一步法荧光显微镜评估辐射诱导克隆性细胞死亡模式的实验方案

摘要

电离辐射（IR）诱导的克隆形成性细胞死亡研究对于理解电离辐射对恶性肿瘤和正常组织的影响具有重要意义。本文介绍一种基于荧光显微镜下观察4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色细胞核形态的一步法检测技术，用于评估电离辐射诱导克隆形成性细胞死亡的主要模式。

摘要

研究电离辐射（IR）诱导的克隆形成性细胞死亡对于理解电离辐射对恶性肿瘤和正常组织的影响具有重要意义。本文介绍一种快速、经济的一次性检测方法，可同时评估电离辐射诱导的克隆形成性细胞死亡的主要模式， 即，凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。在本方法中，将生长在盖玻片上的细胞用X射线照射，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色。通过荧光显微镜观察，根据DAPI染色细胞核的特征性形态来识别凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。凋亡的判定依据是出现凋亡小体（即，凝聚且断裂的细胞核）。有丝分裂灾难通过出现两个或更多明显叶状结构的细胞核以及微核来判定。细胞衰老通过衰老相关异染色质灶（即，细胞核DNA呈现30-50个明亮且致密的焦点）。该方法可使实验人员利用不同细胞系、处理条件和/或时间点，便捷地筛选克隆形成性细胞死亡模式，旨在阐明目标细胞在特定条件下的细胞死亡机制。

引言

电离辐射（IR）可诱导多种模式的克隆源性细胞死亡。关于电离辐射诱导的克隆源性细胞死亡的研究，对于理解电离辐射对正常组织的毒性以及提高癌症放射治疗疗效的方法开发具有重要意义。凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老是电离辐射诱导克隆源性细胞死亡的主要模式¹。凋亡是一种由DNA损伤启动的受调控的细胞死亡方式¹。有丝分裂灾难是指由于未修复的DNA双链断裂导致异常有丝分裂而引发的细胞死亡¹。细胞衰老被定义为不可逆的细胞生长停滞状态²；需要注意的是，细胞衰老本身并非细胞死亡，但由于其消除了衰老细胞的克隆源性存活能力，因此被视为一种克隆源性细胞死亡模式。

已开发出多种基于细胞的检测方法，用于分别评估凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。细胞凋亡可通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色、annexin V染色、DNA片段化检测以及通过流式细胞术测定亚G1期细胞周期阶段来评估¹。有丝分裂灾难可通过针对有丝分裂标志物（如MPM2）、TUNEL染色以及透射电镜进行免疫荧光染色来评估¹。细胞衰老可通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、生长停滞检测和透射电镜进行评估¹。重要的是，不同细胞系和处理条件下，克隆源性细胞死亡的主要模式存在差异^3,4。因此，为了阐明特定实验条件下克隆源性细胞死亡的整体特征，必须同时开展涵盖上述所有死亡模式的多种检测，而这需要大量人力和高昂成本。

本文介绍了一种快速且经济高效的单步检测方法，可同时评估电离辐射（IR）诱导的细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老^3,4。该方法中，生长在盖玻片上的细胞经X射线照射后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色。通过荧光显微镜观察，根据DAPI染色细胞核各自的特征性形态，分别识别细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。该方法适用于在不同细胞系、处理条件和时间点筛选克隆形成性细胞死亡谱型，有助于研究特定细胞类型和条件下细胞死亡的机制。

方案

1. 材料准备

1. 高压灭菌盖玻片。
   1. 将盖玻片放入玻璃烧杯中。
   2. 用铝箔覆盖玻璃烧杯。
   3. 在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟。
   4. 在50 °C下干燥，于室温下存放于超净工作台中。
2. 配制固定液：含2%蔗糖的3%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）。
   1. 向一个1,000 mL玻璃瓶中加入700 mL PBS和30 g多聚甲醛。
      注意：多聚甲醛具有腐蚀性，请佩戴合适的手套。
   2. 使用微波炉加热至80 °C，使多聚甲醛完全溶解。
      注意：多聚甲醛蒸气有毒，请佩戴口罩。
   3. 室温静置过夜。
   4. 加入20 g蔗糖。
   5. 加入PBS定容至1 L。
   6. 分装至50 mL离心管中。固定液可在-20 °C保存3年，或在4 °C保存3个月。

