细胞侵袭和迁移过程的评价: 视频 Microscope-based 刮伤法与博伊登室法的比较

Summary

本研究报告了两种不同的细胞浸润和迁移分析方法: 博伊登室法和体外视频 microscope-based 伤口愈合试验。对这两种实验的协议进行了描述, 并对它们的优缺点进行了比较。

Abstract

肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是癌症进展和复发的主要因素。许多研究探索了迁移和入侵的能力, 以了解癌症细胞传播, 目的是制定新的治疗策略。分析这些能力的细胞和分子基础, 导致细胞的移动性和理化性质的骨架和细胞微环境的表征。多年来, 博伊登室法和刮伤法是研究细胞侵袭和迁移的标准技术。然而, 这两种技术有局限性。博伊登室法检测困难, 费时, 刮伤法重现性低。现代技术的发展, 特别是在显微镜下, 增加了刮伤试验的重现性。利用强大的分析系统, "孵化器" 的视频显微镜可以提供自动和 real-time 的细胞迁移和入侵分析。本论文的目的是报告和比较两种方法用于研究细胞侵袭和迁移: 博伊登室法和优化的体外视频 microscope-based 刮伤法。

Introduction

细胞侵袭和迁移参与癌细胞的传播, 这是抵抗治疗的主要原因¹ , 并可导致癌症治疗后的局部或转移复发²。上皮-间充质过渡 (急诊) 是细胞浸润-移行的初始过程, 癌细胞从上皮细胞转变为间质表型。e-钙黏蛋白是上皮表型的胞外标记物³, 增加的 n-钙黏蛋白和波形的表达是骨髓间质表型的特征⁴。迁移还取决于癌细胞的内在能力, 通过矩阵蛋白酶⁵的作用侵入细胞外基质 (ECM)。

这种 invasion–migration 机制已经被描述为癌症在许多地方, 特别是头颈部癌症⁶。许多研究人员把重点放在迁移和入侵过程上, 以便更好地理解癌细胞的传播, 希望这些知识能导致新的治疗策略。这是至关重要的, 这些研究是使用可靠和重现性的化验。

体外对细胞运动的分析可能具有挑战性。多年前, 博伊登室检测被认为是 invasion–migration 分析的标准⁷。然而, 它是费时, 往往是不准确的。第二个测试是伤口愈合试验⁸, 它涉及在细胞单层培养上进行划痕, 并在固定时间间隔捕获细胞入侵和迁移的图像。由于连续两次试验的结果相差很大, 这一技术受到了广泛的批评。然而, 现代技术的应用, 特别是在显微镜下, 提高了刮伤试验的重现性。视频显微镜可以很容易地在孵化器中引入, 并能产生细胞迁移的 real-time 图像。这些装置记录了显微镜数据, 并提供了一段时间内缠绕细胞汇流的自动分析。本文的目的是描述博伊登室法和优化的刮伤法, 并讨论每种方法的优缺点。

Protocol

注: 不含 ecm 的博伊登室和划痕分析被称为迁移试验, 与 ecm 相同的化验被称为入侵检测。

1. 博伊登室试验

注: 本协议适用于 SQ20B 细胞系, 这是从复发头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 喉癌, 并获得从约翰小 (波士顿, 马萨诸塞州, 美国)。

1天

1. 细胞播种
   1. 种子 2 10⁶ SQ20B 细胞在12毫升培养基中 (cm) 在175厘米²烧瓶中72小时前一天, 允许细胞生长到80% 细胞汇合。
      1. 为 SQ20B 细胞准备 CM, 补充 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 与10% 胎小牛血清 (FCS), 0.04 毫克/毫升氢化可的松, 100 U/毫升青霉素, 和0.1 克/L 链霉素。
   2. 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 冲洗细胞, 并加入2.5 毫升的胰蛋白酶乙酸酸 (EDTA) (0.5 克/升)。孵育细胞5分钟在37° c, 然后停止反应, 增加12.5 毫升的 CM 温暖到37° c。使用单元格计数器计数单元格数。
   3. 在 25 cm²烧瓶中的单元格中, 对每个要计算的条件的单元密度为 6 10⁵单元格进行种子。在3毫升的 CM 中孵育24小时的细胞。

