,2。流行病学研究表明，高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平较低通常与动脉粥样硬化发生风险呈负相关1,2。尽管多项研究支持HDL具有抗动脉粥样硬化作用1,2，但HDL抑制动脉粥样硬化起始和进展的具体机制十分复杂3,4。因此，有研究提出，相较于HDL的绝对浓度，其复杂的结构与功能可能更能准确预测动脉粥样硬化的风险5,6,7,8。在动脉粥样硬化等炎症状态下，HDL的蛋白质和脂质组成会发生多种改变，从而损害其功能，包括：i) 降低胆固醇外流能力9；ii) 减少抗炎蛋白并增加与HDL相关的促炎蛋白6,7；iii) 降低抗氧化因子的水平和活性，削弱HDL抑制低密度脂蛋白氧化（LDLox）的能力10；以及iv) 增加脂质氢过氧化物含量及氧化还原活性（HDLox）9,11。评估HDL多种功能（如胆固醇外流能力、抗氧化功能）的可靠检测方法，可作为临床中HDL-HDL-C测定的有益补充。

HDL 功能通常通过基于细胞的方法来评估，例如胆固醇流出实验8,12,13,14。这些方法存在重大局限性，包括所用细胞类型的显著异质性、报告读数类型的不同、缺乏标准化以及甘油三酯的混杂效应7,15。这些缺点给大规模临床研究带来了困难16。无细胞检测方法相较于基于细胞的检测可能提供更可靠的 HDL 功能测量结果。胆固醇流出是 HDL 最重要的功能之一，但只能通过基于细胞的检测来测定。其他评估 HDL 功能的方法，如蛋白质组学17,18,19,20,21,22,23,24 和基于细胞的单核细胞趋化实验17,22,25，尚未实现标准化，无法用于大规模的人体研究。

高密度脂蛋白（HDL）具有显著的抗氧化抗动脉粥样硬化作用5,6,7,8。在先前的无细胞荧光测定中，已证实HDL在低密度脂蛋白（LDL）存在条件下的抗氧化功能26。这些用于评估HDL抗氧化功能的生化荧光方法最初由Mohamad Navab、Alan Fogelman及其同事建立26。尽管许多人类研究已采用这些方法来测定HDL功能17,18,19,20,21,22,23,24，但脂质（HDL）-脂质（LDL）以及脂质-荧光染料之间的相互作用可能限制这类无细胞非酶促生化功能检测方法的可重复性27,28。

近期研究关注高密度脂蛋白（HDL）氧化的功能性后果，这种氧化涉及HDL内脂质和蛋白质的氧化27,29,30。先前研究表明，HDL的氧化会损害其正常功能27,29,30。HDL在脂质过氧化物转运中起主要作用，而高水平的脂质过氧化物与HDL功能异常相关。因此，HDL中脂质过氧化物的含量可用于评估HDL功能9,17,20,31。鉴于已有HDL功能检测方法存在已知局限性7,15,27,32，我们开发了一种替代性的荧光定量方法，用于测定HDL脂质过氧化物含量（HDLox）32。该方法基于辣根过氧化物酶（HRP）和荧光探针Amplex Red，可在无需胆固醇氧化酶的情况下，定量每毫克HDL-C所含的脂质过氧化物含量32。该检测的生化原理见图1。我们已证实，这种基于荧光的检测方法克服了先前HDL功能检测的局限性27,28。该方法已在本实验室进一步优化和标准化，即使使用冻存血浆样本，也可在大规模人群研究中可靠应用32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42。该检测结果与已验证的细胞实验检测结果、心血管疾病替代指标、全身性炎症、免疫功能障碍以及相关的心血管和代谢风险表型均具有关联性32,33,34,35,36,37,38,39。本文中，我们描述了这一简便且稳健的测定HDL脂质过氧化物含量（HDLox）的方法。该检测可作为研究工具，用于探讨HDL功能在人类疾病中的作用，特别是在系统性炎症、氧化应激和氧化脂质发挥关键作用的疾病（如动脉粥样硬化）中32。

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方案

所有使用人类生物样本的实验均获得加利福尼亚大学洛杉矶分校（洛杉矶）以及墨尔本阿尔弗雷德医院人类伦理委员会的伦理批准。

注意：荧光染料标记的高密度脂蛋白（HDL）功能检测有多种变异方法（见讨论部分）32。以下将描述可获得最一致且可重复结果的实验方案。该检测的总体流程如图2所示。

1. 样本处理

  1. 使用新鲜、未溶血的血清（可用血清分离管采集）或在禁食12-14小时后获得的枸橼酸盐血浆。若使用冻存样本，需按照本方案中所述设置适当的对照。

2. 第0天——实验前准备

  1. 根据适当的对照、样品和重复设置实验的工作布局。每个样品至少设置三个重复。典型的96孔板布局如图3所示。
  2. 根据样品数量和重复次数，计算实验所需各试剂的总体积。
    注意：每种工作液需额外增加10%的体积，以确保特定实验中有足够的试剂用量。
  3. 为实验各步骤所需的全部试管进行标记，例如用于HDL分离、HDL-C测定（可选）以及荧光染料实验等步骤。

