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方法文章

使用数字全息显微镜（DHM）定量低浓度微生物

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DOI：

10.3791/56343

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2017年11月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

本文内容

摘要

数字全息显微镜（DHM）是一种三维成像技术，能够在与明场显微镜相当的分辨率下，对厚度达明场显微镜50至100倍的样品进行成像，并可通过后期处理实现聚焦。本文应用DHM对极低密度的微生物进行识别、计数和追踪，并将其结果与光密度测量、平板计数法和直接计数法进行比较。

摘要

准确检测并计数稀疏细菌样本在食品、饮料和制药加工行业、医学诊断领域，以及太阳系其他行星和卫星的机器人探测任务中的生命探测方面具有广泛应用。目前，稀疏细菌样本的计数依赖于培养平板法或落射荧光显微镜法。培养平板需要较长的培养时间（数天至数周），而落射荧光显微镜法则需要对样本进行复杂的染色和浓缩处理。本文展示了如何使用离轴数字全息显微镜（DHM）对极稀释的细菌培养液（100–104 个细胞/mL）中的细菌进行计数。首先介绍了定制DHM装置的构建方法，并提供了低成本仪器搭建的详细说明。文中讨论了全息技术的基本原理，并基于仪器的光学性能特征和细菌溶液的浓度，采用统计模型估算为检测细胞所需的视频采集时长（表2）。利用未重建的全息图，实时演示了在105、104、103 和100 个细胞/mL浓度下对细胞的视频检测。同时，使用一个开源软件包演示了振幅和相位图像的重建过程。

引言

在许多应用中，准确测定极稀释样品中的细菌数量至关重要：例如水质和食品安全分析1,2,3；血液、脑脊液或痰液中病原体的检测4,5；包括无菌水在内的药品生产6；以及寡营养环境（如开阔海洋和沉积物）中的环境微生物群落分析7,8,9。此外，人们对探测木星和土星冰卫星（特别是木卫二10,11和土卫二12,13,14）上可能存在的现存微生物生命也日益关注，这些天体已被证实拥有地下液态海洋。由于自1978年“维京号”任务以来，尚无任何任务尝试在其他行星上寻找现存生命，因此在太空任务中用于细菌鉴定与计数的技术和仪器发展十分有限15。

传统的平板计数法只能检测可培养的细胞，而这些细胞在环境菌株中可能仅占少数，有时少于<1%16。平板培养需要数天至数周的孵育时间才能达到最佳效果，具体时长取决于菌株类型。目前，表型荧光显微镜技术已基本取代平板计数，成为快速、准确进行微生物计数的金标准。通常使用的荧光染料为可结合核酸的核酸标记染料，例如4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）、SYBR Green或吖啶橙17,18,19，尽管许多研究也采用用于指示革兰氏染色特性的荧光指示剂20,21,22,23,24。若不进行预浓缩步骤，这些方法的检测限（LoD）通常约为每毫升105个细胞。通过过滤法可改善检测限。液体样品可通过真空过滤截留在膜上，滤膜通常为聚碳酸酯材质，理想情况下应为黑色以降低背景干扰。低背景染料（如上述DNA染料）可直接应用于滤膜上25。为实现准确的人工计数，每张滤膜上需有约105个细胞，这意味着当样品浓度低于约每毫升105个细胞时，必须采集并过滤较大的样品体积。为系统性地扫描滤膜的全部区域，从而减少计数所需的细胞数量，已开发出激光扫描设备，可将检测限降低至每毫升约102个细胞26。然而，这类设备在大多数实验室中尚不可及，且需要复杂的硬件和软件支持，以便专家确认所观察到的颗粒确为细菌而非杂质。

作为参考，脓毒症成人患者通常在血液中细胞浓度低于<100 个/mL 时开始出现症状，而婴儿则在低于<10 个/mL 时出现症状。成人的采血量为 10 mL，婴儿为 1 mL。基于 PCR 的检测方法会受到人源 DNA 和非致病性微生物 DNA 的干扰，同时也受血液中 PCR 抑制成分的影响27,28。尽管已有多种新兴技术，培养法仍是血流感染诊断的金标准，尤其是在较为偏远的地区或发展中国家。对于地外生命探测，热力学计算可估算生命所需的能量预算，从而推断可能存在的生物量。据估计，在木卫二（Europa）上，1–100 个/mL 的细胞浓度在热力学上是合理的29。从这些数据可以明显看出，在大量水溶液中检测极少量细胞仍是一个重要的未解难题。

