本文概述了一系列用于研究昆虫眼内、外部解剖结构的光学显微镜和电子显微镜技术。这些技术包括针对蚂蚁眼睛优化的多种传统方法、详细的故障排除步骤，以及针对不同样本和感兴趣区域的优化建议。
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本文内容
摘要
摘要
本文概述了一系列可用于研究昆虫眼内外解剖结构的光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）技术。这些技术包括为蚂蚁眼睛研究优化的传统组织学方法，并已调整为可与其他技术（如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM））协同使用。尽管这些技术具有极高的应用价值，但对于初学者而言可能较难掌握，因此本文特别强调针对不同样本的故障排查与优化方法。我们提供了针对完整样本的成像技术（显微摄影和SEM）相关信息，并讨论了各自的优缺点。我们重点介绍了用于测定整只复眼晶状体直径的技术，并探讨了改进该方法的新技术。最后，我们论述了用于LM和TEM的样本制备、切片、染色及成像相关技术，讨论了在样本制备过程中可能遇到的困难以及最佳应对策略。
引言
视觉是大多数动物重要的感觉方式。在导航过程中，视觉尤其关键，可用于精确定位目标、建立并遵循路线，以及获取罗盘信息1,2。昆虫通过一对复眼来感知视觉信息，有些种类还具有一到三个位于背部的单眼，称为小眼3,4,5。
蚂蚁的眼睛具有特殊的研究价值，因为尽管蚂蚁物种极为多样，但在不同物种间仍保留了一些关键特征。尽管在解剖结构、体型大小和生态习性上存在显著差异，绝大多数蚂蚁物种均为真社会性生物，营群居生活；因此，不同物种在视觉上面临相似的挑战，即需要在固定巢穴与资源点之间反复往返导航。从体长0.5至26毫米、从 exclusively diurnal 到 strictly nocturnal 的物种，以及从缓慢爬行的地下种类到善于跳跃的视觉捕食者，蚂蚁中均可观察到相同的基本复眼结构6,7,8,9,
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方案
1. 样本制备
注意：首先需要了解复眼与单眼之间及其在头部的相对位置。这可以通过获取头部背视图像来实现。为此，我们建议对样品进行光学显微摄影或扫描电镜（SEM）技术处理。以下是两种方法的具体步骤。
- 样本采集
- 将样本直接收集并保存于70%乙醇中。尽可能收集不同品级的个体。
- 用时间、日期、地点以及任何其他相关观察信息标记样本例如采集于觅食期间，交配聚集，巢穴位于小枝内部， 等等。)
- 收集足够的样本，以便每种处理组均有多个重复样本。
- 显微摄影与Z轴层扫成像
- 将标本风干后，使用水溶性胶水将其固定在三角点卡上，再将三角点卡插在昆虫针上。具体操作细节参见参考文献18.
- 使用带有Z轴步进电机和彩色相机的高倍体视显微镜进行成像。
- 使用漫射器使样本光照均匀。
- 在不同焦平面上采集图像，并以无损文件格式（如 tiff）保存，然后使用市售软件进行图像聚焦堆叠。
- 扫描电子显微照片
注意：使用乙醇彻底清洁所有工具和工作表面，以避免灰尘....
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结果
本文所述方法可实现对蚂蚁单眼和复眼的详细研究。通过使用Z轴堆叠显微摄影技术对头部背侧进行成像，可获得视觉系统布局的全面概览。图1）。这有助于为解剖做准备，并确定所需的切片角度。该技术还可用于测量头宽、眼长及单眼晶状体直径等参数。扫描电镜成像不仅能提供详细的整体图像，还可获取高倍率、高分辨率的图像。可对眼部特定感兴趣区域进行细致观察，并识别晶状体形状的差异。图2）。扫描电镜图像对于解析具有小眼和单眼的蚂蚁尤为有用。角膜复制品可提供每只眼睛晶状体的形状、大小和数量信息。图3）。利用光学显微技术成像的半薄切片可用于研究眼球的整体内部解剖结构（图 4 和 图5）；这包括晶状体厚度、晶锥直径、晶锥小管的存在与否、小眼面的形状、宽度和长度、背缘区的定位，以及初级和次级色素细胞的位置。该技术.......
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讨论
上述一系列方法可有效用于研究蚂蚁及其他昆虫的视觉系统。这些技术有助于我们理解所研究眼睛的采样分辨率、光学敏感性以及潜在的偏振光敏感性。这些知识为深入探究其视觉功能的生理学和行为学研究提供了重要基础。此外，尽管本文详述的方法主要聚焦于蚂蚁的视觉系统，但这些技术也可应用于其他昆虫，仅需对实验方案进行轻微调整（例如，在较厚的组织中延长固定和渗透时间）。已有经稍作修改的实验方案被用于表征多种昆虫的视觉系统，包括蝉22、蝇类14、蜜蜂23、黄蜂24、蝴蝶25和蛾类26。尽管本文所述大多数技术已应用多年，但本文旨在将其整合于蚂蚁视觉系统研究的背景下，比较不同技术方案，并描述常见的操作误区。
目前有许多成像技术，其应用范围存在重叠，因此很难判断哪种技术最适合当前任务。一个相关的例子是选择用于整体.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢Jochen Zeil、Paul Cooper和Birgit Greiner分享他们在昆虫解剖学方面的知识，并演示了本文所描述的多种技术。我们感谢澳大利亚国立大学先进显微镜中心和麦考瑞大学显微镜单元中才华横溢且富有支持性的工作人员。本研究得到了FRE研究生奖学金以及澳大利亚研究理事会（DE120100019、FT140100221、DP150101172）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蚂蚁 | Myrmecia midas | ||
| 体视显微镜 | Leica M205 FA | ||
| 溅射镀膜仪 | Pro Sci Tech | ||
| 乙醇 | Sigma Aldrich | ||
| 培养皿 | ProSciTech | ||
| 解剖显微镜 | Leica MZ6 | ||
| 昆虫针 | ProSciTech | ||
| 无色指甲油 | 无品牌：任意化妆品店购买 | ||
| 玻璃载片 | ProSciTech | ||
| 剃刀刀片 | ProSciTech | ||
| 镊子 | ProSciTech | ||
| 盖玻片 | ProSciTech | ||
| 复式显微镜 | Leica DM5000 B | ||
| 戊二醛 | Sigma Aldrich | ||
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | ||
| 氯化钾（KCl） | Sigma Aldrich | ||
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Sigma Aldrich | ||
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Sigma Aldrich | ||
| 氯化钠（NaCl） | Sigma Aldrich | ||
| 四氧化锇 | Sigma Aldrich | ||
| 丙酮 | Sigma Aldrich | ||
| Araldite 环氧树脂 | Sigma Aldrich | ||
| 巴斯德吸管 | Sigma Aldrich | ||
| 甲苯胺蓝 | Sigma Aldrich | ||
| 加热板 | Riechert HK120 |
参考文献
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R.
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重印与许可