3. 第1天——对照组的准备

  1. 研究特异性混合对照品的制备
    1. 从所有研究样本的混合血浆或血清中创建一个对照样品。若每块板以三复孔运行20个样本，则从每个样本中取10 µL合并成200 µL的混合对照品。将该混合对照品的单独分装样本送至临床实验室，以测定该对照品的HDL-C值。
      注意：使用此混合对照品对检测进行标准化，并校正所有可能的已知（例如基质类型为血清或血浆、冻融循环、冷冻保存）和未知混杂因素，这些因素可能影响实验变异性27,28。
  2. 实验室特异性质量控制品（QCs）的制备
    1. 在每个实验室中制备大量高密度脂蛋白（HDL）储备液（例如，从10名健康供体的共5 mL血浆中分离HDL），并将该储备液分装成多份并冷冻保存，以尽量减少冻融循环次数。
    2. 使用该储备液至少10个不同的重复样本，测定HDLox的平均值。每个检测中所包含的各QC样本测得的HDLox值，其变异系数应在该平均值的<15%范围内，方可接受。
    3. 将该混合对照品的单独分装样本送至临床实验室，以测定该对照品的HDL-C值（例如40 mg/dL）。
      注意：先前已有文献详细描述如何使用血库血液制备此类对照品27,28,32。根据需要可使用额外的质量控制品（例如，一个来自已知具有正常HDL功能的健康供体，另一个来自已知具有显著异常HDL功能的供体）。
  3. 背景信号与空白值的优化（可选）
    1. 为最小化背景信号，在孵育体系中加入适量过氧化氢酶（1–4 U/mL），以快速清除缓冲液在空气中自发氧化所产生的H2O2。
      注意：由于空白孔（无HDL）的读数将从HDL样本的读数中扣除，且结果相对于同96孔板中包含的混合对照品进行报告，我们发现此步骤实际上对结果无显著影响。因此，如有需要，可省略使用过氧化氢酶对背景信号进行优化的步骤。

4. 第1天——使用HDL沉淀法分离高密度脂蛋白胆固醇

注意：使用市售的标准化高密度脂蛋白胆固醇沉淀试剂，按照制造商说明书分离载脂蛋白B（apoB）耗竭血清。此类试剂在比色法测定中被广泛用于测定高密度脂蛋白胆固醇水平。

  1. 使用新鲜（或解冻）的血浆或血清样本。
  2. 取等体积（例如 80 µL）的血浆与高密度脂蛋白胆固醇沉淀试剂（20% w/v 聚乙二醇溶于 pH 10.0 (25 °C) 的甘氨酸缓冲液中）混合。
  3. 通过移液器反复吹打充分混匀。
  4. 在 1000–2000 × g 条件下离心 10 分钟。
  5. 吸走上清液（HDL 组分）。
  6. 理想情况下应立即使用分离得到的 HDL 进行荧光探针法检测 HDL 脂质过氧化。然而，若同一天处理多个样本，且还需进行其他步骤（如测定 HDL-胆固醇浓度），则可将分离的 HDL 在 4 °C 下保存，并于次日用于荧光探针法检测 HDL 功能。

5. 第1天——分离高密度脂蛋白中胆固醇（HDL-C）的测定

注意：如果使用临床实验室提供的HDL-C值来按HDL-C含量对HDLox进行归一化处理，则此步骤为可选。

  1. 使用标准的比色法测定血浆中的高密度脂蛋白胆固醇含量27。在每个孔中加入50 µL胆固醇试剂，并使用比色法酶标仪及试剂盒中提供的胆固醇标准品测定胆固醇浓度。

6. 第2天——试剂准备

  1. 制备 HRP 和胆固醇溶液：HRP 溶液浓度为 5 U/mL（范围 1–10 U/mL）。
  2. 制备 20 mM 荧光染料溶液（例如 Amplex Red）：将荧光染料试剂和 DMSO 解冻至室温。使用前，将荧光染料试剂（1 mg）溶于 200 µL DMSO 中。将储备液于 ≤-20 °C 避光冷冻保存。
  3. 制备阳性和阴性对照：分别使用不含胆固醇的 1ד反应缓冲液”和 20 mM H2O2 工作液作为阴性对照和阳性对照。