本文中，我们展示了利用离轴数字全息显微镜（DHM）检测浓度为 105、104、103 和 100 个细胞/mL 的 Serratia marcescens 以及 Shewanella oneidensis（野生型和非运动突变型）的方法。与传统光学显微镜相比，DHM 的主要优势在于能够以高分辨率同时成像较厚的样品体积；在本实验中，样品室厚度为 0.8 mm。这些样品室是通过使用精密加工的铝制模具（公差 ±50 µm）对聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻制造而成。这相比高倍光学显微镜的景深提高了约 100 倍。DHM 还可提供定量的相位信息，从而实现对光程长度（折射率与厚度的乘积）的测量。DHM 及类似技术已被用于监测细菌和酵母的细胞周期，并计算细菌的干重30,31,32；甚至可通过散射差异来区分不同的细菌菌株33。

我们使用的仪器是专门为微生物研究定制的，此前已有文献报道34,35，本文将展示并讨论其设计与构建。通过注射泵持续向0.25 µL体积的样品室供应水溶液；流速由相机帧率决定，以确保对整个样品体积进行成像。通过统计学计算可预测，在给定浓度下，为检测到足够数量的细胞所需成像的样品体积数。

对于细胞检测应用，无需将全息图重构为振幅和相位图像；分析直接在原始全息图上进行。这节省了大量计算资源和磁盘空间：一段500 Mb的全息视频在重构后将占用1 - 2 Tb的存储空间。然而，我们确实讨论了通过样品深度进行重构，以确认全息图所呈现的是目标物种。数字全息显微术（DHM）的一个重要特性是能够同时监测图像的强度和相位。在强度图像中几乎透明的生物体（如大多数生物细胞）在相位图像中会清晰可见。由于该技术无需标记，因此不使用染料。这对于可能的空间飞行任务应用具有优势，因为染料可能无法耐受任务环境条件，更重要的是，不能假定其对地外生物体有效——这些生物体可能不使用DNA或RNA进行遗传编码。该特性在北极和南极等极端环境下的研究中也具有优势，因为在这些偏远地区携带染料较为困难，且染料在储存过程中可能发生降解。图像向相位和振幅的重构可通过我们发布在GitHub上的开源软件包（SHAMPOO）或使用ImageJ完成。

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方案

1. 细菌的培养与计数

注意：这适用于在适当培养基中培养的几乎所有细菌菌株36。在本示例中，我们使用三种菌株：Serratia marcescens 作为一种常见且易于识别的实验室菌株；以及一种较小且高度运动的环境菌株 Shewanella oneidensis MR-1。为了比较运动性细胞与非运动性细胞的检测效果，还使用了一种非运动性的 Shewanella 突变株 Δ FlgM 作为对照37。所有菌株均在LB培养基（Lysogeny broth）中培养。

