使用聚焦高分辨率成像技术对大鼠后肢骨微结构进行成像时的正确体位摆放与固定方法 在体 内 微型计算机断层扫描

摘要

本文指导活体显微计算机断层扫描（µCT）设备的使用者如何对大鼠进行麻醉，并正确地固定和约束其后肢，以在胫骨高分辨率成像过程中实现最小程度的移动。该方法可获得高质量图像，经处理后可精确量化骨微结构。

摘要

使用 体内 微型计算机断层扫描（micro-computed tomography，µCT）是一种强大的工具，可在活体动物模型中以高分辨率无创成像内部结构。这使得对同一只啮齿类动物在不同时间点进行重复成像成为可能。该特性不仅减少了实验设计所需的啮齿类动物总数，从而降低了个体间变异的产生，还使研究人员能够评估干预措施的长期或终生效应。为了获取高质量图像，以便后续处理和分析，从而更准确地量化骨微结构的结局指标，使用者需 体内 µCT 扫描仪必须对大鼠进行适当的麻醉，并对后肢进行定位和固定。为此，必须将大鼠麻醉至完全松弛状态，并丧失足底反射。这些指导原则可根据每只大鼠的具体情况进行调整，因为异氟烷的代谢速率可能因品系和体型不同而有所差异。正确的操作技术对于 体内 µCT图像采集能够实现对骨微结构在单个研究内部及多个研究之间的准确且一致的测量。

引言

活体微计算机断层扫描（in vivo µCT）是一种强大的工具，可利用啮齿类动物模型对内部结构进行高分辨率的无损成像。in vivo µCT 的无损特性使得对同一只啮齿类动物在不同时间点进行重复成像成为可能。这一特点不仅减少了实验设计所需的动物总数，从而降低了个体间变异的可能性，还使研究人员能够了解对干预措施的长期反应。通过重复使用 in vivo µCT，小鼠和大鼠实验已阐明了生命周期不同阶段骨微结构和骨矿物质密度（BMD）的发育变化^{1,2,3,4,5,6,7,8}，以及骨骼健康对饮食^9,10、卵巢切除术^7,11和药物干预^8,12,13等干预措施的反应。特定骨骼部位（即胫骨近端、股骨和腰椎）的 BMD 和骨微结构可反映整体骨骼健康状况及骨折风险，因此在量化对干预措施的反应时，这些指标为主要测量参数。

在体 µCT 图像采集过程中，X射线源和探测器围绕被测动物旋转，在多个角度获取二维X射线投影图像 ^14,15图像的质量取决于多种因素，包括但不限于：所选的采集参数（即，空间分辨率，X射线电压，电流，旋转步长，所用滤光片，曝光时间），µCT扫描仪的局限性（即基于扫描仪的伪影（如环形伪影或由灰尘导致的条纹状伪影或部分容积效应）以及动物的正确摆放与固定。前两类因素可根据具体的扫描设备、研究目标以及为优化扫描仪功能或图像处理所需进行的校正，由用户在一定程度上加以调控。而后者，即扫描前啮齿类动物的正确摆放，无论扫描仪本身的限制或所选的采集参数如何，均可独立实现。尽管许多涉及 体内 成像已在文献中发表 ^14,15,16,17，经典手稿风格要求详细 "如何" 无法包含相关信息。因此，本文及配套视频教程的目的正是填补这一空白。本文旨在指导用户 体内 µCT 扫描仪如何麻醉大鼠，并对后肢进行定位和固定，以获取高质量图像，从而更准确地量化骨微结构的结局指标。

