方法文章

肿瘤细胞系基因表达的条件性击倒研究单核/巨噬细胞在微环境中的招募

DOI：

10.3791/56333

⸱

2017年11月23日

 , 
1Division of Hematology, Oncology and Blood and Marrow Transplantation, Department of Pediatrics, University of Southern California, 2The Saban Research Institute of Children's Hospital Los Angeles, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Southern California

本文内容

摘要

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本议定书作为一个计划, 建立一个功能性的癌症细胞系的系统, 并随后使用, 特别是研究肿瘤细胞源性蛋白质在招募单核/巨噬细胞到肿瘤微环境的作用。

摘要

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siRNA 和 shRNA 介导的敲掉 (KD) 调控基因表达的方法是了解基因和蛋白质功能的宝贵工具。但是, 在有兴趣的蛋白质的 kd 对细胞有致命影响或 kd 的预期效应是时间依赖性的情况下, 无条件 kd 方法是不适当的。条件系统更适合在这些情况下, 并已成为一个很大的兴趣的主题。这些包括蜕皮诱导的过度表达系统, 细胞色素 P-450 诱导系统1, 和四环素调控的基因表现系统。

四环素调控基因表达系统能够通过诱导 shRNA 表达在四环素的存在下对蛋白质表达进行可逆控制。在本协议中, 我们提出了一个实验设计, 利用功能性的, 在人类癌症细胞系的基因表达的条件调节。然后, 我们证明了该系统在肿瘤细胞-单核相互作用的研究中的应用。

引言

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肿瘤相关巨噬细胞 (tam) 促进肿瘤生长, 转移, 并调节免疫应答2。癌细胞会吸收具有炎症的单核细胞, 浸润肿瘤并分化为 pro-tumorigenic tam3。肿瘤浸润与 tam 相关性不佳的临床结果, 并已与免疫抑制作用的巨噬细胞4,5。然而, 对肿瘤的巨噬细胞的招募机制没有很好的探索和更好地了解有关的途径是至关重要的进一步发展的领域和有前途的治疗方法。研究肿瘤细胞与正常细胞在肿瘤微环境中的相互作用的一个挑战是所涉及的机制和细胞的复杂性, 需要体外方法, 允许对串扰进行解剖。在这里, 我们提出了一个多用途的方法, 可用于研究的分泌效应的癌细胞衍生的, 分泌蛋白的迁移其他细胞类型如巨噬细胞,体外。使用的系统, shRNA 的表达与癌细胞来源的蛋白质参与招募的单核细胞是在控制的四环素诱导启动子, 分泌的作用, 分泌的蛋白质单核定量。在这个协议中, shRNA 序列的克隆在四环素调控的传染媒介然后被提出稳定的癌细胞线的世代。此外, 对原人单核细胞和博伊登室的纯化进行了研究, 以分析癌细胞衍生蛋白对分泌的迁移作用。

蛋白质编码基因的下调通常应用于 siRNA 和 shRNA 技术, 尽管在其使用中并非没有限制。基因的长期击倒 (K....

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方案

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使用从健康志愿者获得的人单核细胞的议定书部分遵循儿童医院洛杉矶人类研究伦理委员会的指导方针, 并已得到机构审查委员会在人体材料下的批准协议编号: 08-00208。

1. 用四环素调控的 shRNA 表达肿瘤细胞系的制备

  1. shRNA PAI-1 到 pLKO 普洛向量的克隆8,9
    1. 设计 shRNA 的低聚物, 包含年龄I 和EcoRI 在5的末端, 感官序列, 一个6核苷酸循环, 和反义序列。
      注: 典型的寡核苷酸的设计如下: 向前寡聚: 5 ' CCGG-19-21 bp 感觉-CTCGAG-19-21 bp 反义-TTTTT, 反向寡聚: 5 ' AATTAAAAA-19-21 bp 感觉-CTCGAG-19-21 bp 反义 3 "。可在8中找到有关齐聚物设计的详细协议。在这项研究 3 shRNA 序列反对 PAI-1 被测试了为最强的沉寂作用: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333, 并且被搅乱的33包括在表 1

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结果

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三 shRNA 序列被测试为最有效的 KD PAI-1。为此, 根据上述协议, 将 shRNA 序列与 PAI-1 和被打乱的 (表 1) 复制到 pLKO 普洛表达式向量中。HT-1080 纤维细胞系稳定地转染了生成的结构, 细胞被强力霉素治疗3天。用印迹(图 2A) 对 PAI-1 的表达进行了验证, 并通过密度测量分析了与 PAI-1 和蛋白相对应的波段强度。使用最有效的 KD 序列 (shRNA 2), 我们还产生了 MDA-MB-231 上皮性乳腺腺癌细胞 (图 2B) 和 HCT116 大肠癌细胞 (图 2C) 稳定转染四环素调控pLKO-shRNA2-PAI-1 表达式向量 (和 shRNA 作为控件被打乱)。在 MDA-MB-231 细胞系 (图 2B).......

