小鼠发育期垂体的分离与冠状切片制备

摘要

我们介绍一种从发育中的小鼠分离垂体并制备垂体冠状切片的实验方案。

摘要

垂体或脑下垂体是一个重要的内分泌器官，可分泌对维持内环境稳态至关重要的激素。它由两个具有不同胚胎起源和功能的腺体组成——神经垂体和腺垂体。发育中的小鼠垂体体积微小而脆弱，呈细长的椭圆形。冠状切面可在一个切片中同时显示腺垂体和神经垂体，因此更适用于小鼠垂体的观察。

本实验方案的目的是从发育中的小鼠获取组织结构保存良好的垂体冠状切片。在本方案中，我们详细描述了如何正确解剖和处理发育中小鼠的垂体腺。首先，在解剖前通过心脏灌注甲醛固定小鼠。随后，根据小鼠年龄的不同，采用三种不同的解剖技术以获得完整的垂体腺。对于胚胎期（E）17.5至18.5天的胎鼠以及出生后4天内的新生鼠，需整体解剖包括蝶骨、腺体及三叉神经在内的整个蝶鞍区域。对于出生后第5至14天的幼鼠，将垂体腺连同三叉神经一并整体解剖下来。对于3周龄以上的小鼠，则需小心地将垂体腺从周围组织中分离出来。我们还展示了如何利用周围组织作为解剖标志，将垂体腺以正确的方向包埋，从而获得理想的冠状切片。这些方法有助于分析发育中小鼠垂体腺的组织学和发育特征。

引言

垂体或脑下垂体是一个重要的内分泌器官，可分泌对维持内环境稳态至关重要的激素^1,2。从解剖学上看，垂体是一种“一体两部分”的结构，由神经垂体和腺垂体组成。这两部分具有不同的胚胎起源，功能也截然不同。神经垂体起源于神经外胚层，分泌催产素和抗利尿激素。腺垂体起源于拉特克囊（Rathke's pouch），负责释放多种激素，包括生长激素、催乳素、促甲状腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、促肾上腺皮质激素以及促黑素细胞激素^3,4,5。

垂体位于小鼠颅骨蝶骨（蝶鞍）的背侧表面，并通过一条脆弱的柄状结构附着于脑底。其外侧被三叉神经环绕，前方则与视交叉相邻。^6,7腺体呈长椭圆形，其长轴与头部的长轴垂直。在背侧表面，神经垂体与腺垂体可清晰区分，前者位于背侧中线区域，后者则向侧方和腹侧延伸。出生后发育过程中，垂体的体积在出生后的第一个月内迅速增大。^8,9然而，小鼠垂体体积仍然很小，成年小鼠垂体的平均重量为1.9 mg，长轴直径约为3 mm¹⁰，出生后21天（P21）长轴直径为2 - 2.5 mm，出生时（P0）仅为1 - 1.5 mm。

冠状切面可在一个切片中同时显示小鼠垂体的腺垂体和神经垂体，因此更为理想。然而，由于发育中小鼠垂体体积极小且解剖结构特殊，获取满意的垂体冠状切面需要一定的技术技巧。在本视频文章中，我们将演示如何解剖小鼠垂体并制备不同发育阶段的垂体冠状切片。

