应用肺转移法研究骨肉瘤转移性肺定植的实用思考

Summary

本文的目的是为肺转移试验 (美洲狮) 的协议提供详细的描述。该模型允许研究人员使用 widefield 荧光或共聚焦激光扫描显微镜研究肺组织中的转移性骨肉瘤 (OS) 细胞生长。

Abstract

肺转移试验 (彪马) 是一种体外肺外植体和封闭细胞培养系统, 允许研究人员通过荧光显微镜研究骨肉瘤 (OS) 的肺定植生物学. 本文详细描述了该协议, 并讨论了使用 widefield 或共聚焦荧光显微镜平台获取转移生长图像数据的示例。美洲狮模型的灵活性使研究人员不仅可以研究在肺部微环境中的 OS 细胞的生长, 而且还可以评估随着时间推移抗转移治疗的效果。共焦显微镜允许前所未有的高分辨率成像的 OS 细胞相互作用的肺实质。此外, 当美洲狮模型与荧光染料或荧光蛋白基因记者相结合时, 研究人员可以对转移的 OS 细胞的肺微环境、细胞和亚型结构、基因功能和启动子活动进行分析。美洲狮模型提供了一个新的工具, 骨肉瘤研究人员发现新的转移生物学和评估活动的新型抗转移, 靶向治疗。

Introduction

改善儿童转移性骨肉瘤 (OS) 患者的预后仍然是一个关键的未满足的临床需要¹。这突出了发展新的分子靶向治疗的重要性。常规化疗靶向肿瘤细胞增殖没有证明是有效的治疗转移性疾病, 因此, 新的战略必须针对转移过程本身²。本文讨论了一种相对较新型的体外肺转移模型、门多萨和同事 ³开发的肺转移试验 (彪马) 的实际应用, 为发现新的操作系统中肺转移进展的分子驱动程序^4,5。然而, 在继续之前, 应该谨慎地简单地接触几种目前的转移模型, 以及美洲狮模型如何比传统的体外检测提供了一些优势。

大多数用于研究转移的实验模型包括体外和体内系统, 它概括了转移级联的特定步骤或几个步骤。这些步骤包括: 1) 肿瘤细胞从原发肿瘤转移到附近的血管 (血液或淋巴) 和转运内的中转, 3) 在第二部位的拘捕, 4) 在次生部位的渗出和存活, 5) 形成淋巴结和 6) 成长为血管化转移 (图 1)。体外模型的转移可以包括2维 (2D) 迁移和3维 (3D) 胶入侵检测, 并在其他地方详细审查⁶。对于体内模型, 两种常用的模型系统包括: 1)自发性转移模型是将肿瘤细胞原位注射到特定组织类型中, 形成局部肿瘤, 自发地脱落转移细胞。到遥远的地点;2)实验性转移模型是将肿瘤细胞注入靶器官上游血管的地方。例如, 肿瘤细胞的尾静脉注射导致发展肺转移瘤^5,7,8。其他实验性转移模型包括将肿瘤细胞注入脾脏或肠系膜静脉, 导致肝转移的发展^9,10。韦尔奇¹¹详细讨论了这些体内模型的实际注意事项。另一个用于研究小儿肉瘤转移的体内模型是肾肾包膜下肿瘤植入模型, 它导致局部肿瘤形成和自发转移到^肺部12, 13.更技术上苛刻的技术, 如活体 videomicroscopy 可以直接可视化, 实时, 转移癌细胞与转移部位 (即肺或肝脏) 的微血管的相互作用, 如麦克唐纳¹⁴和 Entenberg¹⁵, 或胚膜中的癌细胞渗出, 如 Kim ¹⁶所述。