2天

2. 细胞饥饿与包衣室的制备
   1. 用0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 代替 FBS, 用3毫升的 low-fetal 牛血清 (FBS) 培养基取代每个烧瓶中的培养基, 使细胞挨饿。在孵卵器中将细胞饿死24小时。
      1. 准备饥饿 cm (s cm), 补充 DMEM 与 0.1% BSA, 0.04 毫克/毫升氢化可的松, 100 U/毫升青霉素和0.1 克/L 链霉素。
   2. 对于迁移化验, 请转到步骤1.3。
   3. 为入侵试验, 12 小时在3天之前, 准备涂层的博伊登室通过增加500μ l CM 对每个被涂的房间。使用商业准备的涂层博伊登室, 并保持在4° c 使用前。将每个博伊登室放在伴板中, 并在37° c 过夜将其放在孵化器中。

3天

3. 博伊登室的细胞播种
   1. 使用伴板来制备趋化因子。用 10% FBS、0.04 毫克/毫升的氢化可的松、100毫升青霉素和0.1 克/l 链霉素, 填充24井伴侣板的750μ l 的完整培养基。
      1. 适应每个细胞线和每个治疗条件的趋化因子。制备趋化蛋白 cm (ca cm), 补充 DMEM 与 10% FCS, 0.4 毫克/毫升的可的松, 100 U/毫升青霉素, 0.1 克/L 链霉素。
   2. 将上部腔室转换为预伴板, 注意避免气泡。
   3. 为入侵化验, 小心地从每个博伊登室去除450μ l CM。
   4. 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌 PBS 清洗细胞, 加入0.5 毫升的胰蛋白酶 (0.5 克/升), 然后在37° c 下孵育5分钟的细胞。通过增加 CM 加热到37° c 停止反应。使用单元格计数器计数单元格数。
   5. 种子 3 10⁴ SQ20B 细胞在500μ l 0.1% BSA 培养基中, 最后稀释 6 10⁴细胞/毫升。
      注意: 细胞浓度应适应每个细胞系。
   6. 将板放入孵化箱中, 在37° c 为24小时。

4天

4. 细胞固定和染色
   1. 在特定于该单元格线的加倍时间之前修复单元格。在24小时前修复 SQ20B 细胞。
   2. 从辅助板上取下每个插入物, 用棉签小心地从上部腔中取出细胞。这是特别重要的是要删除所有的细胞位于上腔。
   3. 使用所提供的染色套件分别修复和着色每个插入, 以获得可格伦瓦德姬姆萨着色⁹ 。另外, 使用4% 甲醛在另一个同伴板块中进行30分钟的固定。
   4. 将插入物放在一个空的24井伴侣板下, 在实验室罩下晾干每个腔室。

5天

5. 显微分析
   1. 在20相衬显微镜上插入伴板与插入物, 并计算膜下部的每个迁移细胞。通过将目标从底部移到顶部来优化右焦点位置, 并停止膜底部的位置。
   2. 计算迁移细胞数与种子细胞的比值。重复每个治疗条件的每三个计数。

