本文介绍了一种用于大规模无菌分离和收集游离型人血吸虫毛蚴的实验方案 曼氏血吸虫 及其后续处理以引入 体外 培养
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摘要
摘要
人类血吸虫， 血吸虫 spp. 具有复杂的生活史，在软体动物中间宿主和哺乳动物终末宿主中分别经历无性和有性发育阶段。分离并维持其不同生活史阶段在体外培养的能力 体外 培养条件的优化极大地促进了对寄生虫生长、发育及宿主相互作用的细胞、生化和分子机制的研究。血吸虫病的传播需要在螺类宿主内完成无性繁殖并经历多个幼虫阶段的发育，即从感染性的毛蚴，经过初级和次级胞蚴，最终发育为对人类具有感染性的尾蚴阶段。本文中，我们提供了一种大规模孵化和分离 曼氏血吸虫 从感染小鼠肝脏中获取的卵孵化出的毛蚴，及其后续引入 体外 培养。预计该详细方案将鼓励新研究人员投身并拓展这一重要的血吸虫研究领域。
引言
人类血吸虫 血吸虫 spp. 是血吸虫病的病原体，该病是一种被忽视的热带病，全球约有2.3亿人受到感染1最广泛分布的物种， 曼氏血吸虫，地理分布于南美洲、加勒比群岛、中东及撒哈拉以南非洲地区2. 生命周期 S. mansoni，以及其他血吸虫，其生活史复杂，涉及哺乳动物终宿主和淡水螺类中间宿主，后者属于椎实螺属 Biomphalaria 作为专性中间宿主。
S. mansoni 雄虫和雌虫成虫对寄生于哺乳动物宿主的肠系膜后静脉中进行繁殖，产生已胚胎化的虫卵（卵），这些虫卵嵌入肠黏膜的小静脉末端。随后，虫卵突破血管壁，穿过黏膜组织迁移，最终进入肠腔，并随粪便排出体外。当虫卵进入淡水后，会孵出自由游动的幼虫（毛蚴），毛蚴必须在短时间内找到合适的Biomphalaria 螺类进行感染，以延续其生命周期。该感染过程包括毛蚴附着于螺体外表面，随后主动侵入并进入宿主体内。毛蚴进入螺体后不久，便开始脱去其外层具纤毛的表皮板，形成合胞体，该结构将发育为下一幼虫阶段——初级（母）胞蚴——的新型外表面（体被）。通过无性繁殖，每个初级胞蚴产生并释放出第二代胞蚴，称为次级（子）胞蚴，后者进一步生成并释放大量终末的软体动物体内发育阶段——尾蚴3。尾蚴从螺类宿主逸出后，可自由游动，能够附着于人类或其他合适哺乳动物宿主的皮肤并直接穿透进入体内。进入新宿主后，尾蚴转化为寄生性的童虫阶段，并侵入血管系统。随后，它们迁移至肺部，再移行至肝门静脉，在此发育为成虫，形成雌雄合抱状态，并最终迁移至肠系膜静脉，完成其生命周期。
成功的软体动物体内或 "蜗牛期" 幼虫期血吸虫的发育对于维持人类宿主间传播循环至关重要。其中尤为关键的是自由游动的毛蚴侵入螺类宿主后，早期转化为母胞蚴阶段的时期。根据宿主与寄生虫之间的生理和免疫相容性，在此幼虫发育阶段即决定了感染能否成功建立。4,5,6. 初级孢囊的后续发育及其无性产生次级孢囊的过程，继而由次级孢囊生成可感染人类的尾蚴，还需依赖适宜的生理宿主环境，以满足寄生虫生长和繁殖的全部需求。
