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方法文章

在癌细胞系中条件性敲低基因表达以研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集

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DOI：

10.3791/56333

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2017年11月23日

 , 
1Division of Hematology, Oncology and Blood and Marrow Transplantation, Department of Pediatrics, University of Southern California, 2The Saban Research Institute of Children's Hospital Los Angeles, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Southern California

通讯作者： Marta H. Kubala <mkubala@chla.usc.edu>

本文内容

摘要

本方案旨在介绍如何在癌细胞系中建立功能性Tet-ON系统，并进一步应用该系统，特别是用于研究肿瘤细胞来源的蛋白质在单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境募集过程中的作用。

摘要

通过siRNA和shRNA介导的基因表达敲低（KD）方法是研究基因和蛋白质功能的重要工具。然而，当目标蛋白的敲低对细胞具有致死效应，或预期的敲低效应具有时间依赖性时，非条件性敲低方法则不适用。在这些情况下，条件性系统更为合适，并已受到广泛关注。这些系统包括蜕皮激素诱导型过表达系统、细胞色素P-450诱导系统1以及四环素调控的基因表达系统。

四环素调控的基因表达系统可通过四环素存在时诱导shRNA表达，从而实现对蛋白质表达的可逆性控制。在本实验方案中，我们介绍了一种在人源癌细胞系中使用功能性Tet-ON系统进行条件性基因表达调控的实验设计。随后，我们展示了该系统在肿瘤细胞与单核细胞相互作用研究中的应用。

引言

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）通过促进肿瘤生长、转移以及调控免疫反应，参与肿瘤的发展过程2癌细胞招募炎性单核细胞，这些细胞浸润肿瘤并分化为促肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）3肿瘤中TAMs的浸润与较差的临床预后相关，并且与巨噬细胞的免疫抑制作用有关4,5然而，肿瘤招募巨噬细胞的机制尚未得到充分研究，深入理解相关通路对于推动该领域发展及开发有前景的治疗策略至关重要。研究肿瘤微环境（TME）中肿瘤细胞与正常细胞相互作用的一个挑战在于所涉机制和细胞类型的复杂性，这需要 体外 能够解析这种串扰的多种方法。本文介绍了一种多功能方法，可用于研究癌细胞分泌的蛋白质对其他细胞类型（如巨噬细胞）迁移的旁分泌效应。 体外利用一个由四环素诱导型启动子调控的系统，针对癌细胞来源的、参与单核细胞募集的蛋白表达shRNA，定量分析该分泌蛋白对单核细胞的旁分泌作用。本方案中，首先介绍将shRNA序列克隆至四环素调控载体，随后构建稳定的癌细胞系。此外，通过纯化原代人单核细胞并采用Boyden小室实验，分析癌细胞来源蛋白对单核细胞迁移的旁分泌效应。 关键词：shRNA，四环素诱导型启动子，旁分泌作用，癌细胞，单核细胞募集，Boyden小室实验，原代人单核细胞，稳定细胞系

下调蛋白编码基因的表达通常采用siRNA和shRNA技术，但这些方法在应用上也存在一定的局限性。长期的基因敲低（KD）可能引发细胞的继发性适应性反应，从而干扰实验结果。由于缺乏对基因表达的时间控制，研究蛋白质在时间进程中的动态作用或对细胞存活至关重要的蛋白质功能变得具有挑战性。这一问题在体内（in vivo）实验中尤为突出，例如在肿瘤发生和进展过程中，可能需要在肿瘤建立之后才下调目标蛋白的表达。条件性敲低的优势在于可避免基因敲低过早导致细胞死亡，从而能够在肿瘤生长的不同阶段分析该蛋白的作用；而无条件的敲低可能导致肿瘤无法形成。

为了克服稳定敲低（stable KD）的局限性，已开发出多种条件性敲低（conditional KD）系统。条件性基因表达系统包括蜕皮激素诱导型过表达系统、细胞色素P-450诱导系统1以及四环素调控的基因表达系统。其中，四环素调控的基因表达系统可通过添加抗生素四环素（或其更稳定的类似物——多西环素）来控制shRNA的表达。在Tet-ON系统中，加入四环素或多西环素可诱导shRNA表达，从而实现目标基因的表达敲低；而在Tet-OFF系统中，四环素的存在会抑制shRNA的表达，从而允许基因表达。然而，已有报道指出四环素诱导系统存在一个缺点，即在未添加多西环素时shRNA仍存在基础水平的低量表达，称为“渗漏表达”（leakiness）6,7。在本文所述的Tet-ON系统中，给予四环素后，持续表达的四环素阻遏蛋白（TetR）与目标shRNA的H1启动子区域内四环素响应元件（TRE）序列的结合被抑制，从而启动shRNA的表达，并以四环素依赖的方式抑制目标蛋白的翻译8,9。