2. 刮伤试验: 细胞迁移

注意: 指令必须适应每种类型的单元格。

1天

1. 细胞播种
   1. 种子 2 x 10⁶ SQ20B 细胞在12毫升厘米在175厘米²烧瓶72小时前一天, 并允许细胞生长到80% 细胞汇合。
   2. 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌 PBS 洗涤细胞, 加入2.5 毫升的胰蛋白酶 EDTA (0.5 克/升), 并在37° c 下孵育5分钟的细胞。停止反应, 增加12.5 毫升的 CM 加热到37° c。使用单元格计数器计数单元格数。
   3. 在 4 x 10⁵/mL 的单元格密度下生成一个小修样本, 在每个井中给出每10μ l 的 4 4¹⁰⁰单元格的最终密度。此浓度必须适应每个单元格线, 并且应在 1 x 10⁴到 6 10⁴单元格的范围内。
   4. 通过沉积100μ l 在步骤2.1.2 中制备的溶液, 将种子细胞放入96井板的每一个井中。
   5. 将板材置于室温下5分钟, 将细胞均匀地分散在井底。
   6. 将板放入孵化箱中, 并允许电池在37° c 时附着在12至 16 h (最大) 的板上。

2天

2. 刮伤试验
   1. 从孵化器中取出步骤2.1 中准备的盘子。
   2. 在引擎盖下, 根据制造商的协议, 用商业伤人装置制造伤口。
   3. 立即从每个井中取出介质, 使用一个适应锥尖端的吸管, 注意不要碰到伤口。
   4. 两次洗涤细胞通过重复的愿望和使用100μ l CM 温暖到37° c 每井。
   5. 在洗涤步骤后, 用吸管与一个适应的锥形尖端移除 CM。
   6. 每一个良好的治疗条件, 添加100μ l 介质。
   7. 尽量避免在油井中产生气泡。反向移技术在这里可能会有所帮助。或者, 用注射器针除去气泡。
   8. 把盘子放到视频显微镜的改装架上。
   9. 为了提高图像质量, 允许板在第一次扫描前至少预热15分钟, 以避免板的下侧凝结。
   10. 计划扫描的时间表, 使用视频显微镜软件在一个图像每井。入侵迁移试验需要最大2小时间隔。如果实验的目的是制作一个视频, 一个间隔30分钟的最大值是首选。
   11. 在实验结束时, 仔细清洗伤人装置, 并按照制造商指示的四洗涤步骤进行操作。

天 3, 4, 和5

3. 利用视频显微镜进行偏移分析
   1. 至少24小时和5天, 监测和检查细胞迁移。
   2. 使用适合每个单元格类型的适当的单元掩码来分析单元格迁移。若要获取适合于每个单元格线的单元掩码, 请使用特定的单元格图像集合从软件生成单元格处理定义。
   3. 跟踪曲线并将数据导出到电子表格, 可用于分析和比较结果。

3. 刮伤试验: 细胞侵袭

注意: 指令必须适应每种类型的单元格。

1天

1. 细胞播种
   1. 如步骤2.1 所述, 对单元播种使用相同的协议。

2天

2. 准备 ECM
   1. 在4° c 使用前, 将基体解冻至少12小时。确保没有可见的聚合。如果聚集体是可见的, 保持矩阵在4° c 较长的时期, 直到聚合体消失。把母体放在冰上使用冷吸管提示。
      注: 如果不保持在4° c, 基体将凝固。
   2. 在冰上冷却离心管5分钟。
   3. 采取 CM 冷却到4° c 从冰箱和稀释基体在冷离心管子获得最后的集中300微克/毫升。
   4. 返回离心管与小修矩阵到冰箱在4° c。
      注: 适用于离心管的冷却机架有助于在整个实验中保持4° c 的管子。