2. 细胞培养的准备

注意：这些操作应在培养罩内进行。

1. 培养并传代U2OS人骨肉瘤细胞以维持其对数生长期⁵.
   注意：在确定最佳辐照剂量后，也可使用其他细胞类型。
2. 用经70%乙醇润湿的纸巾擦拭解剖刀。使用解剖刀将盖玻片放置于35 mm细胞培养皿上（下文简称为 "培养皿").
   注意：可根据实验设计增加一个培养皿中盖玻片的数量（参见讨论部分）。
3. 加入1 mL培养基：含10%胎牛血清的DMEM。
   注意：可根据所选细胞类型使用其他培养基。
4. 用经70%乙醇润湿的纸巾擦拭镊子。用镊子轻轻夹住盖玻片中央，同时完全吸去培养皿中的培养基，注意保持对盖玻片的夹持。
   ​注意：此步骤可促进盖玻片在培养皿上的固定。
5. 使用胰蛋白酶消化贴壁培养的细胞⁵.
   1. 吸出培养皿中的培养基。
   2. 加入1 mL PBS，轻轻摇动培养皿。
   3. 吸出培养皿中的 PBS。
   4. 加入1 mL胰蛋白酶溶液［0.25%（w/v）胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA］至培养皿中。
   5. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟₂.
   6. 向培养皿中加入 9 mL 培养基。
   7. 使用1000 μL移液器制备单细胞悬液。
6. 计数细胞⁵.
   1. 在1.5 mL离心管中，加入0.9 mL细胞悬液和0.1 mL 0.4%台盼蓝溶液。
   2. 用血细胞计数板加入10 μL样品。
   3. 观察未染色的数量（即在倒置相差显微镜下观察活细胞。
7. 在15 mL离心管中，用培养基制备3 mL细胞悬液，细胞密度为0.5 x 10⁵ cells/mL
   注意：细胞密度可根据实验需求进行调整（参见 讨论).
8. 轻轻将2 mL细胞悬液加入培养皿中。
9. 在含5% CO₂的环境中，37 °C过夜培养₂.

3. 照射

注意：请根据制造商的说明小心操作X射线辐照仪。

1. 在倒置相差显微镜下观察细胞。确认细胞已贴附于盖玻片上且存活。
2. 使用6 Gy X射线（1.4 Gy/min，300 KVP，20 mA）照射培养皿。
3. 在含5% CO₂的环境中，37 °C孵育72小时。
   注意：孵育时间可根据实验设计进行调整（参见讨论）。

4. 固定

1. 从培养皿中吸除培养基。
2. 使用剪刀，在1,000 μL移液器吸头末端5 mm处剪去吸头尖端。
   注意：剪切后的吸头有助于更平滑地加入固定液。
3. 使用剪切后的吸头，从培养皿侧壁加入1 mL固定液（按步骤1.2配制）至培养皿中。
   注意：此步骤对时间敏感，因此在处理多个样本时应避免更换移液器吸头。直接将固定液加至培养皿底部可能损伤细胞。
4. 将培养皿放入方形培养皿中，轻轻摇动方形培养皿，使固定液均匀覆盖盖玻片。
5. 室温孵育10分钟。
6. 从培养皿中吸除固定液。
7. 从培养皿侧壁加入2 mL PBS至培养皿中。
   注意：直接将PBS加至培养皿底部可能损伤细胞。
8. 从培养皿中吸除PBS。
9. 重复步骤4.7和4.8两次。
   注意：培养皿可在4 °C条件下储存1周，期间盖玻片浸没于2 mL PBS中。

5. DAPI 染色

1. 在载玻片上加入 5 μL 浓度为 1 μg/mL 的 DAPI 染色试剂。
   注意：DAPI 染色试剂在避光且温度为 -20 °C 或更低的条件下可稳定保存 6 个月。
2. 使用手术刀从培养皿中取出盖玻片。
3. 用纸巾轻触盖玻片边缘，吸去盖玻片上多余的 PBS。
4. 将盖玻片细胞面朝下倒置贴附于载玻片上的 DAPI 染色试剂液滴中，使细胞与 DAPI 染色试剂接触。
   注意：此步骤对时间敏感。若 DAPI 染色试剂干燥，可能导致染色效果不佳。
5. 样品可在 -20 °C 条件下保存 1 年。

6. 图像采集

1. 在荧光显微镜下观察样品，使用 DAPI 滤光片观察细胞核。
   注意：可根据研究者需求选择使用 20X 或 60X 油镜。使用 60X 油镜时，需在盖玻片上滴加一滴镜油。注意避免样品接触镜头，否则可能导致镜头损坏。
2. 使用 CCD 相机及数字图像采集软件，在以下设置和参数下采集细胞核图像：DAPI 滤光片、单层图像、增益为 1X、自动曝光。
3. 完成图像采集后：用蘸有镜头清洁剂的纸巾擦拭 20X 镜头；用蘸有氯仿的纸巾擦拭 60X 油镜。

7. 克隆源性细胞死亡方式的评估

1. 在随机选择的图像中，计数符合凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老标准的细胞核数量，直至计数的细胞核总数达到300。每种实验条件下均重复进行三次。
   1. 细胞凋亡的判断标准：凋亡小体的存在（即，浓缩且断裂的细胞核）^6,7.
   2. 有丝分裂灾难的判断标准：出现含有两个或更多明显叶状结构或微核的细胞核^8,9,10.
   3. 细胞衰老的判断标准：存在衰老相关异染色质灶（SAHF）（即，细胞核DNA含有30-50个明亮且致密的焦点^2,11.

