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方法文章

细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与Boyden小室实验的比较

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DOI：

10.3791/56337

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2017年11月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR CNRS 5822 /IN2P3, IPNL, PRISME, Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire, Faculté de Médecine Lyon-Sud, Université Lyon 1, 2Département de Radiothérapie, Institut de Cancérologie de la Loire - Lucien Neuwirth, 3Hospices Civils de Lyon, Centre Hospitalier Lyon-Sud

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究报道了两种用于分析细胞侵袭和迁移的不同方法：Boyden小室实验和 体外 基于视频显微镜的伤口愈合实验。本文描述了这两种实验的方案，并比较了它们的优缺点。

摘要

肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是癌症进展和复发的主要因素。许多研究致力于探索细胞的迁移与侵袭能力，以揭示癌细胞扩散的机制，从而为开发新的治疗策略提供依据。对这些能力的细胞与分子基础进行分析，已促进了对细胞运动性以及细胞骨架和细胞微环境理化特性的深入理解。多年来，Boyden小室实验和划痕损伤实验一直是研究细胞侵袭与迁移的标准技术。然而，这两种技术均存在局限性：Boyden小室实验操作复杂且耗时较长，而划痕损伤实验的可重复性较低。随着现代技术的发展，尤其是显微成像技术的进步，划痕损伤实验的可重复性已得到显著提升。借助强大的分析系统， "在培养箱内" 视频显微镜可用于对细胞迁移和侵袭进行自动且实时的分析。本文旨在报告并比较两种用于研究细胞侵袭和迁移的实验方法：Boyden小室实验与一种优化的 体外 基于视频显微镜的划痕伤口愈合实验

引言

细胞侵袭和迁移参与了癌细胞的播散过程，这是导致治疗耐药性的主要原因1，并可能在癌症治疗后引起局部区域复发或远处转移2。上皮-间质转化（EMT）是细胞侵袭-迁移的起始过程，其中癌细胞从上皮表型转变为间质表型。E-钙黏蛋白（E-Cadherin）是上皮表型的细胞外标志物3，而N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）表达升高则是间质表型的特征4。细胞迁移还依赖于癌细胞通过基质金属蛋白酶的作用降解细胞外基质（ECM）而实现内在侵袭能力5。

这种侵袭-迁移机制已在多个部位的癌症中被描述，尤其在头颈部癌症中已有报道6。许多研究人员致力于研究癌细胞的迁移和侵袭过程，以更深入地理解癌细胞的播散机制，希望这些知识能够推动新型治疗策略的开发。至关重要的是，这些研究必须采用可靠且可重复的检测方法进行。

体外分析细胞运动能力可能具有挑战性。Boyden 小室实验早在多年前即已开发，被公认为侵袭-迁移分析的标准方法7。然而，该方法耗时较长，且结果常不够准确。另一种检测方法是划痕愈合实验8，该方法通过在细胞单层培养物上制造划痕，并在固定时间间隔内拍摄细胞侵袭和迁移的图像。由于连续两次实验结果之间存在较大变异，该技术曾受到广泛批评。然而，现代技术的应用，尤其是显微镜技术的进步，已显著提高了划痕实验的可重复性。视频显微镜可直接置于培养箱中，实时获取细胞迁移图像。这些设备可记录显微数据，并自动分析随时间变化的伤口区域细胞汇合度。本文旨在介绍 Boyden 小室实验和优化后的划痕实验，并讨论每种方法的优势与局限性。

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方案

注意：未加入细胞外基质（ECM）的Boyden小室实验和平面划痕实验被称为迁移实验，而加入细胞外基质（ECM）的相同实验则被称为侵袭实验。

1. Boyden 小室实验

注意：本方案针对 SQ20B 细胞系进行优化，该细胞系源自复发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的喉癌，由美国马萨诸塞州波士顿的 John Little 提供。

第1天

  1. 细胞接种
    1. 在第1天前72小时，于175 cm2 培养瓶中加入12 mL培养基（CM），接种2×106个SQ20B细胞，使其生长至80%汇合度。
      1. 配制SQ20B细胞培养基（CM）时，需在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FCS）、0.04 mg/mL氢化可的松、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素。
    2. 在超净工作台内对细胞进行胰酶消化：吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入2.5 mL含0.5 g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶溶液，在37 °C孵育5分钟，随后加入12.5 mL预热至37 °C的CM终止反应。使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。
    3. 将细胞以每种实验条件6×105个细胞的密度接种于25 cm2 培养瓶中，每瓶加入3 mL CM，于37 °C孵育24小时。

