本研究报道了两种用于分析细胞侵袭和迁移的不同方法：Boyden小室实验和 体外 基于视频显微镜的伤口愈合实验。本文描述了这两种实验的方案，并比较了它们的优缺点。
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方法文章
细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与Boyden小室实验的比较
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是癌症进展和复发的主要因素。许多研究致力于探索细胞的迁移与侵袭能力，以揭示癌细胞扩散的机制，从而为开发新的治疗策略提供依据。对这些能力的细胞与分子基础进行分析，已促进了对细胞运动性以及细胞骨架和细胞微环境理化特性的深入理解。多年来，Boyden小室实验和划痕损伤实验一直是研究细胞侵袭与迁移的标准技术。然而，这两种技术均存在局限性：Boyden小室实验操作复杂且耗时较长，而划痕损伤实验的可重复性较低。随着现代技术的发展，尤其是显微成像技术的进步，划痕损伤实验的可重复性已得到显著提升。借助强大的分析系统， "在培养箱内" 视频显微镜可用于对细胞迁移和侵袭进行自动且实时的分析。本文旨在报告并比较两种用于研究细胞侵袭和迁移的实验方法：Boyden小室实验与一种优化的 体外 基于视频显微镜的划痕伤口愈合实验
引言
细胞侵袭和迁移参与了癌细胞的播散过程，这是导致治疗耐药性的主要原因1，并可能在癌症治疗后引起局部区域复发或远处转移2。上皮-间质转化（EMT）是细胞侵袭-迁移的起始过程，其中癌细胞从上皮表型转变为间质表型。E-钙黏蛋白（E-Cadherin）是上皮表型的细胞外标志物3，而N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）表达升高则是间质表型的特征4。细胞迁移还依赖于癌细胞通过基质金属蛋白酶的作用降解细胞外基质（ECM）而实现内在侵袭能力5。
这种侵袭-迁移机制已在多个部位的癌症中被描述，尤其在头颈部癌症中已有报道6。许多研究人员致力于研究癌细胞的迁移和侵袭过程，以更深入地理解癌细胞的播散机制，希望这些知识能够推动新型治疗策略的开发。至关重要的是，这些研究必须采用可靠且可重复的检测方法进行。
体外分析细胞运动能力可能具有挑战性。Boyden 小室实验早在多年前即已开发，被公认为侵袭-迁移分析的标准方法7。然而，该方法耗时较长，且结果常不够准确。另一种检测方法是....
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方案
注意：未加入细胞外基质（ECM）的Boyden小室实验和平面划痕实验被称为迁移实验，而加入细胞外基质（ECM）的相同实验则被称为侵袭实验。
1. Boyden 小室实验
注意：本方案针对 SQ20B 细胞系进行优化，该细胞系源自复发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的喉癌，由美国马萨诸塞州波士顿的 John Little 提供。
第1天
- 细胞接种
- 在第1天前72小时，于175 cm2 培养瓶中加入12 mL培养基（CM），接种2×106个SQ20B细胞，使其生长至80%汇合度。
- 配制SQ20B细胞培养基（CM）时，需在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FCS）、0.04 mg/mL氢化可的松、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素。
- 在超净工作台内对细胞进行胰酶消化：吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入2.5 mL含0.5 g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶溶液，在37 °C孵育5分钟，随后加入12.5 mL预热至37 °C的CM终止反应。使用细胞计数仪对细胞数量进行计....
- 在第1天前72小时，于175 cm2 培养瓶中加入12 mL培养基（CM），接种2×106个SQ20B细胞，使其生长至80%汇合度。
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结果
本文报道了两种不同的细胞侵袭和迁移分析方法。图1展示了Boyden小室实验。将插入物置于含有趋化培养基的配套培养板中，并在CM中接种细胞。膜可以不包被（迁移实验）或进行包被（侵袭实验）。将细胞接种至上方小室的s-CM中，下方小室则加入CM作为趋化剂。在细胞倍增时间之前对细胞进行固定。
图2显示了细胞固定后的Boyden小室膜。图2A显示结果不理想，膜的上侧存在细胞团簇。图2B显示结果理想，细胞已固定并染成蓝色，附着于膜上。
图3展示了划痕.......
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讨论
本文报道了两种不同的方法用于研究细胞侵袭和迁移过程。分析该过程对于理解与转移性复发相关的因素至关重要，这种复发可能由一类称为癌症干细胞的癌细胞亚群运动能力增强所导致10,11。
Boyden小室实验是研究细胞侵袭和迁移最常用的技术之一。该方法的一个优点是可重复性好，但实验结果在很大程度上依赖于操作者的经验。细胞计数为手动完成，不同操作者之间可能存在差异。许多关键步骤必须标准化并仔细执行，例如确保使用适合每种细胞系的特定趋化因子和饥饿培养基。使用棉签小心去除上层膜上的细胞也至关重要，以获得最佳结果，并避免出现图2A所示的次优结果。如果该实验用于评估细胞通过三维（3D）多孔膜的运动、侵袭和迁移能力，则无法通过延时成像实验对细胞进行动态追踪。此外，带有多孔膜的商用插入式培养小室通常价格昂贵。
本文介绍的基于视频显微镜的划痕伤口实验是一种评估细胞迁移和侵袭能力.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
这些技术的开发得到了 LabEx PRIMES（ANR-11-LABX-0063）、在 ETOILE 科学框架内的国家-大区计划合同（CPER）（CPER 2009-2013）以及 Lyric 基金 INCa-DGOS-4664 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清金标 | GE Healthcare | A15-151 | |
| 水溶性氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| 青霉素/链霉素 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 营养混合物 (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | 该溶液必须在使用前立即配制，因其极不稳定 |
| Z1 库尔特颗粒计数器 | Beckman Coulter | 6605698 | |
| 光学显微镜 | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B 细胞系 | 由 John Little’s 实验室惠赠 | - | |
| 伤口生成仪 | Essen Bioscience | 4494 | 存放于安全干燥处 |
| 96 孔 ImageLock 培养板 | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F 系统配 CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox 配 M30 系统 | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden 小室插入物 | Dominique Dutcher | 353097 | |
| 包被型 Boyden 小室插入物 | Dominique Dutcher | 354483 | 于 -20 °C 保存 |
| 24 孔配套培养板 | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel 标准品 | BD BioScience | BD 354234 | 于 -20°C 保存 |
| RAL 555 染色试剂盒 | RAL Diagnostics | 361550 | 存放于安全干燥处 |
| 微量离心管 | Eppendorf | 33511 |
参考文献
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
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重印与许可
