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方法文章

用于肠道干细胞与微环境细胞功能分析的类器官重建实验（ORA）

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DOI：

10.3791/56329

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2017年11月20日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Erasmus MC Cancer Institute, Erasmus University Medical Center

本文内容

摘要

肠道类器官培养通常由完整的隐窝建立，无法实现对自我更新和分化过程的细胞特异性分析。本方案描述了分离纯化的干细胞（Lgr5+）和微环境细胞（潘氏细胞）的重建培养，这些细胞能够形成类器官，同时允许在培养前对其进行生化和遗传修饰，并开展功能分析。

摘要

肠上皮具有极高的更新速率。在哺乳动物中，整个上皮层可在4至5天内完成更新。成体肠干细胞位于利贝昆隐窝的底部，其特征是表达 Lgr5 基因，并通过其特征性的高增殖速率维持稳态1在整个小肠中， Lgr5+ 干细胞与一种称为潘氏细胞的特化分泌细胞相互混杂。潘氏细胞分泌抗菌化合物（即，溶菌酶和隐窝素/防御素）对肠道菌群具有调控作用。最近，潘氏细胞被发现具有新的功能，即为干细胞微环境提供支持 Lgr5+ 通过Wnt3、EGF和Dll1等多个关键配体的干细胞2.

当分离后 离体 在特定生长因子和细胞外基质成分存在下培养时，完整的肠隐窝可形成长寿且具有自我更新能力的三维结构，称为类器官，其形态高度类似于成年小肠的隐窝-绒毛上皮结构3类器官培养若由完整的隐窝建立，可用来研究肠干细胞微环境的自我更新与分化，但无法解析其各个组分（即）的各自贡献 Lgr5+ 和潘氏细胞。

本文介绍了一种新型类器官检测方法，该方法利用潘氏细胞与Lgr5+细胞在共培养条件下能够相互结合并形成类器官的特性。此方法在此称为"类器官重建检测"（ORA），可对潘氏细胞或Lgr5+干细胞进行遗传学和生物化学修饰，随后将其重建为类器官。因此，该方法可用于对肠干细胞微环境中的两个主要组分进行功能分析。

引言

肠上皮是哺乳动物体内更新速度最快的组织，因此成为大量研究的对象，这些研究旨在鉴定并功能表征位于Lieberkühn隐窝底部的成体干细胞，这些干细胞以表达特定标记分子为特征 Lgr5 基因且依赖于经典Wnt信号1值得注意的是， Lgr5+ 干细胞由特化的微环境细胞包围并提供支持， 即 潘氏细胞，其成熟过程也依赖于Wnt信号通路2这两种细胞共同维持肠道上皮层的自我更新，并保持每日的稳态平衡： Lgr5+ 干细胞快速分裂，产生祖细胞及更特化的肠上皮细胞；潘氏细胞提供关键的微环境因子（例如，Dll1、Wnt3、EGF）至 Lgr5+ 干细胞2肠道隐窝接种后的增殖能力 离体 形成称为类器官的有序且具有自我更新能力的结构，或 "迷你肠道"，已被用作一种实验工具，以深入研究正常和病理条件下（包括癌症）的自我更新和分化等过程4已从多种组织（包括小鼠和人类样本的肠道、胰腺、肝脏和肾脏）成功建立类器官培养体系。4提取方法及用于建立这些类器官培养物的生长因子具有组织特异性，旨在促进多谱系分化，并尽可能模拟原始的干细胞微环境。 体内 类器官可能具有多种应用前景，包括遗传性疾病的治疗、癌症治疗效果的评估、药物毒性的分析以及器官发生过程的研究 体外5.

总体而言，从组织样本建立类器官培养的主要局限性在于缺乏细胞特异性。例如，由完整肠隐窝建立的肠类器官无法对组织来源中包含的各个细胞组分进行单独分析。例如，整个隐窝包含 Lgr5+，潘氏细胞和前体细胞）。

本文介绍了一种称为 ORA 的新方法，该方法结合了肠道类器官培养与其最基本组分——干细胞（Lgr5+）和微环境细胞（潘氏细胞）——功能分析的优势。这一方法基于潘氏细胞与 Lgr5+ 细胞在共孵育时能够相互发生物理结合并形成类器官的独特能力2,6,10。我们利用这一特性，在让两种细胞类型重新组合形成类器官之前，分别对它们进行预处理。通过这种方式，可在类器官重建和形成之前，将每一种细胞组分单独暴露于特定药物、生长因子、生化抑制剂、基因修饰或化学处理条件下。因此，使用 ORA 检测可明确判断特定药物处理或基因修饰是否对干细胞或其对应的微环境细胞产生特异性作用。