第2天

  1. 细胞饥饿处理及包被小室的准备
    1. 通过将每个培养瓶中的培养基更换为 3 mL 含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的低胎牛血清（FBS）培养基（代替 FBS）来对细胞进行饥饿处理。将细胞在培养箱中饥饿培养 24 小时。
      1. 为制备饥饿条件培养基（s-CM），在 DMEM 中添加 0.1% BSA、0.04 mg/mL 氢化可的松、100 U/mL 青霉素和 0.1 g/L 链霉素。
    2. 进行迁移实验时，进入步骤 1.3。
    3. 进行侵袭实验时，在第 3 天前 12 小时，通过向每个包被的小室中加入 500 μL s-CM 来准备包被的 Boyden 小室。使用 commercially prepared coated Boyden chambers（商品化预包被 Boyden 小室），并在使用前将其保存于 4 °C。将每个 Boyden 小室放入配套板中，并于 37 °C 培养箱中孵育过夜。

第3天

  1. 在Boyden小室中接种细胞
    1. 使用配套培养板制备趋化因子。在24孔配套培养板的每个孔中加入750 μL含10% FBS、0.04 mg/mL氢化可的松、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素的完全培养基。
      1. 根据每种细胞系和每种处理条件调整趋化因子。为制备趋化因子条件培养基（ca-CM），在DMEM中添加10% FCS、0.4 mg/mL氢化可的松、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素。
    2. 将上室转移至已预加液体的配套培养板中，注意避免产生气泡。
    3. 进行侵袭实验时，小心从每个Boyden小室中移除450 μL的CM。
    4. 在超净工作台内，用胰蛋白酶消化细胞。吸去培养基，用无菌PBS洗涤细胞，加入0.5 mL含0.5 g/L EDTA的胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5分钟。加入已预热至37 °C的CM终止反应。使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。
    5. 将3×104个SQ20B细胞接种于500 μL含0.1% BSA的培养基中，最终稀释浓度为6×104个细胞/mL。
      注意：应根据不同的细胞系调整细胞接种浓度。
    6. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育24小时。

第4天

  1. 细胞固定与染色
    1. 在细胞系特异的倍增时间之前固定细胞。SQ20B细胞需在24小时之前固定。
    2. 从配套培养板中取出每个插件，并使用棉签小心清除上室中的细胞。特别需要注意彻底清除位于上室的所有细胞。
    3. 使用提供的染色试剂盒对每个插件单独进行固定和染色，以获得瑞氏-吉姆萨染色（May-Grunwald Giemsa coloration）9。或者，可在另一个配套培养板中使用4%多聚甲醛进行30分钟的固定。
    4. 将插件置于洁净的24孔配套培养板中，在生物安全柜内干燥每个室。

第5天

  1. 显微镜分析
    1. 将带有插入物的配套培养板置于20倍相差显微镜下，计数膜下表面的每一个迁移细胞。通过将物镜从底部向上移动，优化至最佳焦距位置，并将焦点停留在膜的底部区域。
    2. 计算迁移细胞数与接种细胞数之间的比值。每种处理条件下均需重复计数三次。

2. 划痕伤口实验：细胞迁移

注意：必须针对每种类型的细胞调整说明。

第1天

  1. 细胞接种
    1. 在第1天前72小时，于175 cm2培养瓶中加入12 mL完全培养基（CM），接种2 × 106个SQ20B细胞，培养至细胞融合度达到80%。
    2. 在超净工作台内对细胞进行胰酶消化：吸除培养基，用无菌PBS洗涤细胞，加入2.5 mL胰酶-EDTA溶液（0.5 g/L），于37 °C孵育5分钟。加入12.5 mL预热至37 °C的完全培养基终止反应。使用细胞计数仪对细胞进行计数。
    3. 制备预稀释细胞悬液，调整细胞密度为4 × 105/mL，使每孔加入100 μL后最终密度为4 × 104个细胞。该浓度需根据不同的细胞系进行优化，通常应控制在1 × 104至6 × 104个细胞之间。
    4. 取100 μL步骤2.1.2中制备的细胞悬液，接种至96孔板的每个孔中。
    5. 将培养板置于室温静置5分钟，使细胞在孔底均匀分布。
    6. 将培养板放入培养箱，在37 °C条件下孵育12至16小时（最长），使细胞充分贴壁。