其他可用的 Tet-ON 系统包括 Chan et al. 开发的同时将 TetO 序列敲入 TATA 框与近端序列元件（PSE）之间以及 TATA 框与转录起始位点之间的系统10。该系统仅需低于毒性剂量的四环素即可调控 shRNA 表达，但在非诱导状态下仍存在低水平的 shRNA 表达。基于 Krüppel 相关盒（KRAB）的 Tet-ON 系统11 包含 KRAB（一种锌指蛋白），可使位于 KRAB 结合位点 3 kb 范围内的基因受到转录抑制。嵌合蛋白 tTRKRAB 能够结合 TetO，由于其具有较大范围的 DNA 调控能力，TetO 无需局限于转录起始位点与启动子之间，且对启动子活性影响较小。据报道，该可控 RNA 干扰系统在非诱导状态下 shRNA 的泄漏表达水平较低11,12；然而，该系统需要采用顺序性的双载体克隆策略。与先前开发的条件性敲低系统（如蜕皮激素诱导过表达系统或细胞色素 P-450 诱导系统）相比，四环素调控系统具有更强的稳健性和可逆性优势，因此是目前最常用的系统13。本实验方案所使用的系统相较于双 TetO 敲入系统和 KRAB Tet-ON 系统具有优势，因其仅需简单的单载体克隆，可快速构建多个克隆，且在无多西环素存在时表现出极低的泄漏表达水平。

肿瘤微环境（TME）对癌症的发展至关重要。为促进肿瘤生长，癌细胞通过分泌趋化蛋白招募炎症性单核细胞。被招募的单核细胞浸润肿瘤并分化为具有促瘤作用的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），从而促进肿瘤生长和转移。 体外 研究免疫细胞募集通常采用迁移实验，其中博伊登小室实验被广泛应用14,15,16,17在此实验中，将趋化蛋白来源（例如癌细胞或纯化蛋白）置于下室，免疫细胞则置于上室，上下室之间由多孔膜隔开。细胞会向趋化因子浓度梯度升高的方向迁移，穿过膜并到达下侧，随后对膜下侧的细胞进行染色，并在显微镜下计数。本文通过构建稳定且可诱导的癌细胞系，利用多西环素诱导调控纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）的表达，检测PAI-1对单核细胞的趋化功能。我们采用人原代单核细胞进行Boyden小室迁移实验，以评估PAI-1在单核细胞迁移中的作用。已有研究报道，人原代单核细胞与常用的单核细胞系（如THP1）之间存在差异，包括细胞因子表达模式的不同。18例如，THP1细胞中TNF-α表达水平较人单核细胞增加5至10倍19THP1 细胞源自人单核细胞型白血病细胞，易于培养，平均倍增时间为 19 – 50 h20相反，人类单核细胞在缺乏生长因子的情况下寿命较短。由于单核细胞是从供体血液中分离得到的，不同个体之间存在较大的差异性，且根据纯化方法的不同，可能会出现其他细胞类型的污染。尽管如此，原代单核细胞仍具有重要的研究价值，因此在生物学研究中建议使用原代单核细胞来验证或确认单核细胞系所获得的结果。19在此，我们描述了一种从外周血中纯化人原代单核细胞的方案。其他单核细胞纯化方法包括密度梯度法、贴壁法，以及两步法：先使用Ficoll-Hypaque单梯度，再进行Percoll梯度分离。21单核细胞群经上述方法分离后的纯度范围为70%–90%。本文所述方法采用密度梯度离心结合阴性免疫筛选。22 且能够在不与抗体直接接触的情况下实现人单核细胞的纯化，从而避免其非预期激活，获得更理想的细胞状态 >单核细胞纯度达95%。