结果

以U2OS人骨肉瘤细胞为例，用6 Gy X射线处理后，孵育72小时，并按照方案进行DAPI染色实验。 图1展示了使用60×油镜获得的典型细胞核形态的放大图像，这些形态分别与凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老相关。有关每种克隆性细胞死亡模式的特征形态，请参见步骤7.1.1-7.1.3。 图2 展示了使用20×物镜获得的细胞核的整体图像。6 Gy X射线辐照经常诱导有丝分裂灾难，较少诱导凋亡，极少诱导细胞衰老。通过低倍视野观察，可快速全面了解特定实验条件下克隆性细胞死亡的整体情况。 图3展示了定量数据的图示化结果。

图1：DAPI染色细胞核的放大图像，显示凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的典型形态。 U2OS细胞接受6 Gy X射线辐照，72小时后固定并用DAPI染色。使用60倍油镜获取细胞核图像。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：经 X 射线处理的细胞经 DAPI 染色后的细胞核概览图像。 U2OS 细胞接受 6 Gy X 射线照射或模拟照射。照射后 72 小时，固定细胞并用 DAPI 染色。使用 20X 物镜采集细胞核图像。圆圈标注：凋亡；箭头标注：有丝分裂灾难。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：X射线处理细胞后诱导的细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的定量数据。 U2OS细胞接受6 Gy X射线照射或模拟照射。照射72小时后，固定细胞并用DAPI染色。使用20倍物镜获取细胞核图像。从随机视野中，共评估300个细胞核的凋亡（Ap）、有丝分裂灾难（MC）和细胞衰老（Sns）情况。实验重复三次。图中显示平均值，误差线表示标准差。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

方案中的关键步骤如下。首先，细胞应在培养皿上以单层形式生长，因为对于多层细胞，难以对DAPI染色的细胞核进行形态学评估。为此，在步骤2.9中，建议小心地将培养皿转移至培养箱；剧烈晃动培养皿会导致悬浮细胞产生涡流，从而使细胞聚集于培养皿中央。此外，应避免细胞过度汇合而形成多层生长。为此，在步骤2.7中，可根据细胞的群体倍增时间以及照射与固定之间的间隔时间，调整接种至培养皿的细胞数量。建议在固定时细胞汇合度约为80%。其次，固定和DAPI染色过程的速度至关重要即，步骤4和5）。这些步骤在不同样本间所需时间的不一致可能导致细胞核DAPI信号强度的差异，从而影响对形态学的评估。

在步骤2.2中，可增加单个培养皿中盖玻片的数量；一个35 mm培养皿中最多可放置四张盖玻片，使用更大的培养皿可进一步增加数量。在每个培养皿中放置多张盖玻片可高效地对特定处理进行时间过程评估即，可以在多个感兴趣的时间点从培养皿中逐个收集盖玻片。

在步骤 3.2 中，可根据研究人员的兴趣调整照射剂量。对多种细胞系施加一致的剂量，可实现不同细胞系之间克隆源性细胞死亡各模式敏感性的比较。另一方面，对每种细胞系使用等克隆源性存活剂量，则可实现细胞系之间克隆源性细胞死亡特征的比较。等克隆源性存活剂量可通过克隆源性存活实验¹²确定。D₁₀ 值是指达到 10% 克隆源性存活率所需的剂量，是等克隆源性存活剂量常用的终点指标。

在步骤3.3中，从照射到固定的时长可根据研究人员的兴趣进行调整；这一点非常重要，因为不同细胞系和处理条件下，辐射诱导的细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的峰值时间各不相同。本文中，我们选择照射后72小时作为初始筛选克隆形成性细胞死亡谱型的最有用时间点，该选择基于本课题组及他人的多项研究^1,2,3,4,8,9，具体如下：（i）来源于实体瘤的细胞中，X射线诱导的细胞凋亡大多发生在照射后的数天内。（ii）癌细胞中X射线诱导的有丝分裂灾难最显著地出现在因照射引起短暂细胞周期阻滞解除后的第二次或第三次有丝分裂时。细胞周期阻滞的解除通常发生在照射后约24小时，随后每隔约24小时发生一次连续的有丝分裂。（iii）X射线诱导的细胞衰老显现的时间间隔取决于具体的细胞系：某些情况下最早在照射后2天即可观察到，而大多数细胞系则在照射后7天出现。在通过初始筛选获得克隆形成性细胞死亡谱型的整体图像后，时间进程实验将进一步详细阐明特定细胞系和/或条件下每种克隆形成性细胞死亡模式的峰值时间⁴。

