方法文章

非人类灵长类动物遗传学的大体积、行为相关光照

DOI：

10.3791/56330

⸱

2017年10月3日

 ,  ,  , 
1McGovern Institute, Massachusetts Institute of Technology, 2Harvard-MIT Division of Heath Sciences and Technology, 3Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 4Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 5Division of Pharmacoengineering and Molecular Pharmaceutics, UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, 6Media Lab and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology

本文内容

摘要

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建立了一个组织穿透照明灯的协议, 以提供光超过大体积的最小直径。

摘要

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该协议描述了一个大体积的照明灯, 这是为非人类灵长类大脑中的 optogenetic 操纵而开发的。照明灯是一种经蚀刻后的改性塑料光纤, 其发光表面积 #62; 100x。除了描述大容量照明灯的构造外, 本协议还详细介绍了用于确保均匀光分布的质量控制校准。此外, 该协议还描述了插入和移除大容量照明灯的技术。表面和深层结构都可以被照亮。这个大体积的照明灯不需要物理耦合到一个电极, 因为照明灯是由塑料, 而不是玻璃, 它会简单地弯曲的情况下, 传统的光纤将粉碎。因为这个照明灯提供光超过行为相关的组织体积 (≈ 10 mm3) 没有比传统的光纤更大的穿透损伤, 它促进行为研究使用遗传学在非人灵长类动物。

引言

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Optogenetic 工具, 允许毫秒精确, light-driven 神经元控制被广泛用于研究啮齿动物和无脊椎动物的功能生理学和行为。然而, 技术上的挑战限制了非人类灵长类大脑中遗传学的使用, 它的体积 ~ 100 x 大于啮齿动物的大脑1。

为了促进非人类灵长类动物的遗传学研究, 一个照明灯被设计来解决两个相互竞争的目标: 大体积光照和最小穿透损伤。以前试图解决其中一个问题的做法是代价高昂的。束纤维照亮更大的容量, 但以增加的直径, 并且, 因而, 损坏2,3。锥形玻璃纤维可减少穿透损伤, 但将光线聚焦到发光表面区域和 #60; 100 µm2 4,5。外部的大脑照明通过一个窗口的硬脑膜绕过的挑战, 穿透伤害和可能允许大体积照明, 但它只能用于一些肤浅的大脑区域6。

为了创建一个大体积, 小直径的照明灯 (图 1a), 塑料光纤的尖端是热锥和核心和熔覆蚀刻 (图 1b....

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方案

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注意: 所有动物程序都符合 NIH 的指导方针, 并获得了麻省理工学院动物保育委员会的批准.

1. 照明灯制作

  1. 使用一对锋利的剪刀切割250和 #181 的部分; m 直径塑料光纤, 至少10厘米长于所需总照明长度.
  2. 从塑料光纤的一端取下 15-20 厘米的聚乙烯护套, 使用22口径的钢丝剥皮器.
  3. 在表虎钳钳夹中保护纤维的最远端 3-5 厘米的末端.
  4. 握住纤维的一端紧扣在一只手固定的稳定拉。纤维应平行于地板, 垂直于副。在整个加热和冷却过程中保持纤维的恒定张力 (下面的步骤1.5 和 1.6), 使纤维保持平直和绷紧.
  5. 使用双温热枪的最低设置 (570/1000 和 #176; F), 将纤维的剥离部分加热到直径为 60-100 和 #956; m, 或关于人的头发的直径.
  6. 保持纤维上的恒定张力, 同时让纤维冷却。如果不保持张力, 可能会导致纤维卷曲.
  7. 在解剖显微镜下确认变薄尖端的直径。另外, 你可以使用卡尺代替。
    1. 如果光纤不够薄, 请根据需要重复步骤1.4 到1.6 以达到所需的笔尖直径.
    2. 可选如果 re-pulling, 则在纤维的最窄部分放置一个小标记, 如果它再次加热, 使热枪的中心目标是纤维的最窄部分.
    3. 如果纤程太薄, ....

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结果

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在非人灵长类动物的大脑容量的照明允许行为相关的 optogenetic 操作。Acker et al.(2016) 使用这个大容量的照明灯与红色被转移的 Halorhodopsin, 下颌7研究前额眼睛领域的世俗贡献 (FEF) 到记忆被引导的扫视在二只恒河猴。具体来说, FEF 神经元注射了一个含有颌骨的病毒载体, 然后用红光照亮, 在目标表示、延迟周期或记忆引导的扫视任务的运动准备期间, 使用大体积的照明灯。8.图 3显示了实验条件。错误率 (例如, 无法执行内存引导的扫视到适当的目标位置) 在注入的接收字段中的目标的光照显著增加, 但不针对失活/光照位置的目标。(图 4a)。

除了遗传学引起的行为改变外, 大体积的照明灯还允许在整个 2.5 mm 的皮层 (图 4c) .......