防止X射线束穿过除后肢以外的其他物体，对于准确量化骨密度（BMD）和骨微结构参数至关重要。当X射线穿过厚度和密度不同的物体与组织时，部分X射线会被吸收（即 衰减）其穿过的材料。由于样品的测量质量密度受其厚度以及周围组织的存在和厚度影响，因此用于确定骨密度（BMD）的校准模体必须以相同的方式进行扫描。因此，如果X射线束将穿过物体（即在穿过感兴趣区域之前或之后，若存在物体（如尾部）会吸收部分X射线能量，从而干扰所获取的透射图像。此外，在扫描必须与样本扫描高度相似的模体时，这类扫描将极难进行模拟。因此，这些衰减差异会导致骨密度（BMD）测量评估的不准确。为确保操作简便性和测量准确性，最佳做法是尽量减少X射线源、感兴趣区域与X射线探测器之间的遮挡物数量。

在临床前模型中对干预措施引起的骨结构进行纵向评估时，需要反复对动物实施麻醉，以限制其在扫描过程中的活动。目前有多种全身麻醉方法可用于µCT扫描动物，包括注射麻醉和吸入麻醉^1,2,4,5,6,12。与异氟烷等吸入性麻醉剂不同，反复使用注射类全身麻醉剂会导致啮齿类动物（特别是大鼠和豚鼠）体重下降、手术耐受性降低以及其他生理参数的显著变化，提示其反复使用存在明显禁忌^18,19,20。尽管异氟烷具有高挥发性，可实现快速诱导和苏醒，但注射性麻醉剂产生的麻醉深度不一，且麻醉持续时间受动物品系、性别、体成分、禁食状态及昼夜节律等多种因素影响。此外，注射性麻醉剂的使用还面临更严格的国家监管限制，进一步阻碍其应用。相比之下，吸入麻醉通过直接向呼吸系统输送麻醉气体实现，该方法具有诱导和恢复更快、对麻醉时长与深度控制更佳的优势^19,20。然而，吸入麻醉的局限性在于需要专用的挥发器设备，且在诱导、维持和恢复阶段可能引起心率和血压的一定变化^18,19。

方案

本研究经布鲁克大学动物护理委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会制定的指南进行²¹。

1. 使用异氟烷气体进行麻醉

1. 使用麻醉机以约 1–2 L/min 的持续流速，向亚克力玻璃孵育室中预先充满高纯度 O₂（补充图 1）。
2. 将大鼠尾部朝前放入孵育室，并关闭孵育室盖子，确保形成密闭密封。
3. 开始以 1–2 L/min 的流速，将兽用级异氟烷以 3–4%（v/v）的浓度溶于 O₂ 中，通入孵育室（补充图 1）。
   警告：麻醉废气可能对操作人员产生不良影响。必须配备废气清除系统（例如，活性炭过滤器或将废气直接排入通风橱）。
4. 当大鼠无法维持站立时，将其转移至面罩或鼻罩，继续以 1–3% 异氟烷溶于 O₂，以 1–2 L/min 的流速进行麻醉。大鼠主要通过鼻部呼吸，因此只要鼻部被面罩或鼻罩完全覆盖，即可保证充分的麻醉气体输送。
5. 在眼部脆弱的黏膜表面涂抹眼用润滑剂，以防止暴露于逸出的异氟烷气体。
   注意：应确保所用眼用润滑剂不含抗生素，以免影响干预实验的结果。
6. 检测眼睑反射（轻柔刺激眼睑开合时的眼睑闭合反应）和足底反射（夹捏时后肢回缩反应）；随着麻醉深度增加，眼睑反射会先于足底反射消失（补充图 2）。
7. 当达到适当的麻醉深度，且大鼠的眼睑反射和足底反射均消失后，维持以 0.5–2% 异氟烷溶于 O₂，以 1–2 L/min 的流速进行麻醉。
8. 在整个操作过程中，通过直接观察、内置监测系统或实时视频传输，持续监测大鼠的呼吸频率（补充图 3）。