美洲狮模型是一个前体,肺组织外植体, 封闭培养系统, 其中荧光肿瘤细胞的生长可以通过荧光显微镜在一个月内纵向观察 (见图 2A)。该模型概括肺定植的初始阶段 (步骤3至 5) 在转移级联。美洲狮模型优于传统的体外模型的一些主要优势是: 1) 它提供了一个机会, 纵向测量转移癌细胞生长在3D 微环境中, 保留许多特点的肺部微环境在体内 ³;2) 美洲狮允许研究人员评估在3D 肺微环境下, 候选基因或药物治疗的击倒是否具有抗转移活性;3) 美洲狮模型具有多种类型的荧光显微平台 (图 2B) 的灵活性, 如 widefield 荧光显微镜或激光扫描共焦显微术, 其中的示例显示在图 2C & D中,分别.本文将讨论如何使用美洲狮模型获得的纵向成像数据的转移生长的增强绿色荧光蛋白 (eGFP) 表达, 人高和低转移性骨肉瘤细胞 (MNNG 和居屋细胞, 分别) 使用低放大 widefield 荧光。用共聚焦激光扫描显微镜对美洲狮模型中的线粒体进行标记的荧光染料的成像实例, 并对其进行了研究。

Protocol

获得影像数据的所有动物协议均经国家卫生研究院国家癌症研究所动物护理和使用委员会批准。在文章视频中讨论和描述的所有动物协议都已被英属哥伦比亚大学动物保育委员会批准。

1. 注射用肿瘤细胞和美洲狮模型材料的制备

注意: 对于1鼠标, 解决方案和单元格的数量将足够。如果在研究中使用更多的小鼠, 就需要扩大。对于媒体食谱, 请参阅表 1和表 2。

1. 在 37 ^oC 水浴中, 在15毫升锥形管中预热5毫升的 a 介质。
2. 使用实验室微波熔融1.2% 低熔点琼脂糖溶液 (在无菌水中)。
3. 将5毫升的熔融琼脂糖转化为15毫升锥形管, 并在 37 ^oC 水浴中保持温暖。确保融化的琼脂糖是在 37 ^oC 和液体之前, 肺喷洒步骤。
4. 预冷30毫升细胞培养级 PBS 补充与1X 笔/链球菌在一个冰桶。
5. 在6井板的一个井中, 预浸泡1.5 毫升 B 介质中的明胶海绵。海绵将是肺切片的支撑锚。
6. 确保操作系统单元格在过程的当天大约70-90% 汇合。不要使用过度汇合的细胞, 或者如果媒体是橙色到黄色, 因为细胞通常被强调并且在这一点上降低了生存能力。对于骨肉瘤细胞系, MNNG 和居屋, 5 x 10⁵在一卷 100 ul 将被用来注入到尾部静脉的1鼠标。因此, 如果更多的老鼠被用于研究, 那么高档。
7. 用0.25% 胰蛋白酶-EDTA (3 毫升的 T75 烧瓶或2毫升的10厘米培养皿) 收割肿瘤细胞。当细胞开始从盘子中抬起时, 用完全的培养基中和胰蛋白酶-EDTA。旋转细胞和冲洗一次与细胞培养级 PBS。并用重悬颗粒在5毫升的 PBS。
8. 按标准方法执行单元格计数。最好是做更多的细胞悬浮比实际需要的, 因为细胞悬浮脱落往往发生在针的绘制和失败的注射尝试。
9. 对细胞悬浮的样品进行台盼蓝排斥试验, 以评估细胞的生存能力。仅当单元格显示90% 的生存能力或更高时才进行。
10. 在 100 ul 的卷中注入 5 x 10⁵单元格。要准备超过2X 的这一量, 1 x 10⁶细胞应该被旋转下来, 并悬浮在0.2 毫升的 HBSS 中。
11. 在准备注射的小鼠时, 将细胞悬浮在冰桶中。

2. 尾静脉注射和肺喷洒

注意: 本节中的解决方案和单元格的数量将足够1鼠标。如果在研究中使用更多的小鼠, 就需要扩大。有关以下步骤中使用的设备、材料和外科工具的列表, 请参阅表 3和表 4。