第2天

  1. 划痕伤口实验
    1. 从培养箱中取出步骤 2.1 中准备好的培养板。
    2. 在生物安全柜内，根据生产商提供的操作说明，使用商用划痕工具制造伤口。
    3. 立即使用带有适配锥形吸头的移液器吸除每个孔中的培养基，注意不要触碰伤口区域。
    4. 用预热至 37 °C 的 100 μL 条件培养基（CM）对细胞进行两次洗涤，每次均重复吸除操作。
    5. 洗涤步骤完成后，使用带有适配锥形吸头的移液器吸除 CM。
    6. 向每个孔中加入 100 μL 针对不同处理条件的特定培养基。
    7. 尽量避免在孔中产生气泡。此时可采用反向移液技术；或者使用注射器针头手动去除气泡。
    8. 将培养板放入视频显微镜专用的支架中。
    9. 为提高图像质量，在首次扫描前应让培养板预热至少 15 分钟，以避免培养板底面产生冷凝水。
    10. 使用视频显微镜软件设置扫描程序，每个孔采集一张图像。对于侵袭-迁移实验，扫描间隔不得超过 2 小时；若实验目的是生成延时视频，则建议扫描间隔不超过 30 分钟。
    11. 实验结束后，仔细清洗划痕工具，并严格按照生产商推荐的四个清洗步骤进行操作。

第3、4和5天

  1. 使用视频显微镜分析细胞迁移
    1. 持续监测并检查细胞迁移，时间不少于24小时，最长可达5天。
    2. 使用针对每种细胞类型优化的细胞掩模（cell mask）来分析细胞迁移。为获得适用于每种细胞系的细胞掩模，需利用特定的细胞图像集合，通过软件生成相应的细胞处理定义。
    3. 绘制迁移轨迹曲线，并将数据导出至电子表格，用于后续结果的分析与比较。

3. 划痕伤口实验：细胞侵袭

注意：每种细胞类型的说明必须进行相应调整。

第1天

  1. 细胞接种
    1. 采用与步骤 2.1 中所述相同的细胞接种方案。

第2天

  1. 准备细胞外基质（ECM）
    1. 使用前在 4 °C 下解冻基质至少 12 小时。确保无可见的聚集物。若存在聚集物，需将基质在 4 °C 下继续保存更长时间，直至聚集物消失。操作过程中将基质置于冰上，并使用预冷的移液器吸头。
      注意：若未保持在 4 °C，基质会凝固。
    2. 将微量离心管置于冰上预冷 5 分钟。
    3. 从冰箱中取出已冷却至 4 °C 的培养基（CM），在预冷的微量离心管中稀释基质，使其终浓度为 300 μg/mL。
    4. 将已预稀释的基质微量离心管放回 4 °C 冰箱中。
      注意：使用适用于微量离心管的冷却架有助于在整个实验过程中维持管内温度为 4 °C。

第2天

  1. 划痕伤口实验及细胞外基质处理
    1. 从培养箱中取出步骤 3.1 中制备的培养板。
    2. 在生物安全柜中，根据生产商的操作说明，使用商用划痕装置制造伤口。
    3. 立即使用带锥形吸头的移液器小心吸去每孔中的培养基，注意不要触碰伤口区域。
    4. 用 37 °C 预热的完全培养基（CM）重复吸除操作，清洗细胞两次，每次 100 μL。
    5. 第二次清洗后，将培养板置于 4 °C 培养箱中平衡温度 5 分钟。
    6. 使用带锥形吸头的移液器小心从每孔边缘吸除冷培养基，避免触碰伤口。
    7. 使用预冷至 4 °C 的锥形吸头，向每孔加入 50 μL 预先稀释的基质溶液。
    8. 将培养板放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
      注：使用预热至 37 °C 的支撑架有助于加快 96 孔板的升温过程。
    9. 从培养箱中取出培养板，根据各处理条件的要求，向每孔加入 100 μL 适配的完全培养基（CM）。
    10. 尽量避免在孔中产生气泡。此处可采用反向移液技术。或者，可用注射器针头去除气泡。
    11. 将培养板放入视频显微镜中适配的支架内。
    12. 为提高图像质量，在首次扫描前让培养板至少预热 15 分钟，以避免培养板底面产生冷凝水。
    13. 使用视频显微镜软件设置扫描程序，在“划痕伤口”扫描模式下对每孔采集一张图像。对于侵袭-迁移实验，最大扫描间隔为 2 小时；若实验目的是生成视频，则推荐最大扫描间隔为 30 分钟。
    14. 实验结束后，仔细清洗划痕装置，并按照生产商指示完成全部四个清洗步骤。