迄今为止，关于调控血吸虫与螺类相互作用的生理、生化和分子机制，尤其是参与调控幼虫发育与繁殖或调节宿主免疫反应的分子及通路，人们所知甚少。在实验条件下稳定获取大量这些幼虫阶段材料对于 体外 允许实验操作的培养条件将极大促进发育通路以及细胞生长、分化和繁殖潜在机制的发现。通过鉴定关键的寄生虫通路或机制 体外 实验可用于干扰螺类宿主中幼虫的生长/繁殖，或鉴定螺类宿主在识别和清除毛蚴或母胞蚴阶段中所涉及的免疫机制。
在本文及视频演示中，我们详细描述了一种用于分离大量自由游动的 S. mansoni 用于引入的毛蚴 体外 可对培养物进行后续实验操作（参见 图1 有关实验方案流程的示意图概述）。尽管此前已有类似方法的描述7,8,9，我们认为，提供一份详细的实验方案将有助于研究人员利用该模型来探究与软体动物体内幼虫发育、细胞增殖以及血吸虫与螺类免疫相互作用相关的尚未解决的问题。此外，该方法也可轻松适用于分离其他具有重要医学意义的吸虫（如寄生于膀胱的吸虫）的虫卵 S. haematobium肝吸虫或肺吸虫。
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方案
所有动物护理和实验程序均经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会批准，批准编号为 V005717。以下实验方案涉及在生物安全二级（BSL2）设施中操作人类病原体，尽管本方案中所展示的血吸虫各发育阶段均不感染人类或其他哺乳动物。操作风险等级2（RG2）人类病原体时，须遵循机构的相关管理规定。
注意：我们使用雌性Swiss-Webster小鼠（6周龄），因为它们对感染更为易感10，从而产生更多的虫卵负荷。Tucker 等 描述了该模型系统中使用的小鼠和螺类感染方案11。材料表列出了实施本实验方案所需的所有具体仪器、材料、试剂和动物来源。
1. 感染肝脏的处理
- 在感染后6-7周，通过CO对小鼠实施安乐死2 窒息（以每分钟10-30%的腔室体积速率）。监测小鼠呼吸和心跳停止情况。
注意：通常一次最多可处理20只小鼠。 - 将安乐死的小鼠转移至生物安全柜后，使其仰卧放置，并用70%乙醇喷洒腹部表面，静置1分钟。
- 捏起下腹部皮肤并向上提起，用无菌手术剪在靠近腹部的捏起皮肤基部横向剪开。将切开的皮肤向前牵拉即， 向头部方向分离以暴露肝脏。注意，由于卵诱导的肉芽肿反应，肝脏应呈现肿大并伴有斑点状外观。图2A).
- 取出肝脏，放入含有200 mL无菌1.2% NaCl溶液（含青霉素/链霉素）的烧杯中。
- 对剩余小鼠重复步骤 1.3 和 1.4。
注意：通常一次收获处理20只小鼠。 - 将肝脏置于无菌培养皿中，并使用无菌镊子去除非肝脏脂肪/结缔组织。
- 将修整并清洗后的肝脏转移至含有约 200 mL 无菌 1.2% NaCl 溶液（含青霉素/链霉素）的无菌 250 mL 离心管中。
- 用力振荡装有肝脏的瓶子，然后使用无菌一次性移液管去除表面多余的泡沫或漂浮碎屑。缓慢将剩余的生理盐水倒入含有1%次氯酸钠（消毒剂）的容器或水槽中。