1. 温暖一只雌性老鼠 (年龄6-8 星期) 在热化灯之下为5分钟为了使他们的尾巴静脉更加明显地明显。对于小鼠 K7M2 或 K12 细胞, 使用 Balb/c 鼠;对于人类 MG63.3、MG63、MNNG 和居屋细胞, 使用严重的联合免疫缺陷小鼠。
2. 通过轻轻摇动管子, 确保细胞悬浮均匀。小心地将细胞悬浮在没有针头的1毫升注射器中。用27口径针把注射器盖上。确保针锥与针上的音量标记在同一侧。
3. 将鼠标放在抑制剂中, 用酒精擦拭拭尾。
4. 进行尾静脉注射, 并注射 100 ul 的细胞悬浮。注射后5分钟, 将鼠标放置在 CO₂室中, 并开始安乐死标准操作程序 (如您的机构动物护理委员会的大纲)。颈椎脱位不应作为安乐死的手段, 因为手术会损害气管。
5. 一旦老鼠被安乐死, 开始准备的层流罩为喷洒的小鼠肺与琼脂糖/A 介质溶液。在层流罩内, 设置一个工作区与您的消毒垫。在这个垫子上, 你将放置你的消毒仪器, iv 导管, iv 延伸集, 和重力灌注装置 (参见补充图 1)。
6. 把鼠标放在背 recumbancy。用无菌小剪刀, 仔细解剖出胸骨, 露出胸腔。注意不要刺穿肺部, 因为琼脂糖/A 介质溶液将被用来 insufflate 肺。
7. 解剖胸骨时, 解剖过胸口两侧的气管。通过解剖周围的软组织来暴露气管。
8. 用20口径静脉注射导管 Cannulate 气管。用无菌线缝合在空心气管周围的外科结。
9. 将 IV 延伸集从插管气管连接到重力灌注装置的10毫升注射器。
10. 将预热后的 37 ^oC 琼脂糖 (5 毫升) 和 a 介质 (5 毫升) 组合成1:1 混合物。将液体琼脂糖/A 介质溶液倒入重力灌注装置的10毫升注射器中。在喷洒肺前用琼脂糖/a 介质溶液, 确保延长集的整个长度已被琼脂糖/a 介质, 从而否定无意喷洒肺标本与空气。
11. 填充肺琼脂糖/A 介质溶液, 直到肺完全 insufflated。
12. 一旦肺完全 insufflated, 取出套管并牢固地栓在手术结上, 防止 agarase/A 介质溶液通过气管渗漏。
13. 从胸腔切开 (气管、心脏和肺部)。注意不要刺穿或损坏肺部的表面。
14. 将采摘 (在没有特定方向) 在预冷30毫升的 PBS 补充与1X 笔/链球菌, 并允许琼脂糖/A 介质固化20分钟。
15. 使用细剪刀和镊子, 切割小块的肺 (3 毫米 x 1.5 毫米), 如图 1A所示。更小的肺切片可以很容易地成像使用2.5X 目标。每个实验条件下可以切割多个切片, 每个组通常为4-10 切片。
    注: 对于每个实验组, 将肺切片放入一个单独的井 (6 井板) 中, 其中含有 2 x 2 厘米的明胶海绵, 预浸泡在 B 介质中。每个井的介质数量应该是1.5 毫升。每2-3 天更换一次媒体。对于药物研究, 改变媒介/药物的频率是用户确定的。

3. 肺切片的 Widefield 荧光成像及分析

注: 对于 widefield 荧光成像, 更小的切片被切割 (3 毫米 x 1.5 毫米 x 1 毫米), 以适合肺部分成1图像使用2.5X 的目标。

widefield 荧光显微镜上的图像采集:

1. 肺部切片通常在注射后0、3、7和14天进行成像。在生物橱柜的无菌环境中, 小心地将肺切片从明胶海绵转移到无菌的35毫米玻璃底圆碟。注意从肺部切片中抹去多余的液体, 因为多余的液体会作为镜子, 反射来自肿瘤细胞的荧光光。
2. 按图 1A中描述的类似方式排列肺切片。每一列将代表不同的实验条件。小心不要用镊子把肺部弄脏。在处理另一实验组的肺切片前, 用70% 乙醇冲洗并干燥。
3. 优化成像参数 (即增益, 偏移, 曝光时间, binning), 提供最佳对比的荧光肿瘤细胞和背景肺组织在控制 (车辆未经治疗) 组。使用控制组中的相同参数对实验组进行图像处理。另存为 tiff 图像格式。
4. 对于刻度引用, 请在同一目标上以千分尺的数字图像。
5. 随着时间的推移, 肺部自动荧光的变化, 成像参数必须调整到控制肺部每一个成像会话。一个会话的成像参数不一定是后续映像会话的最佳选择。

图像分析:
注意: 下面的图像处理步骤是使用 ImageJ 1.51h 软件包¹⁷完成的。

1. 在 ImageJ 中打开图像文件 (图 3A)。
2. 减去背景: 过程 > 减去背景 > 滚动球半径 (从50像素开始), 取消选中 "浅色背景" (图 3B)。
3. 将图像转换为8位格式: 图像 > 类型 > 8 位 (图 3C)。
4. 将单位设置为像素: 图像 > 在长度单位中输入 "像素", 在 "像素宽度"、"像素高度"、"体素深度" 中输入1。选中 "全局" 框可应用于后续图像。
5. 使用多边形选择工具, 勾勒出整个肺切片的形状, 并确定总肺切片的面积 (像素²)。这个值将用于计算肺的肿瘤负担百分比。
6. 阈值图像: 图像 > 调整 > 阈值 > 突出显示 "默认" 和 "B & W" > 使用滑块阈值的图像, 使大多数肿瘤细胞被准确地强调。按下 "应用" 将导致黑色和白色的图像, 其中肺全是黑色的, 荧光损伤是白色的 (图 3D)。第二次按下 "应用" 将反转所有荧光结构现在为黑色形状的图像 (图 3E)。
7. 病变数量和形状的量化:
   分析 > 设置测量 > 检查 "区域"。取消选中所有其他框。
   分析粒子 > 大小 (像素²): 0-无穷大表示 ImageJ 将枚举的形状范围。经验主义地确定最小的病变, 被认为是一个单一的肿瘤细胞在0天的车辆图像。使用此单个肿瘤细胞的面积作为数据集中剩余图像的下限。对于本文所介绍的工作, 11 像素²设置为下限。对于视频示例中显示的工作, 24 像素²设置为下限。将 "循环" 范围保留为0-1。"显示" 可以设置为 "无"。或者, 如果选择了 "显示" 和 "轮廓", 则会生成所有轮廓形状的绘图。检查 "显示结果" 以单独的测量窗口弹出。如果选中 "添加到管理器" 复选框, 则会将所有量化的形状保存到 ROI 管理器中, 这可以保存以供将来参考。按 OK 后, 将弹出一个 "结果" 窗口, 其中包含所有枚举的形状和区域度量 (图 3F)。
8. 将数据从 "结果" 窗口复制并粘贴到电子表格中。使用 Excel 中的 sum 数学函数对该特定肺切片的转移病灶的所有区域求和。目的: 评价肺切片肺肿瘤负荷的百分比, 将转移性病变面积与肺切片总面积的总和分开。此参数也称为区域分数 (_a), 由安德伍德¹⁸进一步描述。
   肺肿瘤负担 = 转移病灶面积总和/肺切片总面积
9. 计算对照组和其余组肺部分的肺肿瘤负担。绘制每组 0, 3, 7 和14天的平均肺肿瘤负担。代表 widefield 荧光图片的高和低转移人 OS 细胞生长在美洲狮模型在渐进时间点显示 (图 4A)。显示的折线图显示的褶皱变化 (规范化到0天) 在转移肿瘤负担的百分比随着时间的推移, 表明 (图 4B)。