本文所述方案用于建立功能性Tet-ON系统，以在人源癌细胞系中进行基因表达敲低（KD），研究癌细胞分泌蛋白PAI-1对单核细胞的趋化作用。PAI-1在多种肿瘤中高表达，其表达水平与不良临床预后呈矛盾性相关23,24。PAI-1的促肿瘤作用源于其促血管生成和抗凋亡功能25,26。已有研究表明，PAI-1通过促进巨噬细胞向炎症部位募集而参与炎症过程27。PAI-1被证实可促进平滑肌细胞迁移28,29，并参与Mac-1依赖性的巨噬细胞迁移30。此外，PAI-1的高表达也被证明可显著增强Raw 264.7巨噬细胞向B16F10黑色素瘤肿瘤的募集31。然而，PAI-1在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）迁移中的作用尚未被深入研究。我们采用本方案旨在回答PAI-1是否能够吸引单核细胞向癌细胞迁移这一科学问题。该方法可通过沉默癌细胞中分泌蛋白的表达，并分析肿瘤微环境（TME）的组分，从而解析肿瘤细胞与TME之间的相互作用。

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方案

使用来自健康志愿者的人体单核细胞的实验方案部分遵循洛杉矶儿童医院人体研究伦理委员会的指南，并已根据人体材料方案编号：CCI 08-00208，获得机构审查委员会的批准。