- 向肝脏中加入约 200 mL 新鲜生理盐水，重复步骤 1.8 三次。
2. 肝脏提取与毛蚴分离
- 将肝脏放入一个小的无菌不锈钢匀浆杯中，并加入约 2 mL 的 1.2% NaCl 溶液（图 2B）。
- 用铝箔和培养皿盖住匀浆杯以防止溢出，交替使用低速和高速匀浆 1 分钟（20 秒低速 / 10 秒高速；重复）（图 2C）。
- 将匀浆后的肝脏悬液均匀分配至无菌的 250 mL 离心瓶中（20 个肝脏使用 4 个离心瓶）。
- 加入含抗生素的无菌生理盐水，使每瓶总体积达到约 200 mL。离心前称重并平衡各离心瓶。
- 在 4 oC 条件下，以 290 × g 离心 15 分钟。离心后轻轻将上清液倒入含漂白剂的容器中处理后再丢弃。
- 重复步骤 2.4–2.5 一次。离心前务必充分重悬肝脏沉淀物。
- 在弃去最后一次生理盐水洗涤液（步骤 2.6）后，向沉淀的肝组织中加入 200 mL 含青霉素/链霉素的无菌池水，振荡以重悬沉淀物，并将悬液转移至已灭菌的 1 L 容量瓶中，该容量瓶除瓶颈顶部 3 cm 外，其余部分均用铝箔完全包裹（图 2D）。
注：每 1 L 容量瓶使用两个离心瓶的样品（即 10 个肝脏）。池水可模拟刺激卵内毛蚴孵化所需的自然淡水环境。 - 用无菌池水将容量瓶加水至瓶颈铝箔覆盖处上方约 3 cm。随后立即操作（因毛蚴很快开始孵化），快速吸取约 12 mL 含有表面泡沫和漂浮肝组织的池水，并将其弃入单独的废液管中，再补充等量新鲜无菌池水。
- 重复步骤 2.8 三次以上，每次检查废液管中是否有毛蚴出现。若在洗涤液中观察到毛蚴，则停止进一步清洗。
- 最后一次洗涤后，缓慢加入约 12 mL 预热至 30 oC 的温热无菌池水，使顶部形成清洁、温热的无菌水层，从而建立温度梯度。
注：为避免混合，最好沿容量瓶颈壁缓慢释放水流。 - 将一个小的培养皿盖置于容量瓶口上方，并在铝箔覆盖区域上方的瓶口表面斜向照射强光，以照亮水体上层表面。
注：通常在 5–10 分钟内，受光吸引的游动毛蚴会大量聚集于池水最上层 2–3 cm 范围内（图 3A）。
3. 毛蚴的采集与培养
- 10 分钟后，当尾蚴聚集到水面时，使用无菌移液管移除约 8 mL 池水，并转移至无菌的 15 mL 离心管中。将含有尾蚴的离心管置于冰上。
- 沿容量瓶内壁加入8 mL温热的无菌池水，静置10分钟。
- 每次使用新离心管，重复步骤 3.1 和 3.2 共三次。完成第 4 次离心后th 收集后，将最终的离心管置于冰上10分钟，以使毛蚴沉淀。此组离心管构成第一次收获物。
- 在 4℃ 条件下，以 290 × g 离心含有毛蚴的离心管 1 分钟 o在预冷的冷冻离心机中，于 4°C 离心。
- 立即移除大部分上清液（约 7 mL），注意不要扰动寄生虫沉淀。图3B).
- 将首次收获的所有毛蚴汇集到一个离心管中，然后用约1 mL无菌池水冲洗所有原始离心管，并将冲洗液一并加入 "混合的" 管
- 让寄生虫在冰上静置约 5 分钟，随后在 4 ℃下以 290 x g 离心 1 分钟 oC.