2天

3. ECM 的伤伤分析及处理
   1. 从孵化器中取出步骤3.1 中准备的盘子。
   2. 在引擎盖下, 根据制造商的协议使伤口使用商业伤人装置。
   3. 立即从每个井中取出介质, 使用吸管与适应的锥形尖端, 注意不要触摸伤口。
   4. 通过重复吸入程序和使用100μ l 的 CM 加热到37° c, 清洗两次细胞。
   5. 第二次洗涤后, 将板放在4° c 恒温箱上, 平衡其温度为5分钟。
   6. 取出每个井中的冷媒, 用锥形尖端吸管, 小心地从边缘移开吸管, 避免碰到伤口。
   7. 在4° c 的情况下使用冷锥尖, 将50μ l 的小修矩阵添加到每个井中。
   8. 把盘子放在37° c 的孵卵器里30分钟。
      注:37 ° c 的 prewarmed 支撑架有助于加速96井板的升温。
   9. 从孵化箱中取出盘子, 并在每种治疗条件下加100μ l 的适应 CM。
   10. 尽量避免在油井中产生气泡。反向移技术在这里可能会有所帮助。或者, 用注射器针除去气泡。
   11. 在视频显微镜下把盘子放到适应的货架上。
   12. 为了提高图像质量, 允许板在第一次扫描前至少预热15分钟, 以避免板的下侧凝结。
   13. 计划扫描的时间表, 使用视频显微镜软件在一个图像每井, 在划伤扫描模式。入侵迁移试验所需的最大2小时间隔。如果实验的目的是制作一个视频, 一个间隔30分钟的最大值是首选。
   14. 在实验结束时, 仔细清洗伤人装置, 并按照制造商指示的四洗涤步骤进行操作。

天 3, 4, 和5

4. 利用视频显微镜对细胞浸润进行分析。
   1. 重复步骤2.3。

Results

我们在这里报告两种不同的方法来分析细胞入侵和迁移。图 1显示了博伊登室实验。插入物被放置在具有趋化介质的伴板中, 细胞在 CM 中播种。该膜可以被涂覆 (迁移化验) 或涂层 (入侵检测)。细胞在 s CM 中被播种入上部房间。下部腔内填充 CM 作为趋化因子。细胞在加倍的时间之前被固定。

图 2显示了细胞固定后的博伊登膜。图 2A显示了一个次优结果, 在膜的上部有细胞簇。图 2B显示了在膜上固定和染成蓝色的单元格的最佳结果。

图 3显示了...

Discussion

我们在这里报告两种不同的模式来研究细胞入侵和迁移过程。对这一过程的分析对于了解转移复发的因素是很重要的, 这可能是由于癌细胞亚群的增加运动而解释为肿瘤干细胞^10,11。

博伊登室实验是研究细胞侵袭和迁移的最常用技术之一。这种方法的一个优点是它的重现性, 虽然这项技术是高度依赖于实验者的专长。细胞计数是手动的, 可以不同的实验者。必须对许多关键步骤进行标准化和谨慎处理, 例如确保使用适当的趋化因子和饥饿培养基, 具体到每个细胞线。用棉签从上膜中取出细胞对于确保最佳结果和避免图 2A中显示的次优结果也是至关重要的。如果通过三维 (3D) 多孔膜对细胞的运动、侵袭和迁移能力进行评估, 就不可能通过延时实验来追踪细胞。此外, 带有多孔膜的商用刀片通常是昂贵的。

本文提出的视频 microscope-based 划伤的检测方法是一种评价细胞迁移和侵袭的强有力的技...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胎牛血清黄金	GE Healthcare	A15-151
氢化可的松水溶	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
青霉素/链霉素 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 坚果混合物 （1X） + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	溶液必须在使用前准备好，因为它非常不稳定
Z1 库尔特颗粒	贝克曼库尔特	6605698
光学显微镜	奥林巴斯	CKX31
SQ20B 细胞系	John Little 的礼物s 实验室
负绕式制造机	Essen Bioscience	4494	存放在安全干燥的地方
96 孔 ImageLock 板	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F 系统，带 CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox，带 M30 系统	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden 插件	Dominique Dutcher	353097
Boyden 涂层插入物	Dominique Dutcher	354483	商店在 -20 °C
Companion 24 孔板	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel 标准	BD BioScience	BD 354234	Store at -20&°C。
RAL 555 染色试剂盒	RAL 诊断	361550	存放在安全干燥的地方
离心管	Eppendorf	33511