7. 第2天-荧光染料检测

  1. 加入 50 µL 的 1x 反应缓冲液作为空白对照（阴性对照）。
  2. 可选：在每块板中加入 20 mM 的 H2O2 工作溶液作为阳性对照。
  3. 为尽量减少实验误差，并确保试剂和样品的添加操作一致且及时，先在另一个 96 孔圆底透明聚苯乙烯或聚丙烯板（板 1）中完成所有样品的添加。然后使用多通道移液器将特定体积的样品转移至 3 块 96 孔板（板 2–4：聚丙烯材质，平底，黑色）中（各板布局相同）（图 2，图 3）。
    1. 例如，首先在板 1 的每个孔/样品中加入 160 µL 分离得到的 HDL，然后使用多通道移液器从每个孔/样品中转移 50 µL HDL-胆固醇至 96 孔黑色板中。每次移液至不同行/列时更换吸头，所有转移操作均使用无滤芯吸头。
  4. 样品保留在孔中，不要弃去。试剂添加之间无需洗涤步骤。
  5. 向每个孔中加入 50 µL 的 HRP 溶液（5 U/mL，0.25 U）。
    注意：在加入荧光染料试剂之前先加入 HRP。
  6. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育后不要弃去样品（试剂添加之间无洗涤步骤）。
  7. 加入 50 µL 荧光染料试剂，使其终浓度为 300 µM。此时总反应体积为 150 µL。充分混匀并避光保存。
  8. 在 37 °C 下，使用荧光酶标仪（530/590 nm 滤光片）每分钟检测一次荧光信号，持续 120 分钟（在暗处读数）。
    注意：使用新鲜样品时可采用较短的 60 分钟检测时间。我们发现使用冻存样品时，120 分钟检测可获得更可重复的数据。
  9. 使用适当的软件记录数据。

8. 第3天-数据分析

  1. 在加入荧光染料试剂后120分钟，记录所有样品（包括空白孔和所有对照）的荧光强度（任意单位）。
  2. 根据至少三个重复样本计算荧光单位的平均值（HDLox_sample）。不要取离群值（> 平均值的2个标准差范围内
  3. 使用以下公式减去背景荧光：
    HDLox_sample 荧光计算公式；样品荧光扣除示例
  4. 高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量标准化：将每个样本（包括混合对照）的氧化高密度脂蛋白（HDLox）脂质过氧化值根据其HDL-C（mg/dl）进行标准化。在结果部分中，HDL氧化物 以 n 表示（HDL-C） HDLox 测定值用于反映对 HDL-C 的校正。使用以下公式：
    高密度脂蛋白样品中的荧光方程；高密度脂蛋白胆固醇定量公式；化学研究
  5. 将各样本的 HDLox 脂质过氧化值相对于混合对照样本的值进行标准化。对 n 进行归一化处理。（HDL-C） 经HDL-C校正后各样本的HDLox脂质过氧化值（HDL-C） 对照组混合样本的 HDLox 脂质过氧化值。在结果部分中，HDL氧化物 以 nHDL 形式呈现氧化物 测量以反映对实验变异性和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的校正。使用以下公式：
    nHDLox 定量公式，生化分析中 HDL 氧化比率，方程示意图。
    注：该方法与其他已建立的实验方法类似，旨在降低测量结果的实验变异性，例如国际标准化比值（INR）44,45该方法已在临床研究中得到验证32,33,34,35,36,37,38,39.
  6. 使用标准质控样品对实验结果进行质量控制。每个实验室应建立自身的质控（QC）体系。理想情况下，应包含来自已知高密度脂蛋白功能异常样本的nHDLox质控品，以及来自健康供体样本的nHDLox质控品［例如，采用年轻成年献血者混合样本，这些供体无已知共病及心血管疾病危险因素（包括吸烟）］。后者有助于不同实验室之间的结果标准化。这些质控品的平均值应基于至少5次重复测定确定（通常此关键步骤采用10次重复）。
    1. 检查每个检测中测定的质控品（QCs）数值是否在预期值范围内。假设可接受的最大实验变异率为15%，所有测定的实验值应落在已建立的质控品已知平均值的±15%范围内。使用以下公式：
      质量控制公式；实验值范围；数学概念
      质量控制范围公式；实验数据比较；数学表达
      注意：如果所包含的质量控制样本（正常与功能障碍性HDL）中任一样本的HDL氧化值超出各实验室 established 的预期范围，则需重复实验。
  7. 使用变异系数（CV）对实验结果进行质量控制，以量化实验变异性：所有样本均需重复实验，确保变异系数百分比（CV%）小于5%。 > 15%。使用以下公式：
    变异系数公式，CV% 计算，统计分析方程示意图。
    注意：典型的板内（同一块板）和板间（不同板之间）实验变异度为 < 15%。2）典型的板内变异系数（CV）为1-7%，典型的板间变异系数（CV）为3-10%。