2. 大鼠后肢的定位与固定

1. 将大鼠仰卧位放置于碳纤维扫描床（补充图4).
2. 将右足固定于一个可塑形的泡沫管中，使脚趾从管的一端伸出。使用牙科蜡将足部紧密固定在泡沫管内，并用胶带将泡沫管紧密封合。确保固定足部的泡沫管直径足以牢固地嵌入塑料管中。
3. 将塑料管插入X射线扫描仪床中（补充图5).
4. 将大鼠后肢伸展至绷直状态。注意不要过度伸展腿部，以免对大鼠造成伤害。补充图5因为这可能会因呼吸困难而引发四肢的不自主运动。
5. 将左后肢（未扫描的后肢）连同尾巴一起从扫描视野中拉出，并朝向躯干方向移动， 远离待扫描的伸展腿部。
6. 用美纹纸胶带将左腿（未扫描的后肢）和尾巴固定在相应位置。不要使用黏性更强或更弱的其他材料即，胶带或美纹纸胶带），因为这些材料在移除时可能会伤害大鼠（胶带），或无法提供足够牢固的固定（美纹纸胶带）（补充图6).
7. 用胶带将大鼠的身体在髋部、肩部和头部固定到位。将面罩或鼻罩固定到大鼠身上补充图6).
   注意：用吸水纸轻拍美纹纸胶带的粘性面，以去除其粘附大鼠毛发的能力。不要擦拭美纹纸胶带的两端，以便将其牢固地固定在扫描床上。
8. 用兽医专用绷带包裹大鼠以减少热量散失（补充图6).
   注意：大鼠在全身麻醉状态下，由于体表面积与体重之比较大，会迅速散失热量 ^19,20.
9. 在整个实验过程中，通过持续目视观察大鼠（直接观察或通过实时视频监控），连续监测其呼吸频率。
   注意：此处设置需5分钟，扫描采集时间取决于采集设置，恢复时间为60分钟。
10. 继续获取µCT图像。
    注意：扫描采集的具体参数设置因扫描仪型号、软件系统及具体研究问题而异，但相关文献中已有多种方法学出版物可供参考 ^1,2,9.

3. 麻醉复苏

1. 之后 体内 µCT 扫描完成后，停止向大鼠输送异氟烷，但维持 1-2 L/min 的氧气流速₂.
2. 当大鼠恢复运动控制能力（1-2 分钟）后，将其从呼吸机上移除，并置于笼中单独恢复，笼子部分放置在调至低温的通用加热垫上。已知大鼠在全身麻醉状态下体温会降低约 1 °C。¹⁹在大鼠恢复足够的意识、能够维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
   注意：本研究团队的临床观察表明，大鼠在异氟烷麻醉复苏后立即开始进食，因此在恢复期间为其提供食物和水非常重要。尽管我们观察到了这一行为，但重复的全身麻醉并不会显著增加食物摄入量或体重。 ^1,9.

结果

这种用于大鼠的麻醉方法，以及后肢的定位与固定方法 在体内 µCT成像有助于获取高质量图像，适用于胫骨微结构的分析。正确放置大鼠后肢时，应使腿部完全伸展，并用泡沫材料固定整个足部和踝关节。图1A) 从而获得质量足够高的图像，用于分析小梁骨和皮质骨的微结构（图1B）。后肢固定和约束不当（图1C）可能导致图像出现运动伪影（图1D），而尾巴未完全移出扫描视野（图1E）会干扰被扫描样品对X射线的衰减（图1F）并影响骨矿物质密度（BMD）和组织矿物密度（TMD）的测量结果。上述任何一种放置错误都会导致扫描质量不佳，不应进行后续分析。获得低质量图像将改变对后肢精细小梁网络和皮质结构的定量评估，从而产生不恰当或无定论的数据。¹⁴.