- 小心吸除上清液，加入6–8 mL含有青霉素/链霉素的无菌Chernin平衡盐溶液（CBSS+；见材料表）。
- 轻轻悬浮毛蚴，并将其分装至24孔细胞培养板中（每孔1 mL），随后用6–8 mL CBSS+冲洗离心管，并将1 mL冲洗液加入每孔中。将寄生虫在26 °C下培养 o在常氧条件下。分离出的毛蚴浓度会有所变化，但通常平均约为 ~7000/mL。
- 如果寄生虫仍在向光源聚集，则重复步骤 3.1 至 3.9 以继续收集晚孵化的毛蚴，但将收集间隔时间延长至 15–20 分钟。
注意：这组新试管代表第二次收获。然而，由于毛蚴数量通常较少，一般将所有试管中的幼虫汇集到一个含有2 mL CBSS+的培养孔中。 - 收获并培养 24 小时后，用移液器轻轻吹打各孔中的孢子囊使其重悬。
- 等待几分钟，使寄生虫沉降到孔板底部。待其完全沉降后，小心移除上清液（约1.5 mL），其中含有毛蚴在幼虫转化过程中脱落的大部分纤毛表皮板。此 "转化" 上清液可弃去，或用于后续幼虫分泌产物的研究。
- 向每孔中加入 1.5 mL 新鲜的 CBSS+，轻轻吹打重悬孢子囊。如需进一步洗涤或更换为其他培养基，请重复步骤 3.12。
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结果
绝大多数毛蚴通常会在前两次“收获”中被收集完毕。在CBSS+培养基中孵育分离的毛蚴可诱导其启动毛蚴向母胞蚴的转化过程（图4A-C）。转移至含CBSS+的培养孔后1小时内，大多数毛蚴停止游动（图4A）。培养6小时时，毛蚴正处于主动脱落纤毛化表皮板的过程中（图4B）。伴随此脱落过程，幼虫在转化为初级母胞蚴的同时形成其外层合胞体表膜覆盖结构。大多数寄生虫在CBSS+中培养24–48小时后即可完成幼虫转化，成为形态完整的母胞蚴（图4C）。仅在CBSS+中培养4天后，母胞蚴的存活率预计会下降至约80%。然而，若将母胞蚴先在CBSS+中培养1天，再转入完全Bge（cBge）培养基中继续培养3天，则通常可获得更高的存活率，且幼虫形态更为饱满健壮（图4D）。与...
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讨论
毛蚴的 S. mansoni，如本文所述进行分离和操作时，仅能感染螺类中间宿主，因此在此幼虫发育阶段不构成人类生物危害。然而，为避免螺类发生意外暴露或感染，应谨慎将毛蚴分离操作置于与易感螺类饲养区域不同的地点进行 Biomphalaria 蜗牛物种可能存在或被饲养。强烈建议使用单独的房间，并注册为BSL2级别空间。此外，处理肝脏和幼虫分离过程中使用的所有洗涤液均应使用消毒剂处理（例如，1% 次氯酸钠溶液）处理后方可丢弃。
需要注意的是，从感染小鼠体内手术取出肝脏以及在匀浆/均质化之前对肝脏的后续处理，均需在生物安全柜（BSC）内无菌条件下进行。然而，出于实际操作考虑（便于处理大量样本），其余所有步骤均在已消毒的实验台面上进行，使用无菌容器（例如，匀浆杯、烧瓶、瓶子和试管、移液管等）以及含有抗生素的无菌溶液（生理盐水、池水、CBSS）。所有溶液中均添加抗生素，以进一步防止外源微生物污染。此外，在毛蚴分离与收集步骤（方案第2和第3部分）中，需将小型培养皿盖置于烧瓶口上，以在初步去除泡沫/肝组织碎片以及随后将浓缩毛蚴...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 RO1AI015503 支持。感染血吸虫的小鼠由位于马里兰州罗克维尔市的生物医学研究所内美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）血吸虫病资源中心提供，该中心通过 NIH-NIAID 合同 HHSN272201000005I 获得资助，并通过 BEI 资源进行分发。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Chernin's 平衡盐溶液 (CBSS+) | 配制 1L 溶液 | ||
| 2.8 g 氯化钠 | Fisher Scientific | S271-3 | 将除氯化钙外的所有盐类和糖类溶解于 800 mL ddH2O 中 |
| 0.15 g 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | 糖类溶解于 800 mL ddH2O 中 |
| 0.07 g 磷酸氢二钠，无水 | Fisher Scientific | S374-500 | 将氯化钙单独溶解于 200 |
| 0.45 g 七水合硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O 中 |
| 0.53 g 二水合氯化钙 | Mallinckrodt | 4160 | 在持续搅拌下，缓慢将氯化钙溶液加入盐/糖混合液中 |
| 0.05 g 碳酸氢钠 | Fisher Scientific | S233-3 | 持续混合 |