第3、4和5天

  1. 使用视频显微镜分析细胞侵袭。
    1. 重复步骤 2.3。

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结果

本文报道了两种不同的细胞侵袭和迁移分析方法。图1展示了Boyden小室实验。将插入物置于含有趋化培养基的配套培养板中，并在CM中接种细胞。膜可以不包被（迁移实验）或进行包被（侵袭实验）。将细胞接种至上方小室的s-CM中，下方小室则加入CM作为趋化剂。在细胞倍增时间之前对细胞进行固定。

图2显示了细胞固定后的Boyden小室膜。图2A显示结果不理想，膜的上侧存在细胞团簇。图2B显示结果理想，细胞已固定并染成蓝色，附着于膜上。

图3展示了划痕...

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讨论

本文报道了两种不同的方法用于研究细胞侵袭和迁移过程。分析该过程对于理解与转移性复发相关的因素至关重要，这种复发可能由一类称为癌症干细胞的癌细胞亚群运动能力增强所导致10,11。

Boyden小室实验是研究细胞侵袭和迁移最常用的技术之一。该方法的一个优点是可重复性好，但实验结果在很大程度上依赖于操作者的经验。细胞计数为手动完成，不同操作者之间可能存在差异。许多关键步骤必须标准化并仔细执行，例如确保使用适合每种细胞系的特定趋化因子和饥饿培养基。使用棉签小心去除上层膜上的细胞也至关重要，以获得最佳结果，并避免出现图2A所示的次优结果。如果该实验用于评估细胞通过三维（3D）多孔膜的运动、侵袭和迁移能力，则无法通过延时成像实验对细胞进行动态追踪。此外，带有多孔膜的商用插入式培养小室通常价格昂贵。

本文介绍的基于视频显微镜的划痕伤口实验是一种评估细胞迁移和侵袭能力...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

这些技术的开发得到了 LabEx PRIMES（ANR-11-LABX-0063）、在 ETOILE 科学框架内的国家-大区计划合同（CPER）（CPER 2009-2013）以及 Lyric 基金 INCa-DGOS-4664 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胎牛血清金标GE HealthcareA15-151
水溶性氢化可的松Sigma-AldrichH0396-100MG
青霉素/链霉素 100 XDominique DutscherL0022-100
DMEMGibco61965-026
F12 营养混合物 (1X) + GlutaMAX-IGibco31765-027
EGFPromegaG5021该溶液必须在使用前立即配制，因其极不稳定
Z1 库尔特颗粒计数器Beckman Coulter6605698
光学显微镜Olympus CKX31
SQ20B 细胞系由 John Little’s 实验室惠赠-
伤口生成仪Essen Bioscience4494存放于安全干燥处
96 孔 ImageLock 培养板Essen Bioscience4379
CoolBox 96F 系统配 CoolSink 96FEssen Bioscience1500-0078-A00
CoolBox 配 M30 系统Essen Bioscience1500-0078-A00
Boyden 小室插入物Dominique Dutcher353097
包被型 Boyden 小室插入物Dominique Dutcher354483于 -20 °C 保存
24 孔配套培养板Dominique Dutcher353504
BD Matrigel 标准品BD BioScienceBD 354234于 -20°C 保存 
RAL 555 染色试剂盒RAL Diagnostics 361550存放于安全干燥处
微量离心管Eppendorf33511

参考文献

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