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方案

所有操作均根据当地的动物福利法律法规和指南进行。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

  1. 将一套肠剪、普通剪刀和镊子放入无菌容器中进行高压灭菌。
  2. 将一个96孔（平底）培养板放入37 °C的培养箱中。
  3. 根据材料表中列出的试剂，制备10 mL完全培养基。
  4. 将完全培养基置于37 °C水浴中孵育。
  5. 将重建的基底膜置于冰桶中解冻。重建的基底膜在4 °C时将变为液体状态。
  6. 用4 °C的冷磷酸盐缓冲液（简称PBS）填充4个培养皿。

2. 小肠隐窝的分离

  1. 使用 CO2 吸入法处死一只背景为 C57BL6/J 的 Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 小鼠。用剪刀沿纵向解剖腹膜。
  2. 用镊子夹住胃部，并横向将其切成两半。
  3. 此后使用肠用剪刀，将肠道拉出并置于含有 PBS 的培养皿中。
    注意：肠用剪刀一端为锐利尖端，另一端为钝头。钝头设计用于在打开肠道时避免损伤隐窝-绒毛结构。
  4. 首先将钝头插入胃部，轻柔地通过幽门推进。随后一边用剪刀剪开，一边用镊子牵拉。
  5. 当整个小肠被纵向完全打开后，用镊子夹住组织，在冷 PBS 中以 U 形动作轻轻冲洗清洗。
  6. 待所有粪便残留物清除后，将小肠平铺于切板上，腔面朝上。腔面可通过无血管分布及颜色较外侧更苍白的特征进行识别。
  7. 用载玻片沿组织全长轻轻刮除绒毛，此步骤需重复两次。
  8. 用无菌手术刀片将小肠切成 2–5 mm 的小段。
  9. 将小肠片段放入含有 10 mL 冰冷 PBS 的 50 mL 离心管中。
  10. 通过在 PBS 中反复吹打去除组织片段中的残余杂质，清洗组织。弃去上清液，并重复此步骤直至 PBS 完全澄清。
  11. 加入 15 mL 冷 PBS，使 PBS 总体积达到 25 mL。加入 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 45 分钟。
  12. 弃去 PBS/EDTA 溶液。
  13. 加入 10 mL PBS，通过剧烈吹打组织片段（至少三次）使隐窝脱落。收集上清液。
  14. 重复步骤 2.13 四次。加入培养基，使最终体积达到 50 mL。
  15. 通过离心（300 × g，5 分钟）沉淀细胞。
  16. 将沉淀重悬于 10 mL 培养基中，再次离心以沉淀隐窝（80 × g，3 分钟）。

3. 单细胞制备

  1. 弃去沉淀的隐窝上清液，加入1 mL类胰蛋白酶溶液和50 µL DNA酶（50 µg/mL），重悬隐窝。
  2. 将细胞置于32 °C水浴中孵育2分钟。
  3. 加入10 mL培养基，通过剧烈吹打至少5次，将隐窝解离为单个细胞。
  4. 将溶液经40 µm细胞筛过滤（以去除团块和其他杂质），在300 × g离心5分钟，沉淀单细胞。