| 1 g 葡萄糖 | MP Biomedicals | 152527 | 调节 pH 至 7.2，并使用 0.22 |
| 1 g 海藻糖 | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm 一次性瓶顶滤器过滤除菌 |
| 10 mL 100X 青霉素/链霉素 | Hyclone | SV30010 | 使用前加入过滤除菌的青霉素和链霉素溶液 |
| 不完全 Bge 培养基 (Ibge) | 配制 900 mL 溶液 | ||
| 220 mL Schneider’s 果蝇培养基（改良型） | Lonza | 04-351Q | 将 Schneider's 培养基与 680 mL ddH2O 混合 |
| 4.5 g 酶解乳白蛋白水解物 | Sigma-Aldrich | L9010 | 加入乳白蛋白水解物和半乳糖 |
| 1.3 g 半乳糖 | Sigma-Aldrich | G0625 | 调节 pH 至 7.2，并使用 0.22 µm 预灭菌一次性瓶顶滤器过滤除菌 |
| 完全 Bge 培养基 (cBge) | 配制 100 mL 溶液 | ||
| 90 mL 不完全 Bge 培养基 | 灭活 FBS 的操作：将解冻的 FBS 置于 | ||
| 9 mL 热灭活胎牛血清 (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | 60°C 水浴中孵育 1 小时，每 10 分钟轻轻 |
| 1 mL 100X 青霉素/链霉素 | Hyclone | SV30010 | 摇动一次瓶子 将热灭活的 FBS 分装至 15-mL 离心管中 并于 -20°C 保存。 将培养基与 FBS 混合 并使用 0.22 µm 预灭菌 一次性瓶顶滤器过滤除菌 使用前加入青霉素和链霉素 |
| 池水（储备液） | 1L 储备液 | ||
| 12.5 g 碳酸钙 | Fisher Scientific | C64-500 | 将所有盐类加入 1L ddH2O 中混合 |
| 1.25 g 碳酸镁 | Fisher Scientific | M27-500 | 注意盐类不会完全 |
| 1.25 g 氯化钠 | Fisher Scientific | S271-3 | 溶解。 使用前剧烈震荡以悬浮 |
| 0.25 g 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | 盐类，以配制工作液 |
| 池水（工作液） | 配制 1.5L 溶液 | ||
| 0.8 mL 池水储备液（使用前震荡）加入 | 将储备液与 ddH2O 混合 | ||
| 1500 mL ddH2O 中 | 通过高压灭菌（慢速循环）对池水进行灭菌 | ||
| 1.5 mL 100X 青霉素/链霉素 | Hyclone | SV30010 | 使用前加入青霉素和链霉素 |
| 生理盐水（1.2% NaCl） | 配制 1.5L 溶液 | ||
| 18 g 氯化钠溶于 1500 mL ddH2O 中 | Fisher Scientific | S271-3 | 高压灭菌生理盐水以灭菌 |
| 1.5 mL 100X 青霉素/链霉素 | Hyclone | SV30010 | 使用前加入青霉素和链霉素 |
| 其他设备与材料： | |||
| 7-L 小鼠安乐死舱 | 遵循批准的 IACUC 方案编号 V001551 | ||
| 小鼠 | Taconic Biosciences | Swiss-Webster，雌性，6 周龄，鼠源 | |
| CO2 气罐及减压阀 | 无病原体 | ||
| 24 孔组织培养板 | TPP | 92424 | |
| 1-L 容量瓶 | |||
| 光源（150W） | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| 带冷冻功能的摆动转子离心机 | Eppendorf | Model 5810R | |
| 离心瓶（250 mL） | Nalgene | ||
| 15-mL 离心管，无菌 | Corning | 430053 | |
| 无菌一次性移液管 | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm 预灭菌一次性瓶顶滤器 | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| 不锈钢搅拌器 | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| 搅拌杯，容量 100 mL | Waring Commercial | ||
| 倒置复合显微镜 | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
参考文献
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