1. 准备可由四环素调控的shRNA表达的癌细胞系

  1. 将shRNA PAI-1克隆至Tet-pLKO-puro载体8,9
    1. 设计包含shRNA的寡核苷酸 年龄我与 生态5'端的RI切割位点、正义序列、6个核苷酸组成的环结构以及反义序列。
      注意：典型的寡核苷酸设计如下：正向寡核苷酸：5' CCGG - 19 - 21 bp 有义链 - CTCGAG - 19 - 21 bp 反义链 - TTTTT；反向寡核苷酸：5' AATTAAAAA - 19 - 21 bp 有义链 - CTCGAG - 19 - 21 bp 反义链 3'。寡核苷酸设计的详细方案可参见 8在本研究中，测试了3种针对PAI-1的shRNA序列，以确定沉默效果最强的序列：shRNA 132，shRNA 2，shRNA 333，以及随机序列33 包含在 表1.
    2. 将shRNA寡核苷酸和随机shRNA寡核苷酸进行退火处理。
      1. 将寡核苷酸重悬于水中，配制成100 µM浓度，取1 µL正向寡核苷酸、1 µL反向寡核苷酸与8 µL H₂O混合2O.
      2. 将以下组分混合以退火寡核苷酸：1 µL 寡核苷酸混合物，5 µL 缓冲液（10 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）pH 7.5，50 mM 氯化钠（NaCl），10 mM 氯化镁（MgCl₂））2），1 mM 二硫苏糖醇（DTE）和 44 µL H2O.
      3. 将混合物置于聚合酶链式反应（PCR）热循环仪中，在 95 °C 下孵育 5 分钟，关闭仪器，等待温度降至室温（RT）。
    3. 向50 µL退火后的寡核苷酸中加入5 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2），沉淀退火后的寡核苷酸。
      1. 加入100 µL预冷的100%乙醇（EtOH），在-80 °C下孵育30分钟。在4 °C下，以最大转速在台式离心机中离心30分钟。
      2. 移除上清液，加入500 µL预冷的70%乙醇，离心30 min，弃上清液，将沉淀溶于20 µL H₂O中。2O.
      3. 通过分光光度法测定退火寡核苷酸的浓度，测量其在260 nm处的吸光度。将寡核苷酸稀释至终浓度为1 ng/µL。
    4. 制备LB（Luria Bertani）培养基和LB琼脂平板。
      1. LB 培养基：将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl 溶于 1 L 水中，用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.0，高压灭菌。
      2. 对于LB琼脂平板，将15 g/L的琼脂加入LB培养基中，高压灭菌后冷却至约50 °C，加入抗生素并倒平板。
    5. 用Tet-pLKO-puro载体转导的细菌划线（参见 材料表在添加了100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线接种，并于37 °C过夜培养（O/N）。
    6. 从平板上挑取1个菌落接种于100 mL添加了100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基（LB/氨苄青霉素）中，37 °C振荡培养过夜。
    7. 使用质粒提取试剂盒从100 mL细菌培养物中提取IsolateTet-pLKO-puro。
    8. 用 EcoRI 和 AgeI 限制性内切酶对 Tet-pLKO-puro 载体进行限制性酶切反应，体系如下：1 µL EcoRI、1 µL AgeI、5 µL 10x 缓冲液、1 µL 质粒 DNA（1 µg）、42 µL H₂O2O. 37 °C 下孵育 1 小时。为获得足量的酶切载体，可最多设置 5 个 50 µL 反应体系。
    9. 使用1%琼脂糖凝胶电泳，利用DNA纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化经酶切的载体。为提高DNA得率，应通过使用带有大孔梳子的琼脂糖凝胶来降低凝胶中琼脂糖与DNA的比例，并用手术刀小心切除目的条带周围大部分琼脂糖，以尽量减少琼脂糖用量。
    10. 连接反应体系配制如下：1 ng 退火的寡核苷酸，50 ng 酶切载体，2 µL 10x 连接酶缓冲液，1 µL 连接酶，加水至总体积 20 µL。将载体与退火的shRNA寡核苷酸在16 °C 过夜连接。
      1. 另外，准备一个不含寡核苷酸的阴性对照反应，以排除未切割、部分切割以及自连的载体所导致的假阳性菌落。
    11. 使用标准转化技术，将连接产物转入经化学处理的大肠杆菌感受态细胞中，该类细胞经过特殊设计，可防止含有直接重复序列的慢病毒载体发生同源重组。
    12. 在含氨苄青霉素的平板上于37 °C过夜培养细菌。
      注意：如果出现卫星菌落生长，需重复转化实验，并将细菌在30 °C条件下培养，以减缓生长速度，从而避免卫星菌落的形成。
    13. 为验证连接是否成功，挑选10至20个单菌落，接种于2 mL LB/氨苄青霉素液体培养基中，并同时接种氨苄青霉素平板作为保藏平板（后续用作阳性克隆）。将液体培养物于37 °C、振荡条件下过夜培养。将平板置于37 °C过夜培养。
    14. 用封口膜密封培养板，并在6 °C下保存。
    15. 使用质粒提取试剂盒从液体培养物中分离质粒DNA。
    16. 使用XhoI酶对从氨苄青霉素抗性菌落中分离的质粒DNA进行限制性酶切分析。针对每个克隆，配制如下反应体系：0.5 µL XhoI、2.5 µL 10x缓冲液、1 µL质粒DNA（0.5 µg）和21 µL H₂O2O. 37 °C 下孵育 1 小时。将反应产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，以分析限制性酶切反应结果。
