本文介绍一种用于测定高密度脂蛋白（HDL）脂质过氧化的荧光定量无细胞生化检测方法。该方法快速且可重复，适用于大规模研究中HDL功能的评估，并有助于加深对HDL在人类疾病中作用的理解。
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本文内容
摘要
摘要
低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平过低是动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）最显著的独立负向预测因子之一。相比HDL-C水平，高密度脂蛋白（HDL）的结构和功能可能更能准确预测动脉粥样硬化的发生。在动脉粥样硬化等炎症状态下，HDL的蛋白质和脂质组成会发生多种改变，从而损害HDL功能。通常通过基于细胞的实验（如胆固醇外流实验）来评估HDL功能，但这类实验存在诸多缺陷，且缺乏标准化。与基于细胞的实验相比，无细胞实验可能提供更可靠的HDL功能测量结果。HDL的氧化会损害其功能，HDL在脂质过氧化物的转运中起主要作用，而高水平的脂质过氧化物与HDL功能异常相关。在解读用于测定脂质氧化状态的非酶促荧光实验结果时，应考虑脂质探针之间的相互作用。这促使我们开发了一种无细胞的生化酶学方法，用于评估导致HDL功能障碍的HDL脂质过氧化物含量（HDLox）。该方法基于辣根过氧化物酶（HRP）和荧光染料Amplex Red，可在无需胆固醇氧化酶的情况下，定量每毫克HDL-C所含的脂质过氧化物含量。本文描述了使用该荧光染料试剂测定HDL脂质过氧化的实验方案。通过严格标准化实验条件，可降低该实验的变异性。较高的HDLox值与HDL抗氧化功能下降相关。该实验的检测结果与已验证的基于细胞实验的读数、心血管疾病的替代指标、全身性炎症、免疫功能障碍以及相关的心血管和代谢风险表型均存在关联。该技术方法是一种可靠的手段，可用于评估系统性炎症、氧化应激和氧化脂质发挥关键作用的人类疾病（如动脉粥样硬化）中的HDL功能。
引言
动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）是全球最主要的死亡原因1,2。流行病学研究表明，高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平较低通常与动脉粥样硬化发生风险呈负相关1,2。尽管多项研究支持HDL具有抗动脉粥样硬化作用1,2，但HDL抑制动脉粥样硬化起始和进展的具体机制十分复杂3,4。因此，有研究提出，相较于HDL的绝对浓度，其复杂的结构与功能可能更能准确预测动脉粥样硬化的风险5,6,7,8。在动脉粥样硬化等炎症状态下，HDL的蛋白质和脂质组成会发生多种改变，从而损害其功能，包括：i) 降低胆固醇外流能力9；ii) 减少抗炎蛋白并增加与HDL相关的促炎蛋白
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方案
所有使用人类生物样本的实验均获得加利福尼亚大学洛杉矶分校（洛杉矶）以及墨尔本阿尔弗雷德医院人类伦理委员会的伦理批准。
注意：荧光染料标记的高密度脂蛋白（HDL）功能检测有多种变异方法（见讨论部分）32。以下将描述可获得最一致且可重复结果的实验方案。该检测的总体流程如图2所示。
1. 样本处理
- 使用新鲜、未溶血的血清（可用血清分离管采集）或在禁食12-14小时后获得的枸橼酸盐血浆。若使用冻存样本，需按照本方案中所述设置适当的对照。
2. 第0天——实验前准备
- 根据适当的对照、样品和重复设置实验的工作布局。每个样品至少设置三个重复。典型的96孔板布局如图3所示。
- 根据样品数量和重复次数，计算实验所需各试剂的总体积。
注意：每种工作液需额外增加10%的体积，以确保特定实验中有足够的试剂用量。 - 为实验各步骤所需的全部试管进行标记，例如用于HDL分离、HDL-C测定（可选）以及荧光染料实验等步骤。
3. 第1天——对照组的准备
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结果
每个HDL样品各取50 µL，按步骤7.3加入各孔中。然后按步骤7.5，每孔加入50 µL浓度为5 U/mL（0.25 U）的HRP溶液。按步骤7.6，在37 °C孵育30分钟。随后按步骤7.7，每孔加入50 µL荧光染料试剂（终浓度为300 µM）。使用荧光酶标仪（530/590 nm滤光片），在37 °C避光条件下，每分钟检测一次荧光信号，持续120分钟。空白对照、混合对照、已知功能异常的HDL样品以及正常HDL样品的代表性荧光数据见图4。原始代表性数据及使用本方案第8节所述公式进行的逐步结果分析见表1。本示例中使用了新鲜HDL样品，通常新鲜HDL会获得较高的HDLox值。例如，基于独立的HDL功能检测以及来自HIV感染者的样品显示，其每单位脂质过氧化物含量较来自健康参与者的混合HDL高出约2倍。图5展示了已知HDL功能受损受试者研究中的代表性结果28,
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讨论