需要注意的是，DAPI染色实验与克隆形成存活实验（评估辐射敏感性的金标准方法）不可互换。凋亡和有丝分裂灾难仅持续数小时，因此在特定时间点进行的DAPI染色实验仅能检测该时间点发生的凋亡和有丝分裂灾难。相反，在特定时间点获得的克隆形成存活实验结果则包含了照射后通常为期10 - 14天培养期间内所发生的全部凋亡和有丝分裂灾难的总和。与凋亡和有丝分裂灾难不同，衰老细胞会保留在培养皿中，并在照射后随着时间逐渐累积。因此，DAPI染色实验和克隆形成存活实验的结果均反映了培养期间内所发生的细胞衰老的总量。重要的是，不同细胞系和不同照射剂量所诱导的凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的比例存在广泛差异。综上所述，从理论上讲，一种实验的结果无法直接转换为另一种实验的结果。

DAPI染色实验存在一些局限性。首先，有丝分裂灾难是否是一种独立的细胞死亡方式仍存在争议。在辐射生物学领域，有丝分裂灾难被认为是一种主要的电离辐射（IR）诱导的细胞死亡方式，与其他克隆源性细胞死亡机制不同¹。然而，也有观点认为有丝分裂灾难并非一种独立的细胞死亡方式，而是一个先于细胞死亡（包括凋亡和坏死）发生的前导过程^13,14。因此，细胞凋亡与有丝分裂灾难在一定程度上可能存在重叠。其次，先前的研究表明，在某些细胞系和处理条件下，细胞衰老可在无SAHF形成的情况下发生²。目前，应使用针对每种克隆源性细胞死亡方式专门设计的其他实验方法，以增强特定实验结论的可靠性。第三，DAPI染色实验无法评估除凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老之外的其他克隆源性细胞死亡方式（例如，坏死和自噬）。第四，DAPI染色实验作为预测肿瘤对放射治疗反应的工具，其临床价值尚未明确。从这一角度来看，克隆源性存活实验优于DAPI染色实验，因为它能够评估总的克隆源性细胞死亡量，并且已有研究证实，经2 Gy X射线照射后细胞的存活分数（SF2）与肿瘤对放疗的反应之间存在相关性¹⁵。尽管如此，值得注意的是，克隆源性存活实验在临床上并未被广泛应用，主要原因是其实验操作需要较高的专业技术水平，且数据获取耗时较长（即约14天）。相比之下，DAPI染色实验的操作更为简便，获得结果所需时间显著缩短，约为3至4天。DAPI染色实验作为预测肿瘤对放射治疗反应的潜在工具，将在不久的将来接受临床验证。

综上所述，DAPI染色实验是一种经济高效的单步检测方法，可同时评估电离辐射诱导的克隆形成性细胞死亡的三种主要模式。该方法能够方便地筛选不同细胞系、处理条件和时间点下的克隆形成性细胞死亡模式，旨在阐明特定目标细胞及实验条件下细胞死亡的作用机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片	Matsunami	C013001
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097-250G
磷酸盐缓冲液	Cosmo Bio	16232000
手术刀	Kai Medical	No.20, 520-A
35 mm 细胞培养皿	Falcon	353001
胰蛋白酶	Wako	201-16945
倒置相差显微镜	Shimazu	114-909
X射线辐照仪	Faxitron Bioptics	Faxitron RX-650
方形培养皿	Corning	431110
载玻片	Matsunami	Pro-11
DAPI染色试剂	Cell Signaling	8961S
荧光显微镜	Nikon	ECLIPSE Ni
荧光显微镜 DAPI 滤光片	Nikon	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
荧光显微镜物镜 (20×)	Nikon	Plan Apo λ 20X/0.75
荧光显微镜物镜 (60×, 油镜)	Nikon	Plan Apo λ 60X/1.40 oil
镜油	Olympus	N5218600
CCD相机	Nikon	DS-Qi2
数字图像采集软件	Nikon	NIS-Elements Document
镜头清洁剂	Olympus	OT0552
氯仿	Wako	035-02616