      注意：野生型载体经XhoI酶切后的限制性分析将产生3个片段：8,447 bp、1,800 bp和200 bp。在含有shRNA-PAI-1的阳性克隆中，Tet-pLKO-puro载体中1,800 bp的填充序列（stuffer sequence）不存在，因此XhoI酶切将产生大小为8,447 bp、190 bp和130 bp的DNA片段。如图所示 图1，2000 bp 片段未在氨苄青霉素抗性菌落（编号：3、8 和 11）的基因组 DNA 中检测到。根据寡核苷酸引物的设计不同，阳性菌落 DNA 中获得的片段长度和数量可能有所差异。
    17. 通过测序验证shRNA序列正确插入Tet-pLKO-puro载体8,9.
    18. 接种含有正确克隆的菌落至100 mL LB/氨苄青霉素培养液中，37 °C过夜培养。
    19. 使用质粒提取试剂盒分离质粒DNA。
  2. 慢病毒颗粒的制备
    1. 用无菌水配制0.01%的Poly-L-Lysine溶液覆盖15 cm组织培养皿表面，室温孵育15分钟，以包被培养皿。吸除溶液后，将培养皿晾干。
    2. 种子 5 x 106 在已包被多聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine）的15 cm培养皿中接种人胚胎肾293细胞（HEK293细胞），并使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素混合液（Pen/Strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）在37 °C、5% CO₂条件下培养2 直到细胞汇合度达到70%。
    3. 使用转染试剂将25 µg pLKO-Tet-On-shRNA、25 µg psPAX（包装质粒）和5 µg pMD2.G质粒（包膜表达质粒）共转染HEK293细胞，以产生病毒颗粒。
      注：psPAX 和 pMD2.G 质粒由瑞士洛桑联邦理工学院 Didier Trono 实验室惠赠。
    4. 第二天更换培养基为添加了10 mM丁酸钠和20 mM HEPES（pH 7.2）的DMEM，诱导HEK293细胞，继续培养8小时。
    5. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入25 mL含有20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（pH 7.2）的新鲜DMEM培养基。在37 °C孵育48 h后，用移液器小心收集含病毒的培养基；避免洒出。
    6. 使用0.45 µm针头滤器过滤收集的培养基，以去除HEK293细胞。含有病毒颗粒的培养基可立即使用，或于-80 °C保存以备后续使用。
  3. 稳定转染细胞系的建立
    1. 在12孔板中，将HCT116结肠癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞以每孔50,000个细胞的密度接种于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的DMEM培养基中。于37 °C、5% CO₂条件下培养2 直至细胞汇合度达到60%–70%。
    2. 用 PBS 洗涤细胞，向癌细胞中加入 1 mL 含病毒的培养基，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜2作为对照，在2个含有癌细胞的孔中各加入1 mL新鲜DMEM培养基，培养基中添加10% FBS和1%青霉素-链霉素。
    3. 小心吸去含病毒的培养基，用 PBS 洗涤细胞，然后更换为含 10% (v/v) 无四环素胎牛血清（Tet-free FBS）和 1% 青霉素-链霉素（Pen/Strep）的 DMEM 培养基。
    4. 72小时后，用PBS洗涤细胞，并更换培养基为含10%无四环素胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1 µg/mL嘌呤霉素的DMEM，用于筛选病毒感染的细胞。
      1. 根据所使用的细胞系，通过在未转导的细胞中测试嘌呤霉素浓度梯度（0.1、0.5、1、2 和 5 µg/mL），选择培养 3 天后无对照细胞存活的最低浓度，以确定最佳筛选浓度。
    5. 在含有嘌呤霉素的培养基中培养细胞3至14天，以筛选病毒转导的细胞。作为对照，另设两个未转导病毒的细胞孔，一孔加入含嘌呤霉素的培养基，另一孔不加嘌呤霉素。与对照孔相比，观察到转导病毒的细胞孔中嘌呤霉素引起部分细胞死亡。
      注意：未转导的细胞在嘌呤霉素存在下不会生长。
    6. 验证嘌呤霉素抗性HCT116结肠癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞中条件性KD的效率。
      注意：强力霉素的有效浓度因所用细胞系而异，必须进行滴定（通常为 100 ng/mL 至 2 µg/mL）。
      1. 确定一种对细胞无毒但能有效下调目标蛋白表达的强力霉素浓度。在本方案中，成功使用了 1 µg/mL 的浓度。 体外.
      2. 在含有或不含0.1、1和2 µg/mL多西环素的条件下培养细胞72 h。通过Western blot分析检测细胞裂解液中下调蛋白（此处为PAI-1）的表达水平。将条件性表达shRNA的HCT116和MDA-MB-231细胞与表达乱序对照shRNA的细胞进行比较。
  4. 条件培养基的制备
    1. 接种 1 × 106 在10 cm培养皿中培养经含多西环素调控的pLKO-shRNA慢病毒稳定转染的细胞。
    2. 在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞系分别在含有10%无四环素胎牛血清和1%青霉素-链霉素的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中培养72小时，培养体系中分别添加或不添加1 µg/mL多西环素。2每天添加新鲜的强力霉素。
      注意：RPMI 培养基适用于单核细胞的培养条件。多西环素为光敏感化合物，需用铝箔包裹培养物以避光，并避免在直接光照条件下操作。
    3. 用移液器收集培养基，经0.45 µm滤膜过滤后，分装并于-80 °C冻存。