4. 流式细胞术与铺板

  1. 配制 50 mL 的 1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS）/2% 胎牛血清（FCS）溶液，并按每 106 个细胞加入 1 mL 的量重悬细胞沉淀。
  2. 向细胞悬液中加入 BV421 标记的 Lin−（CD31、CD45、TER119）抗体（1:100 稀释度）、CD24-APC 抗体和 CD117-PE 抗体（均为 1:250 稀释度），4°C 避光孵育 30 分钟。
  3. 将 Lgr5+ 干细胞和潘氏细胞分选至不同的低吸附离心管中。有关 Lgr5+ 干细胞和潘氏细胞的分选方案详情，请参见 Roth 等7 和 Schewe 等6。
    1. 将分选后的细胞以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清。用 100 µL 含有步骤 1.3 所述组分的培养基重悬细胞（参见 材料表）。
  4. 对潘氏细胞（n = 2000）或 Lgr5+ 干细胞（n = 2000）进行处理（例如，通过化学或基因修饰）。
    1. 处理细胞时，在 100 µL 培养基中加入 5 µL 脂质体介导的转染试剂和终浓度为 100 nM 的小干扰 RNA（siRNA）。在 37 °C 孵育 30 分钟（或根据所选修饰方法所需的相应时间）。
  5. 用 500 µL 培养基洗涤细胞两次。
  6. 以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 10 µL 培养基重悬细胞。
  7. 将两种细胞组分（潘氏细胞或 Lgr5+ 细胞）合并至总体积为 20 µL 的体系中，室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
  8. 在室温下共同孵育潘氏细胞与 Lgr5+ 细胞 10 分钟。
  9. 小心吸除 10 µL 上清液，保留液面弯月面，确保不吸走细胞沉淀。
  10. 向细胞中加入 30 µL 重悬的基底膜基质，终体积为 40 µL，轻柔重悬细胞后接种至预热的 96 孔板中。10 分钟后，每孔加入 200 µL 完全培养基（参见 材料表）。每 48 小时更换一次培养基。
  11. 在第 5 天计数类器官形成数量。

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结果

类器官重建实验能够分别对肠上皮中关键的微环境和干细胞组分进行功能分析，此处通过小干扰RNA（siRNA）加以演示 Apc 基因

为实现这一目标，我们首先利用荧光激活细胞分选（FACS）分离8000 Lgr5+ 细胞和6000个来自近交系C57BL6/J小鼠的潘氏细胞。在 图1a，图示了ORA实验的流程图。类器官重建能力通过孵育来评估 Lgr5+ 靶向mRNA的siRNA寡核苷酸处理细胞 Apc 或包含作为对照的随机序列（SCR）。处理后，对经相同siRNA处理的 Lgr5+ 细胞直接接种于类器官培养基/重建基底膜中，或与等量未经处理的潘氏细胞共孵育后接种。作为对照，未经处理的 Lgr5+ 细胞单独接种...

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讨论

ORA 方法可对肠干细胞微环境的两个关键组分，即 Lgr5+ 细胞和潘氏细胞，进行精细的功能分析。我们及他人此前已采用过该方法，并进行了细微改进6,10,11。本文中，我们将 ORA 操作流程呈现为一种可重复且标准化的实验室方案。此外，我们以 Lgr5+ 干细胞中 Apc 基因下调为例，展示了对分选后的细胞组分实施遗传学（或生物化学6）改造的可能性。综合数据显示，通过 siRNA 介导的 Apc 基因敲低可增强 Lgr5+ 细胞的干细胞功能，这体现在类器官形成数量的增加上（图 1B）。

使用肠道三维类器官培养的多个优势已在综述中列出

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披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突

致谢

本研究由荷兰癌症协会（KWF；EMCR 2012-5473）和国际世界癌症研究基金会（WCRF；项目编号 2014-1181）的资助得以实现

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级DMEM F12 *Thermo Fisher Scientific12634-010
Glutamax *Thermo Fisher Scientific35050061终浓度：10 mM
青霉素/链霉素 *Thermo Fisher Scientific15140122终浓度：1%
Hepes *Thermo Fisher Scientific15630080终浓度：10 mM
重组小鼠EGF *Thermo Fisher ScientificPMG8041终浓度：50 ng/ml
重组小鼠Noggin *Peprotech250-38终浓度：100 ng/ml
y27632 *SigmaY0503终浓度：10 µM
Jagged-1 *Anaspec BioAS-61298终浓度：1 µM
重组小鼠R-spondin *R&D systems3474-RS-050终浓度：1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APCQiagenGS11789终浓度：100 nM
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
CD24 APCBiolegend101814
c-kit PEBiolegend105808
BV 421 CD31Biolegend102424
BV 421 CD45Biolegend103134
BV421 TER119Biolegend116234
HBSSThermo Fisher Scientific14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/JJackson Laboratories008875
低吸附离心管EppendorfZ666548-250EA
MatrigelCorning356230
* 这些试剂的组合构成完全培养基

参考文献

  1. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  2. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  4. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  5. Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32(2015).
  6. Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
  7. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965(2012).
  8. Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
  9. Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
  10. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
  11. Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).

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肠干细胞潘氏细胞Lgr5阳性细胞流式细胞术细胞分选隐窝分离单细胞制备类器官多重性Wnt信号通路
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