本方案旨在介绍如何在癌细胞系中建立功能性Tet-ON系统，并进一步应用该系统，特别是用于研究肿瘤细胞来源的蛋白质在单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境募集过程中的作用。
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本文内容
摘要
摘要
通过siRNA和shRNA介导的基因表达敲低（KD）方法是研究基因和蛋白质功能的重要工具。然而，当目标蛋白的敲低对细胞具有致死效应，或预期的敲低效应具有时间依赖性时，非条件性敲低方法则不适用。在这些情况下，条件性系统更为合适，并已受到广泛关注。这些系统包括蜕皮激素诱导型过表达系统、细胞色素P-450诱导系统1以及四环素调控的基因表达系统。
四环素调控的基因表达系统可通过四环素存在时诱导shRNA表达，从而实现对蛋白质表达的可逆性控制。在本实验方案中，我们介绍了一种在人源癌细胞系中使用功能性Tet-ON系统进行条件性基因表达调控的实验设计。随后，我们展示了该系统在肿瘤细胞与单核细胞相互作用研究中的应用。
引言
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）通过促进肿瘤生长、转移以及调控免疫反应，参与肿瘤的发展过程2癌细胞招募炎性单核细胞，这些细胞浸润肿瘤并分化为促肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）3肿瘤中TAMs的浸润与较差的临床预后相关，并且与巨噬细胞的免疫抑制作用有关4,5然而，肿瘤招募巨噬细胞的机制尚未得到充分研究，深入理解相关通路对于推动该领域发展及开发有前景的治疗策略至关重要。研究肿瘤微环境（TME）中肿瘤细胞与正常细胞相互作用的一个挑战在于所涉机制和细胞类型的复杂性，这需要 体外 能够解析这种串扰的多种方法。本文介绍了一种多功能方法，可用于研究癌细胞分泌的蛋白质对其他细胞类型（如巨噬细胞）迁移的旁分泌效应。 体外利用一个由四环素诱导型启动子调控的系统，针对癌细胞来源的、参与单核细胞募集的蛋白表达shRNA，定量分析该分泌蛋白对单核细胞的旁分泌作用。本方案中，首先介绍将shRNA序列克隆至四环素调控载体，随后构建稳定的癌细胞系。此外，通过纯化原代人单核细胞并采用Boyden小室实验，分析癌细胞来源蛋白对单核细胞迁移的旁分泌效应。 关键词：shRNA，四环素诱导型启动子，旁分泌作用，癌细胞，单核细胞募集，Boyden小室实验，原代人单核细胞，稳定细胞系
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方案
使用来自健康志愿者的人体单核细胞的实验方案部分遵循洛杉矶儿童医院人体研究伦理委员会的指南，并已根据人体材料方案编号：CCI 08-00208，获得机构审查委员会的批准。
1. 准备可由四环素调控的shRNA表达的癌细胞系
- 将shRNA PAI-1克隆至Tet-pLKO-puro载体8,9
- 设计包含shRNA的寡核苷酸 年龄我与 生态5'端的RI切割位点、正义序列、6个核苷酸组成的环结构以及反义序列。
注意：典型的寡核苷酸设计如下：正向寡核苷酸：5' CCGG - 19 - 21 bp 有义链 - CTCGAG - 19 - 21 bp 反义链 - TTTTT；反向寡核苷酸：5' AATTAAAAA - 19 - 21 bp 有义链 - CTCGAG - 19 - 21 bp 反义链 3'。寡核苷酸设计的详细方案可参见 8在本研究中，测试了3种针对PAI-1的shRNA序列，以确定沉默效果最强的序列：shRNA 132，shRNA 2，shRNA 333，以及随机序列
- 设计包含shRNA的寡核苷酸 年龄我与 生态5'端的RI切割位点、正义序列、6个核苷酸组成的环结构以及反义序列。
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结果
测试了三种shRNA序列以确定对PAI-1实现最高效敲低（KD）的序列。为此，采用了针对PAI-1的shRNA序列和乱序（scrambled）对照序列。表1) 按照上述方案克隆至 Tet-pLKO-puro 表达载体中。将构建的质粒稳定转染至 HT-1080 纤维肉瘤细胞系，并用多西环素处理细胞 3 天。通过 Western 印迹检测 PAI-1 的表达水平 (图 2A）并通过密度测定法分析了对应于PAI-1和tubulin条带的强度。利用最有效的KD序列（shRNA 2），我们进一步构建了MDA-MB-231上皮性乳腺腺癌细胞（图 2B）和 HCT116 结直肠癌细胞（图2C) 稳定转染了四环素调控的pLKO-shRNA2-PAI-1表达载体（以shRNA随机序列作为对照）。我们在MDA-MB-231细胞系中实现了PAI-1表.......