此处描述的方案为研究高密度脂蛋白（HDL）功能在动脉粥样硬化及人类疾病中作用的重要科学问题提供了一种可靠的工具。该检测方法利用酶促放大反应（HRP）定量每毫克高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）中的HDL脂质过氧化物含量。该方法避免了既往HDL功能检测（如胆固醇外流实验）已知的局限性，包括所用细胞类型、报告读数方式的显著异质性、缺乏标准化以及甘油三酯的混杂效应。7,15,32测定HDL的生化特性（如胆固醇流出）而非生物学特性可能具有更高的可重复性。不同实验间的变异度 <10% 与基于细胞的 HDL 功能检测相比具有优势，后者通常存在较高的检测间实验变异性 >15%（或未报告）。此外，该方法可能限制脂质与荧光探针之间的生化相互作用32HDL氧化的测定在心血管疾病背景下具有重要意义，因为氧化应激在动脉壁内的动脉粥样硬化发生机制中起关键作用。 46我们.......
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披露
本方案和检测与专利 PCT/US2015/018147 相关。
致谢
作者们衷心感谢 Mohamad Navab 博士、Alan Fogelman 和 Srinivasa Reddy 在本模型早期版本开发过程中所发挥的关键作用。T.A.A. 获得了皇家墨尔本理工大学副校长博士后奖学金的支持。AJ 和 AH 获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）项目资助 1108792 的支持。TK 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助 NIH K08AI08272 以及美国国立卫生研究院转化科学促进中心（NIH/NCATS）资助 # µL1TR000124 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 实验试剂 | |||
| HDL PEG（聚乙二醇）沉淀试剂 | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red 试剂 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red 胆固醇检测试剂盒 • ≤–20°C • 干燥保存 • 避光 |
| DMSO | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red 胆固醇检测试剂盒 • ≤–20°C • 干燥保存 • 避光 |
| 辣根过氧化物酶（HRP） | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red 胆固醇检测试剂盒 • ≤–20°C • 干燥保存 • 避光 |
| 胆固醇酯酶 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red 胆固醇检测试剂盒 • ≤–20°C • 干燥保存 • 避光 |
| 胆固醇标准品 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red 胆固醇检测试剂盒 • ≤–20°C • 干燥保存 • 避光 |
| 试卤灵荧光标准品 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red 胆固醇检测试剂盒 • ≤–20°C • 干燥保存 • 避光 |
| 5x 反应缓冲液 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red 胆固醇检测试剂盒 • ≤–20°C • 干燥保存 • 避光 |
| HDL 胆固醇自动化试剂 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 塑料耗材 | |||
| 96 孔板（聚丙烯，平底，透明） | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96 孔板（聚丙烯，平底，黑色） | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf 离心管 | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200，无菌 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific 多通道移液器，8 通道，125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| Gen5 2.01 软件 | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| Gen5 酶标仪 | Biotek, Vermont, USA | NA |
参考文献
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al.
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