图1. 大鼠后肢放置方式的代表性图像及其相应获取的胫骨近端横截面图像。
(A) 正确放置大鼠后肢，脚踝被泡沫材料完全固定，腿部充分伸展，尾巴从胫骨处拉开，可获得足够的图像质量，如(B)所示的胫骨横截面及其小梁骨和皮质骨的微观结构。(C) 若大鼠后肢放置不当，腿部未完全伸展，脚踝未在泡沫中充分固定，则可能导致(D)运动伪影，在横截面图像中表现为条纹状干扰。(E) 干扰视野的物体，例如未从胫骨移开的尾巴，(F)会影响X射线在胫骨中的衰减，可能导致骨密度（BMD）和组织矿物密度（TMD）测量值发生改变，尽管这种影响在视觉上并不明显。F图左下角显示部分尾巴位于视野中，干扰了随后穿过胫骨的X射线束。左侧图中的红色虚线表示右侧图中所示的横截面位置。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1. 异氟烷麻醉装置。 异氟烷麻醉装置设置为以1-2 L/min的持续流速输送溶于O₂的3-4%异氟烷，用于诱导全身麻醉。请点击此处下载该图。

补充图2. 确保麻醉深度。通过夹捏经面罩或鼻罩持续吸入麻醉剂的大鼠脚趾来检测其足底反射。当腿部轻微伸展时，疼痛反应更为明显。强烈夹捏或使用镊子、钳子可能引起组织损伤，因此不应使用。请点击此处下载该图。

补充图3. 生理信号实时监测摄像头画面的屏幕截图。 请点击此处下载该图片。

补充图4. 大鼠仰卧于碳纤维扫描床。 请点击此处下载该图。

补充图5. 大鼠右足固定于可塑形泡沫管中。 大鼠的右足被固定在可塑形的泡沫管内，脚趾从管口伸出（此处未显示）。泡沫管被固定在一个塑料支架中（详见特定材料/设备列表以获取更详细信息）。请点击此处下载该图。

补充图6. 大鼠被固定在位置上，右腿伸直。 尾巴和左脚用胶带固定于远离右腿的位置（朝向躯干），髋部被固定，大鼠躯干用兽用包裹带（蓝色）缠绕以减少热量散失。请点击此处下载该图。

讨论

本方案为观看者提供了大鼠在麻醉、固定与约束过程中的首个详细操作指南 体内 后肢的µCT扫描。这些指南使用户能够 体内 µCT扫描系统可获取胫骨的高分辨率、高质量图像，用于三维骨微结构的定量分析。为确保正确摆放和固定，本方案中的关键步骤包括对大鼠实施适当的麻醉，并将其后肢远离其他重要结构向外轻柔拉伸至绷直但不处于非自然位置。为获得最佳成像效果，必须将大鼠麻醉至完全松弛状态，并消失眼睑反射和足底反射。此外，应伸展扫描侧肢体，并用泡沫材料固定整个足部和踝关节。上述用于实现扫描肢体最佳定位的方法可确保：1）同一研究中各大鼠后肢保持一致的方向，从而使X射线在围绕样本旋转时穿过每条腿的相同区域；2）避免后肢发生自主或非自主运动，从而最大限度减少运动伪影对图像质量的干扰；3）防止物体遮挡即，尾部）的移动，从而最大限度地减少部分容积效应导致的骨密度（BMD）和组织矿物密度（TMD）测量误差。这些指南可根据每只大鼠的具体情况进行调整，因为异氟烷的代谢速率和体位可能因品系和体型不同而有所差异。 ²²最常见的 在体内 扫描仪专为小型动物模型设计（即小鼠、大鼠、兔子、豚鼠）并配备可互换的动物载物台，以适应不同体型动物的扫描，因此可容纳较广泛的体重范围。

尽管 体内 µCT扫描 如果初次扫描获得的图像质量较差，可允许对大鼠进行重新定位和再次扫描，但重复扫描会使大鼠暴露于额外的辐射剂量以及更长时间的异氟烷麻醉。在四个月内每月重复对大鼠胫骨施加600 mGy的辐射剂量，与对侧后肢相比，不会对骨微结构造成不良影响。 ¹，但这并不能确保连续进行两次扫描的安全性。该技术的其他局限性还包括需要施加外力将后肢拉直并保持固定，这可能会引起骨骼结构的某些改变。尽管扫描过程中对后肢固定程度的严格性将取决于具体的研究目的，但本实验室先前涉及每月重复扫描的研究表明 体内 对一只后肢进行µCT成像，结果显示其皮质骨微结构参数——偏心率——与未接受重复伸展、固定及扫描的对侧后肢存在差异。 ¹偏心率是皮质骨椭圆形状的度量指标，会随负荷变化而发生改变。因此，在采用此方法对后肢进行定位和固定以进行重复实验时 体内 在评估和解读承重微结构参数的变化时，应慎重考虑µCT成像结果。

