数字全息显微镜（DHM）是一种三维成像技术，能够在与明场显微镜相当的分辨率下，对厚度达明场显微镜50至100倍的样品进行成像，并可通过后期处理实现聚焦。本文应用DHM对极低密度的微生物进行识别、计数和追踪，并将其结果与光密度测量、平板计数法和直接计数法进行比较。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
准确检测并计数稀疏细菌样本在食品、饮料和制药加工行业、医学诊断领域，以及太阳系其他行星和卫星的机器人探测任务中的生命探测方面具有广泛应用。目前，稀疏细菌样本的计数依赖于培养平板法或落射荧光显微镜法。培养平板需要较长的培养时间（数天至数周），而落射荧光显微镜法则需要对样本进行复杂的染色和浓缩处理。本文展示了如何使用离轴数字全息显微镜（DHM）对极稀释的细菌培养液（100–104 个细胞/mL）中的细菌进行计数。首先介绍了定制DHM装置的构建方法，并提供了低成本仪器搭建的详细说明。文中讨论了全息技术的基本原理，并基于仪器的光学性能特征和细菌溶液的浓度，采用统计模型估算为检测细胞所需的视频采集时长（表2）。利用未重建的全息图，实时演示了在105、104、103 和100 个细胞/mL浓度下对细胞的视频检测。同时，使用一个开源软件包演示了振幅和相位图像的重建过程。
引言
在许多应用中，准确测定极稀释样品中的细菌数量至关重要：例如水质和食品安全分析1,2,3；血液、脑脊液或痰液中病原体的检测4,5；包括无菌水在内的药品生产6；以及寡营养环境（如开阔海洋和沉积物）中的环境微生物群落分析7,8,9。此外，人们对探测木星和土星冰卫星（特别是木卫二10,11和土卫二12,13,14）上可能存在的现存微生物生命也日益关注，这些天体已被证实拥有地下液态海洋。由于自1978年“维京号”任务以来，尚无任何任务尝试在其他行星上寻找现存生命，因此在太空任务中用于细菌鉴定与计数的技术和仪器....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 细菌的培养与计数
注意：这适用于在适当培养基中培养的几乎所有细菌菌株36。在本示例中，我们使用三种菌株：Serratia marcescens 作为一种常见且易于识别的实验室菌株；以及一种较小且高度运动的环境菌株 Shewanella oneidensis MR-1。为了比较运动性细胞与非运动性细胞的检测效果，还使用了一种非运动性的 Shewanella 突变株 Δ FlgM 作为对照37。所有菌株均在LB培养基（Lysogeny broth）中培养。
- 制备无菌 LB 培养基（每升蒸馏水中含 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl；过滤或高压灭菌）。制备标准的 100 mm 直径 LB-琼脂平板（配方同上，每升加入 15 g 琼脂；121 °C 高压灭菌 20 分钟，冷却至可操作温度后倒板）。将培养基和平板保存于冰箱中。
- 实验前一天，使用正确的无菌和生物安全技术，从新鲜细菌菌落接种 5–6 mL 的"主培养物"培养基。在 30 °C 摇床（120 rpm）中培养约 12 小时。培养时间将取决于菌株和生长速率。在我们的实验中，Shewanella 菌株培养 12 小时；而 Serratia 在 8 小时后收获，....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
实验结果应表明，通过数字全息显微技术（DHM）能够检测极低水平的活菌与死菌。所计数的细菌数量应与使用Petroff-Hauser计数室及平板计数法获得的结果一致。采用标准的统计学方法可评估不同检测方法在各种细菌浓度下的准确性。
图1展示了用于细胞直接计数的Petroff-Hausser计数室及其微结构。图2A显示了一个典型的富集培养平板，已培养足够时间使粘质沙雷氏菌（S. marcescens）形成菌落（室温下培养16小时）。图2B展示了所用所有菌株的生长曲线。尽管分光光度计的具体测量值可能存在差异，在分光光度计的可靠范围内，OD600与菌落计数之间的关系应呈线性；我们测得OD600 ≈ 0.1时，菌液浓度约为108
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
全息图的数值重建：对于全息图的数值重建，采用角谱法（ASM）。该方法涉及将全息图与数字全息显微镜（DHM）的格林函数进行卷积。可通过应用傅里叶卷积定理，按如下方式计算特定焦平面上图像的复波前：
(1)
其中，
是傅里叶变换算子，
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢戈登与贝蒂·摩尔基金会向加州理工学院提供的资助，基金编号为4037和4038。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酵母提取物 | BD Biosciences | 212750 | |
| 胰蛋白胨 | BD Biosciences | 211705 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 7710 | 多种购买选择 |
| 琼脂粉 | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm 培养皿 | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL 培养管 | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | 松盖式 |
| 佩特罗夫-豪泽计数室 | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL 注射器 | BD Biosciences | 309604 | 无需鲁尔锁头 |
| 雄性鲁尔接头转1/16”带刺接头 | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| 可高压灭菌的1/16”内径PVC管（用于流路） | Nalgene | 8000-0004 | 按长度出售，请根据需要购买 |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 样品室 | 定制 | n/a | 参见材料部分 |
| 全息显微镜 | 定制 | n/a | 参见 Wallace 等人 |
| 开源软件 | 定制 | https://github.com/bmorris3/shampoo |
参考文献
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