4. 美洲狮模型的共焦荧光成像

注意: 对于共焦成像, 组织处理类似于前一节, 除了更大的肺切片被切割 (完整的横断面, 1-2 毫米厚), 以允许更多的 ROIs 被成像。

DAR4M 肺实质标签:

1. 浸泡肺部切片在10μμM 的 DAR4M (在 HBSS) 45 分钟37摄氏度。DAR4M 在肺细胞内标记活性氮种类。
2. 45分钟的孵化后, 用新鲜的 HBSS 冲洗肺部切片。
3. 将肺切片放置在35毫米的玻璃杯底圆碟上, 并在共焦显微镜上进行图像处理。
4. 图 5中显示的示例图像的图像参数列在表 5中。
5. 为感兴趣的区域获取 Z 堆栈。使用建议的 Z 切片厚度进行采样。影片 1和补充影片 1中提供了一个显示 DAR4M-labeled 肺组织中绿色荧光 OS 单元格的3D 堆栈的代表性影片。

对于图 5中显示的共焦图像示例, 成像会话是终端。如果需要纵向成像, 则建议使用2光子或多光子设备的共聚焦 LSM 显微镜进行成像, 因为活组织的光损伤少了 19, 20.
在美洲狮模型中表达 MG63 细胞的 RFP:

1. 在步骤1和2中使用 MG63 细胞表达美图-RFP 结构, 执行美洲狮协议作为大纲。
2. 将肺切片放置在35毫米的玻璃杯底圆碟上, 并在共焦显微镜上进行图像处理。
3. 图 6中显示的示例图像的图像参数列在表 6中。影片 2和补充影片 2中提供了一个具有红色荧光线粒体的绿色荧光 OS 单元格的3D 堆栈的代表性影片。

Results

低放大 widefield 荧光显微术

对于美洲狮肺切片的 widefield 荧光显微镜, 有代表性的图像和量化数据显示在图 2C中,图 4A和B。转移倾向为高和低转移的细胞线在视觉上是明显的在进步时间点。MNNG 细胞可以有效地对肺组织进行殖民, 而居屋细胞根本不能生长。从图像分析中, 可以获得量化数据以评估时间的增长, 如图 4B图所示。为了在一个图像中捕获整个肺切片, 在低放大倍数 (2.5X) 的情况下进行采集是可取的。这种方法允许批量成像大量的美洲狮切片。

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Discussion

以下技术文章描述了美洲狮模型在研究 OS 中肺定植的一些实用方面。在《议定书》中, 研究人员应格外注意的一些关键步骤包括以下几个方面:

a) 气管插管。气管在解剖周围的肌肉和结缔组织时容易受损。此外, 导管针可以很容易地通过气管。在插入套管时要密切注意针的斜角如何进入气管。

b) 刺穿或损害肺部的表面。肺可以很容易刺穿或损坏的解剖剪刀, 而删除胸骨和暴露胸腔。解剖取出胸腔的拔牙时要小心。穿刺或损害肺部的表面会导致液体琼脂糖/A 介质泄漏, 肺部会被充气。

c) 在成像时删除肺部部分的多余介质.在显微镜下观察到肺部部分周围的过量液体介质会引起 "镜面" 效应。过量的液体可以反射来自肿瘤细胞的荧光光, 从而夸大图像中的荧光区域。去除多余的介质流体将会阻止图像中的此伪影。或者, 图像工件可以在图像的后期处理过程中被删除。

