用于肠道干细胞与微环境细胞功能分析的类器官重建实验（ORA）

摘要

肠道类器官培养通常由完整的隐窝建立，无法实现对自我更新和分化过程的细胞特异性分析。本方案描述了分离纯化的干细胞（Lgr5⁺）和微环境细胞（潘氏细胞）的重建培养，这些细胞能够形成类器官，同时允许在培养前对其进行生化和遗传修饰，并开展功能分析。

摘要

肠上皮具有极高的更新速率。在哺乳动物中，整个上皮层可在4至5天内完成更新。成体肠干细胞位于利贝昆隐窝的底部，其特征是表达 Lgr5 基因，并通过其特征性的高增殖速率维持稳态¹在整个小肠中， Lgr5⁺ 干细胞与一种称为潘氏细胞的特化分泌细胞相互混杂。潘氏细胞分泌抗菌化合物（即，溶菌酶和隐窝素/防御素）对肠道菌群具有调控作用。最近，潘氏细胞被发现具有新的功能，即为干细胞微环境提供支持 Lgr5⁺ 通过Wnt3、EGF和Dll1等多个关键配体的干细胞².

当分离后 离体 在特定生长因子和细胞外基质成分存在下培养时，完整的肠隐窝可形成长寿且具有自我更新能力的三维结构，称为类器官，其形态高度类似于成年小肠的隐窝-绒毛上皮结构³类器官培养若由完整的隐窝建立，可用来研究肠干细胞微环境的自我更新与分化，但无法解析其各个组分（即）的各自贡献 Lgr5⁺ 和潘氏细胞。

本文介绍了一种新型类器官检测方法，该方法利用潘氏细胞与Lgr5⁺细胞在共培养条件下能够相互结合并形成类器官的特性。此方法在此称为"类器官重建检测"（ORA），可对潘氏细胞或Lgr5⁺干细胞进行遗传学和生物化学修饰，随后将其重建为类器官。因此，该方法可用于对肠干细胞微环境中的两个主要组分进行功能分析。

引言

肠上皮是哺乳动物体内更新速度最快的组织，因此成为大量研究的对象，这些研究旨在鉴定并功能表征位于Lieberkühn隐窝底部的成体干细胞，这些干细胞以表达特定标记分子为特征 Lgr5 基因且依赖于经典Wnt信号¹值得注意的是， Lgr5⁺ 干细胞由特化的微环境细胞包围并提供支持， 即 潘氏细胞，其成熟过程也依赖于Wnt信号通路²这两种细胞共同维持肠道上皮层的自我更新，并保持每日的稳态平衡： Lgr5⁺ 干细胞快速分裂，产生祖细胞及更特化的肠上皮细胞；潘氏细胞提供关键的微环境因子（例如，Dll1、Wnt3、EGF）至 Lgr5⁺ 干细胞²肠道隐窝接种后的增殖能力 离体 形成称为类器官的有序且具有自我更新能力的结构，或 "迷你肠道"，已被用作一种实验工具，以深入研究正常和病理条件下（包括癌症）的自我更新和分化等过程⁴已从多种组织（包括小鼠和人类样本的肠道、胰腺、肝脏和肾脏）成功建立类器官培养体系。⁴提取方法及用于建立这些类器官培养物的生长因子具有组织特异性，旨在促进多谱系分化，并尽可能模拟原始的干....

方案

所有操作均根据当地的动物福利法律法规和指南进行。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

1. 将一套肠剪、普通剪刀和镊子放入无菌容器中进行高压灭菌。
2. 将一个96孔（平底）培养板放入37 °C的培养箱中。
3. 根据材料表中列出的试剂，制备10 mL完全培养基。
4. 将完全培养基置于37 °C水浴中孵育。
5. 将重建的基底膜置于冰桶中解冻。重建的基底膜在4 °C时将变为液体状态。
6. 用4 °C的冷磷酸盐缓冲液（简称PBS）填充4个培养皿。

2. 小肠隐窝的分离

1. 使用 CO₂ 吸入法处死一只背景为 C57BL6/J 的 Lgr5-eGFP-IRES-CreER^t2 小鼠。用剪刀沿纵向解剖腹膜。
2. 用镊子夹住胃部，并横向将其切成两半。
3. 此后使用肠用剪刀，将肠道拉出并置于含有 PBS 的培养皿中。
   注意：肠用剪刀一端为锐利尖端，另一端为钝头。钝头设计用于在打开肠道时避免损伤隐窝-绒毛结构。
4. 首先将钝头插入胃部，轻柔地通过幽门推进。随后一边用剪刀剪开，一边用镊子牵拉。
5. 当整个小肠被纵向完全打开后，用镊子夹住组织，在冷 PBS 中以 U 形动作轻轻....

结果

类器官重建实验能够分别对肠上皮中关键的微环境和干细胞组分进行功能分析，本文通过Apc基因的小干扰RNA（siRNA）对此进行了演示。

为实现这一目标，我们首先利用荧光激活细胞分选（FACS）从近交系 C57BL6/J 小鼠中分离出 8000 个 Lgr5⁺ 细胞和 6000 个潘氏细胞。在图 1a中展示了 ORA 检测的流程图。类器官重建能力通过将 Lgr5⁺ 细胞与靶向 Apc mRNA 的 siRNA 寡核苷酸或含乱序序列（SCR）的对照 siRNA 共同孵育来评估。处理后，将经相同 siRNA 处理的 Lgr5⁺ 细胞直接接种于类器官培养基/重建基底膜中，或与等量未经处理的潘氏细胞共孵育后再接种。作为对照，将未经处理的 Lgr.......

讨论

ORA 方法可对肠干细胞微环境的两个关键组分，即 Lgr5⁺ 细胞和潘氏细胞，进行精细的功能分析。我们及他人此前已采用过该方法，并进行了细微改进^6,10,11。本文中，我们将 ORA 操作流程呈现为一种可重复且标准化的实验室方案。此外，我们以 Lgr5⁺ 干细胞中 Apc 基因下调为例，展示了对分选后的细胞组分实施遗传学（或生物化学⁶）改造的可能性。综合数据显示，通过 siRNA 介导的 Apc 基因敲低可增强 Lgr5⁺ 细胞的干细胞功能，这体现在类器官形成数量的增加上（图 1B）。

使用肠道三维类器官培养的多个优势已在综述中列出

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	终浓度：10 mM
青霉素/链霉素 *	Thermo Fisher Scientific	15140122	终浓度：1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	终浓度：10 mM
重组小鼠EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	终浓度：50 ng/ml
重组小鼠Noggin *	Peprotech	250-38	终浓度：100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	终浓度：10 µM
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	终浓度：1 µM
重组小鼠R-spondin *	R&D systems	3474-RS-050	终浓度：1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	终浓度：100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend	102424
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
低吸附离心管	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* 这些试剂的组合构成完全培养基