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讨论

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虽然 optogenetic 工具被广泛用于研究啮齿类动物的疾病和生理学, 但对大脑大容量的照明技术的挑战限制了非人类灵长类动物的遗传学的使用。在猴子的开创性研究中使用了大的光功率密度 (~ 100 兆瓦/毫米2到20瓦特/毫米2) 来照亮小容量, 也许和 #60; 1 mm3, 并报告了轻微的行为影响与兴奋 opsins 在皮层4, 9、10、11和在高级丘12中的抑制视。

因此, 开发了一个大体积的照明灯, 允许光传递到大的组织体积。与这个照明灯和红移 halorhodopsin, 颌骨, 强健, optogenetically 驱动行为观察非人灵长类动物8。

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致谢

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LCA 承认来自 NDSEG 奖学金, NSF GRFP, 和麦戈文研究所的朋友的资助。EP 承认资助哈利和尤尼斯 Nohara UROP 基金, 麻省理工学院的 1995年 UROP 基金, 和麻省理工学院 UROP 基金。ESB 承认来自 NIH 2R44NS070453-03A1、"让哈维奖" 和 "纽约干细胞基金会-罗伯逊奖" 的资助。RD 承认来自 NIH EY017292 的资金。迈克尔. 威廉姆斯在拍摄前帮助团队组织和收集补给品。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
塑料光纤工业光纤SK-10250 微米直径，超级 Eska 线
剥线钳Klein Tools1104722 号
虎钳Wilton11104通用台式安装虎钳
双温热风枪Milwaukee8975-6570 / 1,000 °F
实验室标记VWR52877
解剖显微镜VistaVision82027-156立体显微镜，带双白炽灯，2X/4X 放大倍率，可从 VWR
实验室胶带VWR89097-9724 包紫色;然而，胶带颜色无关紧
碳化硅研磨片ThorLabsLF5P5 微米粒度，10 包
氧化铝研磨片ThorLabsLF3P3微米砂砾，10片装
氧化铝研磨片ThorLabsLF1P1微米砂砾，10片装
煅烧氧化铝研磨片ThorLabsLF03P0.3微米砂砾，10片装
热刀工业光纤IF37001260瓦，重型
光纤检测范围ThorLabsFS201可选
不锈钢套圈精密光纤MM-FER2003SS-265265 微米内径
1 mL 注射器BD14-823-30Luer-lok 尖端可降低泄漏风险，但并非绝对需要
塑料环氧树脂工业光纤40 0005
18 号钝针BD3051801.5 英寸长度
无绒湿巾 （KimWipe）ThorLabsKW32可从许多供应商处获得
轻质吸光箔ThorLabsBKF12
电工胶带3MTemflex 1700可选，可替代其他品牌/型号
26 号锋利针 BD3051110.5 英寸长
微作器Siskiyou70750000E可以替代其他品牌/型号
立体臂Kopf1460可以替代其他品牌/型号
激光安全护目KenTeKKCM-6012必须根据所用激光的颜色进行选择，此处给出的示例
激光或其他光源涡流Stradus 473-50蓝色激光示例
积分球ThorLabsS142C附带的功率计，也可从 ThorLabs 获得，项目
#PM100D Ultem 记录室Crist 仪器公司6-ICO-J0定制带对准槽
口的塔式微型驱动器NANDRTBL-CMS
导管定制N/A由 25 号脊髓针 （BD） 或钝管制成
NAN 驱动系统NANNANDrive
可根据定制计划
钝钳FischerScientific08-875-8A通用不锈钢钝钳
数字卡尺Neiko01407A在 amazon.com 上可用。可以选择更精细的分辨率卡尺以进行更精确的测量。
跳线ThorLabsFG200LCC定制这是许多可能的跳线中的一个例子。只要光纤直径小于或等于大容量照明器的光纤直径，并且只要连接器接口，任何跳线（玻璃或塑料、供应商购买或在实验室制造）都适合此应用。
透明塑料防尘帽ThorLabsCAPF25 个
陶瓷分体式配对套管Precision Fiber Products， Inc.SM-CS1140S
获得 要 的镜 要求提供定制网格设计 包装

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).
  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optoge....

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