d) 光损伤的生物组织。当使用1光子显微镜的水银灯泡或激光器时, 一定要限制暴露在光...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
表 2
用于 A 培养基、B 培养基和完全培养基的细胞培养试剂
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	高度转移性 OS 细胞系
HOS	ATCC	CRL-1543	不良转移性 OS 细胞系
MG63.3	Amy LeBlanc 实验室 （NCI）	N/A	高度转移性 OS 细胞系
MG63	ATCC	CRL-1427	低转移性 OS 细胞系
10X M199 培养基	Thermofisher	11825015	A 培养基和 B 培养基的基础培养基
蒸馏水（灭菌）	Thermofisher	15230-147	A 培养基的成分 &B 培养基
7.5% 碳酸氢钠溶液	Thermofisher	25080094	A-培养基和B 培养基
氢化可替酮	Sigma-Alrich	H6909	A-media 的成分 &B 培养基
醋酸视黄醇 - 水溶性	Sigma-Alrich	R0635-5MG	A-培养基的成分 &B 培养基
青霉素/链霉素 10X 浓缩 （10000 U/ml） 溶液	Thermofisher	15140122	A 培养基的成分 &B 介质、完整介质。
牛胰岛素溶液 （10mg/ml）	Sigma-Alrich	I0516-5ML	A-培养基组分 &B 培养基
DMEM，高葡萄糖	Thermofisher	11965092	完全培养基
L-谷氨酰胺 （200 mM）	Thermofisher	25030081	培养基
胎牛血清	Thermofisher	16000044	完全培养基
的成分 Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水	Thermofisher	14190144	用于细胞培养。
汉克s 缓冲盐溶液，无钙、无镁、无酚红	Thermofisher	14175095	用于注射前重悬细胞沉淀
胰蛋白酶-EDTA （0.25%）、酚红	Thermofisher	25200114	用于细胞培养。
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	用于标记肺实质。
名称	公司	目录号	注释
表 3
PuMA的材料
Zeiss 710 共聚焦LSM	蔡司	N/A	立式LSM共聚焦材料显微镜
蔡司 780 共聚焦 LSM	蔡司	N/A	倒置 LSM 共聚焦显微镜
SCID 小鼠	Charles River	N/A	NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl，女性，年龄 6-8 周
GelFoam	哈佛仪器	59-9863	用作肺组织切片的支持。
SeaPlaque 琼脂糖	Lonza	50100	在肺吹入期间使用。
1 ml 注射器，带 27 号针头	Fisherscientific	14-826-87	用于尾静脉注射。
10 ml 注射器	BD	309604	用于肺的吹入。
20 号导管	Terumo	SR-OX2032CA	在肺吹气时使用。
Abbott IV 延长套件（30 英寸，无菌）	Medisca	8342	在肺吹入期间使用。
酒精棉签	BD	326895	注射前擦拭尾静脉
无菌手术手套	Fisherscientific	随大小变化	鼠肺的怀疑性处理
30 厘米尺	订书钉		用于肺吹入。
子 Pipette.com	HS29022A	支撑架	用于肺的吹气。
35 毫米玻璃底培养皿	Ibidi	81158	用于肺切片成像
带防水防潮层的吸收性底垫	VWR	56617-014	用于衬砌生物罩中的无菌工作区域。
肠线普通吸收缝合线	Braun	N/A	用于系结空心气管。
名称	公司	目录号	注释
表4
PuMA手术器械
微型解剖剪刀3.5"直锐器/锐器	Roboz	RS-5910	用于切割
4" 肺切片（10 厘米）长锯齿直超精致 0.5 毫米尖端	Roboz	RS-5132	用于作/固定肺切片。
4 英寸（10 厘米）长锯齿状轻微曲线 0.8mm 尖端	Roboz	RS5135	用于作/保持肺切片。
拇指敷料镊子;锯齿;嫩;4.5 英寸长度;1.3 mm 尖端宽度	Roboz	RS-8120	用于一般解剖。
拇指敷料钳 4.5" 锯齿状 2.2 mm 尖端宽度	Roboz	RS-8100	用于一般解剖。
超细微型解剖剪刀 3.5" 直锐/锋利，20 毫米刀片	Roboz	RS-5880	用于一般解剖。
Knapp 剪刀;直;夏普-布朗特;刀片长度 27 毫米;4" 总长度	Roboz	RS-5960	用于一般解剖。