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讨论

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由多种细胞类型组成, 对癌症的发展至关重要。为了确定最佳生长条件, 癌细胞通过分泌趋因子来吸引单核细胞。在这里, 我们提出了一个协议, 以研究的机制, 单核细胞招募的癌细胞体外。为此, 采用诱导基因表达系统, 纯化初级人类单核细胞, 并作为一个例子的迁移试验, 博伊登室测定, 使用。

所提出的协议的第一个关键步骤是将 shRNA 序列的正确克隆确认为 "春节-对" 向量, 该方法应始终按顺序进行评估。进一步建立的功能稳定的春节细胞系需要通过测试 KD 在存在的强力霉素的西部印迹。应用的强力霉素的数量在细胞系之间可能有所不同, 因此最好测试 KD 的有效浓度和对细胞的毒性。四环素诱导系统的一个已知的缺点是它们的泄漏6,7。在存在和无强力霉素的情况下检测到的蛋白质数量必须被测量, 并与被炒的控件进行比较, 以此来解释这种效果。在体外实验中, shRNA2 和 shRNA3 KD 观察到低级别的泄漏, 如

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者想承认杰奎琳·罗森博格校对手稿。这项工作得到了美国卫生和人类服务部/国家卫生研究院的支持, 授予雅 DeClerck (grant 5R01 129377) 和 TJ 马爹利基金会。MH Kubala 是洛杉矶儿童医院塞班研究所的研究职业发展奖学金获得者。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tet-pLKO-puro 慢病毒载体Addgene21915
FBS（不含四环素）Omega ScientificFB-15
组织细胞增多Sigma10771-500ML
EasySep 人单核细胞富集试剂盒StemCell19059
EasySep 磁吸干细胞18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Smart 缓冲液NEBB7200S
EndoFree 质粒 Maxi 试剂盒Qiagen12362
PROMEGA Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统PROMEGAA9281
psPAX 载体Addgene12260
pMD2.G 载体Addgene12259
One Shot Stbl3 化学感受态 大肠杆菌Thermo Fisher ScientificC737303
Hema 3 染色套装，用于 Wright-Giemsa 染色方案123-869
HEK293 细胞ATCCCRL-1573
PBS康宁21-031-CV
XhoI 限制性内切酶NEBR0146S
连接酶NEBM0202S
连接酶缓冲液NEBM0202S
EDTA 0.5 M 溶液Thermo Fisher ScientificR1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep 磁体干细胞18001
0.1% 聚-L-赖氨酸溶液Sigma-AldrichP8920
乙酸钠Sigma-AldrichS7670
丁酸钠Sigma-AldrichB5887
0.45 &μ;M 针式过滤器VWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）Invitrogen15504-020
氯化钠 （NaCl）Sigma-AldrichS7653-5 kg
氯化镁 （MgCl2）Sigma-AldrichM8266-100g
二硫赤藓糖醇 （DTE）Sigma-AldrichB8255-5g
乙醇 （EtOH）Sigma-Aldrich792780
胰蛋白胨AmrescoJ859-500g
酵母提取物Fluka70161-500g
细菌琼脂BD214010
氨苄青霉素Sigma-AldrichA9393-5g
杜尔贝科s 改良鹰's 培养基 （DMEM）康宁10-013-CV
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）康宁21-031-CV
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES）Sigma-AldrichH3375
嘌呤霉素Sigma-AldrichP9620
盐酸多西环素Sigma-AldrichD9891-25g
罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI）康宁10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0Thermo Fisher ScientificR1021
Falcon 24 孔板渗透支持，8.0&μ;m 透明 PET 膜Becton Dickinson353097
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
棉头涂抹器 MedlineMDS202000
Protocol Hema 3 STAT 包装 Fisher Scientific Company123-869
Resolve 浸油，高粘度RichardAllan ScientificM4004
青霉素链霉素Gibco15140122
器

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A.....

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Tet ON SystemMonocyte MigrationWestern Blot AnalysisDensity Gradient CentrifugationBoyden Chamber AssayPAI 1 Protein

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