  1. 制备无菌 LB 培养基（每升蒸馏水中含 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl；过滤或高压灭菌）。制备标准的 100 mm 直径 LB-琼脂平板（配方同上，每升加入 15 g 琼脂；121 °C 高压灭菌 20 分钟，冷却至可操作温度后倒板）。将培养基和平板保存于冰箱中。
  2. 实验前一天，使用正确的无菌和生物安全技术，从新鲜细菌菌落接种 5–6 mL 的"主培养物"培养基。在 30 °C 摇床（120 rpm）中培养约 12 小时。培养时间将取决于菌株和生长速率。在我们的实验中，Shewanella 菌株培养 12 小时；而 Serratia 在 8 小时后收获，以确保培养物处于对数生长期中期。
  3. 实验当天，测定细菌主培养物的分光光度值（OD600），预期值应在 0.6 至 0.7 范围内。此时应处于对数生长期（由前期实验确定）。若未达到，取 100 µL 主培养物转接到 5 mL 新鲜培养基中，继续培养至对数生长期中期。
  4. 取主培养物样品，使用 Petroff-Hausser 计数板直接计数细胞。此方法可同时计数活细胞和死细胞。
    1. 用微量移液器吸取 10 µL 未稀释的培养物样品，转移至计数板中。
    2. 在显微镜下使用高倍干镜（40X 或 63X，数值孔径 NA 0.7–0.8）进行相差成像。
    3. 至少计数 20 个方格内的细菌，并取平均值。
      注意：仅计数完全位于方格内，以及仅跨越上方和左侧边界（或下方和右侧边界，若偏好此方式）的细菌。若方格由多条线分隔，请选定其中一条作为边界。
    4. 浓度计算公式为：20 个方格的平均值 × 稀释倍数。需注意，当浓度低于<107/mL 时，直接计数法效果不佳。
  5. 对培养物进行系列稀释，用于菌落形成单位（CFU）计数。此方法仅计数活细胞。
    1. 用无菌 0.9% 生理盐水溶液对所选细菌样品进行系列稀释。取 20 µL 细菌溶液加入 180 µL 生理盐水中进行稀释。重复此步骤，直至最低浓度约为 103 个细胞/mL。
    2. 从至少两个稀释度（建议为 103 和 104/mL）中各取 100 µL，接种于适当的固体培养基平板上，使用无菌涂布棒涂布均匀。每个稀释度至少做 3 个重复。
    3. 在适合该细菌生长的温度下过夜培养，或培养至菌落可见。
    4. 计数菌落数量，并根据公式计算菌落形成单位（CFU）：（菌落数 × 稀释倍数）/ 接种体积 = CFU/mL。对各重复的 CFU 值取平均。

2. 数字全息显微镜用高稀释样品的制备

  1. 对DHM及DHM后在LB培养基平板上进行菌落形成单位计数时，对主培养物进行系列稀释（参见1.4.1 - 1.4.4）。该步骤应采用双盲法进行，确保进行记录的人员不知晓每个检测样本中的具体浓度。
    1. 将细菌稀释至10 - 15 mL的最低限度培养基中，该培养基应促进细菌运动性（视情况而定），同时抑制细胞分裂，以确保实验过程中细胞浓度无明显变化。可使用0.9%生理盐水或更特异的运动性培养基。例如，若使用Escherichia coli，运动性培养基中必须含有EDTA38。在本示例中，我们使用0.9%生理盐水。

3. 记录数字全息显微视频

  1. 使用无菌注射器吸取约 10 mL 目标稀释液。
  2. 使用无菌接头和管路将注射器连接至 DHM 样品室。
    注意：已定制微流控室，以确保样品持续流经仪器的光路。更多细节请参见结果部分。实验前，样品室的所有组件均应通过高压灭菌进行灭菌。
  3. 使用注射泵将注射器中的样品持续流经样品室。
    注意：合适的流速取决于流体通道尺寸、期望通量以及数据采集的限制。
  4. 当样品流经样品室时，以适当的帧率连续采集全息图。系统将生成一个时间戳文件，记录每次图像采集的时间，供后续数据分析使用（第 4 部分实验方案）。所有全息图均在室温（23° C）下采集。通过执行相机制造商提供的预编写 C++ 可执行文件来记录全息图。
    注意：合适的帧率取决于所选的流速。本实验建议采用的帧率应确保细菌在通过仪器视场时被成像>2 次。
  5. 给予足够时间，使全部 10 mL 样品流经 DHM 系统。
  6. 为确保实验过程中细菌未发生生长或死亡，取 100 µL DHM 成像后的废液接种于富集培养基平板，用无菌涂布棒涂布均匀，于适宜温度下培养 24 小时，计数形成的菌落。