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讨论
由多种细胞类型组成，肿瘤微环境（TME）在癌症发展过程中起着关键作用。为了确定最佳生长条件，癌细胞通过分泌趋化因子吸引单核细胞。本文介绍了一种研究肿瘤细胞招募单核细胞机制的实验方案 体外为此，采用可诱导基因表达系统、人原代单核细胞的纯化，以及以Boyden小室迁移实验为例的迁移实验方法。
本方案中的第一个关键步骤是确认shRNA序列已正确克隆至Tet-ON载体中，此步骤必须通过测序进行验证。后续需建立功能性的稳定Tet-ON细胞系，并通过在多西环素存在条件下进行Western blot检测基因敲低（KD）效果以确认其功能。不同细胞系对多西环素的用量可能有所差异，因此建议测试其在细胞中的有效敲低浓度及细胞毒性浓度。四环素诱导系统的一个已知缺点是存在渗漏表达（leakiness）。6,7存在和不存在多西环素的情况下检测到的蛋白量必须与乱序对照进行测量和比较，以校正此效应。在 体外 实验中，shRNA2 和 shRNA3 干扰表现出较低.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢Jacqueline Rosenberg对稿件的校对。本研究工作由美国卫生与公共服务部/国立卫生研究院资助，资助编号为YA DeClerck（资助号5R01 CA 129377）以及TJ Martell基金会。MH Kubala是洛杉矶儿童医院Saban研究所颁发的研究职业发展奖学金获得者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tet-pLKO-puro 慢病毒载体 | Addgene | 21915 | |
| 胎牛血清（无四环素） | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep 人单核细胞富集试剂盒 | 干细胞 | 19059 | |
| EasySep 磁力架 | 干细胞 | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart缓冲液 | NEB | B7200S | |
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统 | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX 载体 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G 载体 | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 化学感受态细胞 大肠杆菌 | 赛默飞世尔科技 | C737303 | |
| Hema 3 染色套装，用于 Wright-Giemsa 染色 | 实验方案 | 123-869 | |
| HEK293细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | 康宁 | 21-031-CV | |
| XhoI 限制性内切酶 | NEB | R0146S | |
| 连接酶 | NEB | M0202S | |
| 连接酶缓冲液 | NEB | M0202S | |
| 0.5 M EDTA 溶液 | 赛默飞世尔科技 | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 大易" EasySep 磁力架 | 干细胞 | 18001 | |
| 0.1% 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM型注射器滤器 | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷（Tris） | Invitrogen | 15504-020 | |
| 氯化钠(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| 氯化镁（MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| 二硫苏糖醇（DTE） | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| 乙醇（EtOH） | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| 胰蛋白胨 | Amresco | J859-500g | |
| 酵母提取物 | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto 琼脂 | BD | 214010 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM） | 康宁 | 10-013-CV | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 康宁 | 21-031-CV | |
| 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES） | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| 罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI） | 康宁 | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | 赛默飞世尔科技 | R1021 | |
| 24孔板用Falcon可渗透支持膜，8.0 µmμm 透明 PET 膜 | Becton Dickinson | 353097 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 棉签 | Medline | MDS202000 | |
| Hema 3 STAT 试剂盒操作规程 | Fisher Scientific 公司 | 123-869 | |
| 高黏度浸油 | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 |
参考文献
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A.....
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