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结果

每个HDL样品各取50 µL，按步骤7.3加入各孔中。然后按步骤7.5，每孔加入50 µL浓度为5 U/mL（0.25 U）的HRP溶液。按步骤7.6，在37 °C孵育30分钟。随后按步骤7.7，每孔加入50 µL荧光染料试剂（终浓度为300 µM）。使用荧光酶标仪（530/590 nm滤光片），在37 °C避光条件下，每分钟检测一次荧光信号，持续120分钟。空白对照、混合对照、已知功能异常的HDL样品以及正常HDL样品的代表性荧光数据见图4。原始代表性数据及使用本方案第8节所述公式进行的逐步结果分析见表1。本示例中使用了新鲜HDL样品，通常新鲜HDL会获得较高的HDLox值。例如，基于独立的HDL功能检测以及来自HIV感染者的样品显示，其每单位脂质过氧化物含量较来自健康参与者的混合HDL高出约2倍。图5展示了已知HDL功能受损受试者研究中的代表性结果28,

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讨论

此处描述的方案为研究高密度脂蛋白（HDL）功能在动脉粥样硬化及人类疾病中作用的重要科学问题提供了一种可靠的工具。该检测方法利用酶促放大反应（HRP）定量每毫克高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）中的HDL脂质过氧化物含量。该方法避免了既往HDL功能检测（如胆固醇外流实验）已知的局限性，包括所用细胞类型、报告读数方式的显著异质性、缺乏标准化以及甘油三酯的混杂效应。7,15,32测定HDL的生化特性（如胆固醇流出）而非生物学特性可能具有更高的可重复性。不同实验间的变异度 <10% 与基于细胞的 HDL 功能检测相比具有优势，后者通常存在较高的检测间实验变异性 >15%（或未报告）。此外，该方法可能限制脂质与荧光探针之间的生化相互作用32HDL氧化的测定在心血管疾病背景下具有重要意义，因为氧化应激在动脉壁内的动脉粥样硬化发生机制中起关键作用。 46我们...

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披露

本方案和检测与专利 PCT/US2015/018147 相关。

致谢

作者们衷心感谢 Mohamad Navab 博士、Alan Fogelman 和 Srinivasa Reddy 在本模型早期版本开发过程中所发挥的关键作用。T.A.A. 获得了皇家墨尔本理工大学副校长博士后奖学金的支持。AJ 和 AH 获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）项目资助 1108792 的支持。TK 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助 NIH K08AI08272 以及美国国立卫生研究院转化科学促进中心（NIH/NCATS）资助 # µL1TR000124 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
实验试剂
HDL PEG（聚乙二醇）沉淀试剂Pointe ScientificH7511
Amplex Red 试剂Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red 胆固醇检测试剂盒
• ≤–20°C • 干燥保存
• 避光
DMSOLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red 胆固醇检测试剂盒
• ≤–20°C • 干燥保存
• 避光
辣根过氧化物酶（HRP）Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red 胆固醇检测试剂盒
• ≤–20°C • 干燥保存
• 避光
胆固醇酯酶Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red 胆固醇检测试剂盒
• ≤–20°C • 干燥保存
• 避光
胆固醇标准品Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red 胆固醇检测试剂盒
• ≤–20°C • 干燥保存
• 避光
试卤灵荧光标准品Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red 胆固醇检测试剂盒
• ≤–20°C • 干燥保存
• 避光
5x 反应缓冲液Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red 胆固醇检测试剂盒
• ≤–20°C • 干燥保存
• 避光
HDL 胆固醇自动化试剂ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.TR39601
名称公司目录编号备注
塑料耗材
96 孔板（聚丙烯，平底，透明）Sigma AldrichM0687
96 孔板（聚丙烯，平底，黑色）Sigma AldrichM9936
1.5 mL Eppendorf 离心管Eppendorf0030 125.150
ClipTip 200，无菌ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.14-488-058
Thermo Scientific 多通道移液器，8 通道，125 ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-387--955
名称公司目录编号备注
软件
Gen5 2.01 软件Biotek, Vermont, USANA
名称公司目录编号备注
设备
Gen5 酶标仪Biotek, Vermont, USANA

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