2. 从人血液中分离单核细胞

  1. 从人外周血中分离单核细胞。
    注意：人原代单核细胞来源于健康血小板捐献者提供的白细胞滤器中浓缩的7 mL白细胞。根据捐献者不同，一个白细胞滤器可获得约1 × 109 至 2 × 109 个外周血单个核细胞（PBMCs），其中约10%为单核细胞。
    1. 在超净工作台内准备操作台。
    2. 使用紫外线（UV）照射剪刀和超净工作台30分钟进行灭菌。
    3. 用70%乙醇喷洒白细胞滤器，并在超净工作台内晾干。
    4. 用剪刀剪开白细胞滤器两端，将滤器内容物转移至50 mL离心管中。
    5. 加入含1%（v/v）胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS/FBS），定容至90 mL。
    6. 准备3个50 mL离心管，每管加入15 mL密度梯度液。使用移液器控制器以重力流方式缓慢将30 mL PBS/FBS稀释的血液叠加在密度梯度液上，避免两层液体混合。
    7. 在室温下使用水平转子以400 × g离心25分钟，不启用刹车。
    8. 弃去上层液体，将含有PBMCs的中间层转移至新的50 mL离心管中。
    9. 加入PBS/FBS至50 mL，以120 × g在室温下离心10分钟，弃去含有血小板的上清液。重复此步骤两次。
    10. 将沉淀重悬于50 mL PBS/FBS中，使用血细胞计数板计数PBMCs。以120 × g在室温下离心后，将沉淀重悬于含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS/FBS（PBS/FBS/EDTA）中，调整细胞终浓度为5 × 107 个/mL。
    11. 使用阴性选择试剂盒通过去除非单核细胞来富集单核细胞。
      注意：该阴性选择试剂盒包含一组针对T细胞、NK细胞、中性粒细胞、B细胞、粒细胞和红细胞的抗体混合物（CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD56、CD66b、CD123和血型糖蛋白A）。抗体复合物结合在这些非单核细胞表面，并与葡聚糖磁性颗粒结合。当离心管置于磁场中时，磁珠附着在管壁上，从而将非单核细胞从溶液中去除。
      1. 向1 mL浓度为5 × 107 个/mL的PBMCs中加入50 µL抗体混合液，用移液器混匀，在室温下孵育10分钟。再加入50 µL磁珠，混匀后继续在室温下孵育10分钟。
      2. 加入PBS/FBS/EDTA至25 mL，将PBMC混合液置于可容纳50 mL离心管的磁架中，在室温下孵育10分钟。磁珠将附着在管壁上，从而将非单核细胞从溶液中分离出来。
    12. 使用25 mL移液管小心吸取磁架中离心管内的含有单核细胞的溶液，注意移液管不要接触管壁。
    13. 以250 × g在室温下离心该溶液，弃去上清液，将含有单核细胞的沉淀重悬于含10%无四环素FBS和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的RPMI培养基中。

3. Boyden 小室迁移实验

  1. 通过将 1 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 100 mL 超纯水中，配制 1% (w/v) 的牛血清白蛋白（BSA）溶液，并使用孔径为 0.2 µm 的滤膜过滤以实现灭菌。
  2. 将多孔膜小室插入 1% 无菌 BSA 溶液中，过夜孵育，以增强巨噬细胞在膜上的黏附性。对于单核细胞/巨噬细胞，使用孔径为 5–8 µm 的插入式小室。
    1. 将无菌细胞培养皿中加入 1% BSA 溶液，并将小室放入培养皿中。向小室内加入 200 µL 1% BSA 溶液。
  3. 将小室置于盛有无菌 PBS 的培养皿中，并向滤膜内部加入 PBS，清洗两次。
  4. 在 24 孔板中，每孔加入含有 10% 无四环素胎牛血清（Tet-free FBS）和 1% 青霉素-链霉素（Pen/Strep）的 0.5 mL RPMI 培养基，接种 40,000 个 HCT116 或 MDA-MB-231 细胞，每个条件设三个重复。或者，也可在孔中加入 0.5 mL 事先制备的条件培养基作为趋化因子来源。
  5. 次日，在已准备好的小室中加入含有 10% 无四环素胎牛血清（Tet-free FBS）和 1% 青霉素-链霉素（Pen/Strep）的 0.3 mL RPMI 培养基，每孔接种 8,000 个单核细胞，每个条件设三个重复，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
  6. 48 小时后收集小室。
    注意：实验时长应根据具体实验条件和所用细胞类型进行优化，可通过在不同孵育时间点收集小室进行时间进程实验来确定最佳时间。
    1. 轻轻甩去多余培养基，并用棉签精确擦拭小室内表面，以去除未迁移的细胞。
    2. 使用 Wright-Giemsa 染色法对外侧的小室进行染色。
    3. 将 3 个小室/载玻片小心地用高黏度显微镜浸油封片，确保滤膜上含有已迁移巨噬细胞的一面朝上。
  7. 使用配备 20X 物镜的光学显微镜观察载玻片。每张滤膜拍摄 9 个视野的图像，并对每张滤膜 9 个视野中的迁移巨噬细胞进行计数。

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结果

测试了三种shRNA序列以确定对PAI-1实现最高效敲低（KD）的序列。为此，采用了针对PAI-1的shRNA序列和乱序（scrambled）对照序列。表1) 按照上述方案克隆至 Tet-pLKO-puro 表达载体中。将构建的质粒稳定转染至 HT-1080 纤维肉瘤细胞系，并用多西环素处理细胞 3 天。通过 Western 印迹检测 PAI-1 的表达水平 (图 2A）并通过密度测定法分析了对应于PAI-1和tubulin条带的强度。利用最有效的KD序列（shRNA 2），我们进一步构建了MDA-MB-231上皮性乳腺腺癌细胞（图 2B）和 HCT116 结直肠癌细胞（图2C) 稳定转染了四环素调控的pLKO-shRNA2-PAI-1表达载体（以shRNA随机序列作为对照）。我们在MDA-MB-231细胞系中实现了PAI-1表...