尽管上述指南已为骨组织的成像与分析提供了指导，但在对后肢软组织进行成像时，必须对实验方案进行适当调整。具体而言，需考虑后肢从躯干延伸并被固定的方式，因为当前的操作会使软组织（肌肉、脂肪组织）在扫描期间处于异常的位置，导致其形态发生改变。因此，在将该模型外推用于后肢软组织成像时，应对固定技术进行一些调整，以减少或消除各组织之间相对位置的变化。

此外，这些指南是基于我们研究团队的经验专门撰写的，但可根据其他市售可得的 体内 µCT 扫描仪。其他建议的固定和约束后肢的方法可能由制造商提供 体内 µCT 扫描系统。大多数市售的 体内 µCT设备制造商列出的可用于固定扫描肢体的可接受材料与方法包括聚丙烯、发泡聚苯乙烯以及装有牙科蜡的塑料管，以固定伸出的足部。然而，本方案所述方法可实现对扫描肢体更精确且一致的定位与固定，从而持续获得高质量图像。本方法所遵循的指南需要使用专门的麻醉设备，例如蒸发器、导管、面罩、诱导室和氧气装置。尽管此类设备的成本较注射麻醉剂略高，但其优势在于研究人员能够快速、精确地控制大鼠的麻醉深度，这一优点优于其他替代方法。

根据本方法视频中概述的指南，使用高分辨率技术的研究人员 体内 用于研究其感兴趣干预措施的微计算机断层扫描（µCT）技术，将能够对大鼠后肢进行准确且一致的定位与固定，以获得高质量的X射线成像。这将为该领域提供连续性的研究基础。 体内 µCT图像采集，有助于提高研究内部的一致性和准确性，并实现文献中不同研究之间的比较。类似地，这些方案和方法也可扩展应用于其他啮齿类动物物种（包括小鼠），尽管需要进行一些调整。 ^2,10例如，将小鼠的足部固定在泡沫管中时可包含踝关节，以最大限度地减少扫描过程中的腿部移动。此外，小鼠的整个足部均可放入泡沫固定器内，因此脚趾不会像固定大鼠足部时那样伸出固定器末端。同时，小鼠身体无需像大鼠一样使用胶带进行相同程度的固定。扫描期间可用于维持小鼠麻醉的小型鼻罩尺寸更小。若无合适的小型鼻罩，可在现有鼻罩上覆盖一副丁腈手套，并在手套上剪开一个小切口，形成适合小鼠鼻部插入的空间，既可输送麻醉气体，又能保持鼻部周围的密封性。

尽管近端胫骨是研究大鼠骨微结构变化的主要部位，但仍需对其他骨骼部位（如股骨和腰椎）进行适当且一致的定位方法进行研究并建立规范，以确保文献中的一致性。然而，在开展涉及腰椎成像的未来研究时，必须考虑到脊柱成像会对周围器官和组织带来辐射暴露的风险。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Fresenius Kabi Animal Health	108737
麻醉蒸发器	Dispomed	990-1091-3SINEWA
废气吸收装置/活性炭过滤器	Dispomed	985-1005-000
微型计算机断层扫描仪	Bruker microCT	SkyScan 1176
牙科蜡	Kerr Dental Laboratory	623
泡沫条（背衬棒）	Rona	CF12086	1”x10’
塑料管	Bruker microCT	SP-3010
碳纤维床板	Bruker microCT	SP-3002
兽用绷带/包扎带	Dura-Tech	17473
眼科凝胶	OptixCare	006CLC-4256	不含抗生素
加热垫	Sunbeam	000731-500-000