4. 细胞密度和检测限的计算

  1. 利用获取的全息视频，分析数据中是否存在细菌。
    1. 计算全息图时间序列的像素中值，然后从每个对应像素中减去该中值，以消除全息图中的静态伪影。在 ImageJ 中可通过以下步骤实现：
      1. 转换为 32 位（图像-类型-32 位）
      2. 计算中值（图像-堆栈-Z 投影-中值）
      3. 从堆栈其余部分中减去该中值（处理-图像计算器-减去）
    2. 手动计数可见的艾里环数量及处于焦点内的细胞数量。在 ImageJ 中，使用点工具点击目标对象即可完成。
    3. 每组全息图均附带一个时间戳文件（在采集全息图时记录）。利用该时间戳文件计算图像捕获时刻已泵入的样品总体积。
  2. 通过将检测到的细胞总数除以成像样品的总体积，计算细胞密度。为获得准确的统计结果，需对 5 至 10 帧图像取平均值。

5. 图像重建至振幅与相位

  1. 选择每帧包含 10 - 200 个细胞的代表性视频。将原始（未经中值相减）全息图载入重建软件（示例：ImageJ 数值传播39；SHAMPOO [GitHub]）。
    1. 使用 ImageJ 时，进入 OD-数值传播-数值衍射。
    2. 在提示下绘制傅里叶掩膜，以选择实像或虚像，并消除任何正弦噪声特征。
    3. 通过输入重建距离，在适当的 z 步长下重建振幅和相位。
  2. 对振幅数据进行中值相减，以降低噪声，方法同 4.1.1。
  3. 将数据绘制成三维立方体或投影图。进入插件—体视图。

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结果

实验结果应表明，通过数字全息显微技术（DHM）能够检测极低水平的活菌与死菌。所计数的细菌数量应与使用Petroff-Hauser计数室及平板计数法获得的结果一致。采用标准的统计学方法可评估不同检测方法在各种细菌浓度下的准确性。

图1展示了用于细胞直接计数的Petroff-Hausser计数室及其微结构。图2A显示了一个典型的富集培养平板，已培养足够时间使粘质沙雷氏菌（S. marcescens）形成菌落（室温下培养16小时）。图2B展示了所用所有菌株的生长曲线。尽管分光光度计的具体测量值可能存在差异，在分光光度计的可靠范围内，OD600与菌落计数之间的关系应呈线性；我们测得OD600 ≈ 0.1时，菌液浓度约为108

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讨论

全息图的数值重建：对于全息图的数值重建，采用角谱法（ASM）。该方法涉及将全息图与数字全息显微镜（DHM）的格林函数进行卷积。可通过应用傅里叶卷积定理，按如下方式计算特定焦平面上图像的复波前：

用于信号处理的伽玛函数方程，包含傅里叶变换和卷积符号。 (1)

其中，静态平衡，ΣFx=0，ΣFy=0 方程，示意图，力平衡，矢量分析，物理理论 是傅里叶变换算子，

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢戈登与贝蒂·摩尔基金会向加州理工学院提供的资助，基金编号为4037和4038。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酵母提取物BD Biosciences212750
胰蛋白胨BD Biosciences211705
氯化钠Sigma-Aldrich7710多种购买选择
琼脂粉BD Biosciences214010
10 cm 培养皿VWR10053-704
15 mL 培养管Falcon (Corning Life Sciences)352002松盖式
佩特罗夫-豪泽计数室Electron Microscopy Sciences3920
10 mL 注射器BD Biosciences309604无需鲁尔锁头
雄性鲁尔接头转1/16”带刺接头McMaster-Carr51525K291
可高压灭菌的1/16”内径PVC管（用于流路）Nalgene8000-0004按长度出售，请根据需要购买
注射泵Harvard ApparatusPHD 2000
样品室定制n/a参见材料部分
全息显微镜定制n/a参见 Wallace 等人
开源软件定制https://github.com/bmorris3/shampoo

参考文献

  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
  4. Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
  5. Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
  6. Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
  7. Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
  9. Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
  10. Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
  11. Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
  12. Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
  13. Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
  14. McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
  15. Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
  16. Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
  17. Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
  18. Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
  19. Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
  20. Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
  21. Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
  22. Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
  23. Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
  24. Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
  25. Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
  26. Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
  27. Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
  28. Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427(2014).
  29. Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
  30. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
  31. Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
  32. Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049(2009).
  33. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
  34. Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
  35. Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700(2016).
  36. Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
  37. Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
  38. Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
  39. Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
  40. Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85(2002).

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