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讨论

由多种细胞类型组成，肿瘤微环境（TME）在癌症发展过程中起着关键作用。为了确定最佳生长条件，癌细胞通过分泌趋化因子吸引单核细胞。本文介绍了一种研究肿瘤细胞招募单核细胞机制的实验方案 体外为此，采用可诱导基因表达系统、人原代单核细胞的纯化，以及以Boyden小室迁移实验为例的迁移实验方法。

本方案中的第一个关键步骤是确认shRNA序列已正确克隆至Tet-ON载体中，此步骤必须通过测序进行验证。后续需建立功能性的稳定Tet-ON细胞系，并通过在多西环素存在条件下进行Western blot检测基因敲低（KD）效果以确认其功能。不同细胞系对多西环素的用量可能有所差异，因此建议测试其在细胞中的有效敲低浓度及细胞毒性浓度。四环素诱导系统的一个已知缺点是存在渗漏表达（leakiness）。6,7存在和不存在多西环素的情况下检测到的蛋白量必须与乱序对照进行测量和比较，以校正此效应。在 体外 实验中，shRNA2 和 shRNA3 干扰表现出较低...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢Jacqueline Rosenberg对稿件的校对。本研究工作由美国卫生与公共服务部/国立卫生研究院资助，资助编号为YA DeClerck（资助号5R01 CA 129377）以及TJ Martell基金会。MH Kubala是洛杉矶儿童医院Saban研究所颁发的研究职业发展奖学金获得者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tet-pLKO-puro 慢病毒载体Addgene21915
胎牛血清（无四环素）Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep 人单核细胞富集试剂盒干细胞19059
EasySep 磁力架干细胞18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Smart缓冲液NEBB7200S
EndoFree 质粒大提试剂盒Qiagen12362
PROMEGA Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统PROMEGAA9281
psPAX 载体Addgene12260
pMD2.G 载体Addgene12259
One Shot Stbl3 化学感受态细胞 大肠杆菌赛默飞世尔科技C737303
Hema 3 染色套装，用于 Wright-Giemsa 染色实验方案123-869
HEK293细胞ATCCCRL-1573
PBS康宁21-031-CV
XhoI 限制性内切酶NEBR0146S
连接酶NEBM0202S
连接酶缓冲液NEBM0202S
0.5 M EDTA 溶液赛默飞世尔科技R1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
大易" EasySep 磁力架干细胞18001
0.1% 聚-L-赖氨酸溶液Sigma-AldrichP8920
乙酸钠Sigma-AldrichS7670
丁酸钠Sigma-AldrichB5887
0.45 μM型注射器滤器VWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）Invitrogen15504-020
氯化钠(NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 kg
氯化镁（MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
二硫苏糖醇（DTE）Sigma-AldrichB8255-5g
乙醇（EtOH）Sigma-Aldrich792780
胰蛋白胨AmrescoJ859-500g
酵母提取物Fluka70161-500g
Bacto 琼脂BD214010
氨苄青霉素Sigma-AldrichA9393-5g
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）康宁10-013-CV
磷酸盐缓冲液（PBS）康宁21-031-CV
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）Sigma-AldrichH3375
嘌呤霉素Sigma-AldrichP9620
盐酸多西环素Sigma-AldrichD9891-25g
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）康宁10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0赛默飞世尔科技R1021
24孔板用Falcon可渗透支持膜，8.0 µmμm 透明 PET 膜Becton Dickinson353097
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
棉签 MedlineMDS202000
Hema 3 STAT 试剂盒操作规程 Fisher Scientific 公司123-869
高黏度浸油Richard Allan ScientificM4004
青霉素-链霉素Gibco15140122

参考文献

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Tet-ON 系统单核细胞迁移蛋白质印迹分析密度梯度离心Boyden 小室实验PAI-1 蛋白
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