方案

C57BL/6小鼠在特定无病原体条件下繁育。所有动物实验方法均符合第二军医大学动物护理与伦理委员会批准的指南。

1. 出生后发育期垂体的解剖

1. 实施麻醉：将新生小鼠（P0 - P5）置于碎冰上以诱导低体温麻醉。对于日龄超过5天的小鼠，按30 µL/g体重剂量经腹腔注射5%乌拉坦以诱导麻醉。通过尾部或足趾夹捏反应评估麻醉效果，待小鼠对伤害性刺激无反应后方可进行后续操作。
2. 将小鼠仰卧位（面朝上，背部向下）固定，用胶带轻轻将前肢和后肢固定在可插针的工作台面上即，聚苯乙烯泡沫塑料）置于化学通风橱内。
3. 进行心脏灌注。
   1. 用手术剪剪开小鼠胸腔，暴露心脏（及其他胸腔器官）。
   2. 用钝头镊子固定跳动的心脏，将26G（0.45 mm）针头插入左心室。针头连接一个装有肝素化磷酸盐缓冲液（PBS；含5 mg/mL亚硝酸钠和10 U/mL肝素，pH 7.4，使用前预热至37 °C）的10 mL注射器。立即用精细剪刀剪开右心房，并开始用预热的PBS灌注全身，直至从右心房流出的液体变澄清。
      注意：新生小鼠大约需要 5 - 10 mL PBS，成年小鼠需要 10 - 20 mL PBS。
   3. 保持针头位置不变，更换为另一支装有4%多聚甲醛（PFA；pH 7.4）的注射器。对新生鼠和P21小鼠分别灌注10 mL和20 mL固定液。
      注意：PFA 有毒，可能引起皮肤和呼吸道刺激以及眼睛损伤。操作时需佩戴手套，并在通风橱中进行。
4. 将经PFA固定的实验小鼠断头，用剪刀剪开颅骨。
   1. 用小镊子轻轻将后脑从颅底抬起。一旦看到蝶鞍的迹象，立即停止抬起，但继续固定住后脑，用精细剪刀剪断连接脑底部的垂体柄和神经纤维。此步骤至关重要，以确保垂体不随脑组织一同被提起。
   2. 然后继续抬起大脑，完整取出脑组织以充分暴露垂体。使用剪刀剪下包含垂体、外侧三叉神经及下方蝶骨的整个蝶鞍区域（约3 x 5 mm²).
5. 将解剖得到的组织放入一个35 mm培养皿或6孔板的一个孔中，其中含有2 mL冰冷的4% PFA（pH 7.4）。在4 °C下固定组织：P0 - P7垂体固定40 min，P14垂体固定1 h，P21 - P28垂体固定1.5 h，成年垂体固定3 h。
6. 垂体的进一步解离
   1. 用10 mL PBS洗涤固定组织，共换液5次，每次15分钟。新生小鼠垂体连同周围组织及下方的蝶骨可直接进行脱水处理。然而，出生5天以上的幼鼠垂体需在体视显微镜下进一步分离。
   2. 将固定好的组织放入含有1 mL PBS的35 mm培养皿中。对于P5至P14期的垂体，使用精细镊子和剪刀去除神经与骨骼之间的结缔膜，并小心地将垂体连同外侧三叉神经整体分离出来，但保留蝶鞍结构。分离出的腺体与神经通过结缔膜相连，具有 "H"-样外观（图1B).
   3. 对于P21及成年垂体组织，去除垂体周围的神经和结缔膜，并将腺体从周围组织中分离。用镜头纸包裹垂体组织，放入包埋盒中。
      注意：用镜头清洁纸包裹微小的垂体有助于防止样本在后续石蜡包埋过程中丢失，并保持组织完整性。若在冷冻包埋过程中将垂体置于小瓶中处理，则可能无需进行包裹。

2. 石蜡包埋与切片

1. 将包埋盒中的标本依次用50%、65%、75%和95%的乙醇溶液各脱水15分钟。随后用三次纯乙醇进行脱水，P0–P4期腺体每次3分钟，P5–P14期腺体每次4分钟，P21及更晚期腺体每次5分钟。用二甲苯透明处理三次，P0–P4期腺体每次3分钟，P5–P14期腺体每次4分钟，P21及更晚期腺体每次5分钟。用熔融石蜡浸透，更换三次，P0–P4期腺体每次7分钟，P5及更晚期腺体则分别为8分钟（两次）和6分钟（一次）。
   注：组织处理的最佳参数可根据经验进行调整。为获得高质量切片，应避免脱水不足或过度。使用二甲苯透明处理时同样需注意此问题。
2. 包埋时的组织定位
   1. 在组织包埋操作台上，将标本从包埋盒中取出，放入已半充满熔融石蜡的底模中。垂体腺的正确方位对于获得满意的冠状切面至关重要。
   2. 对于P21及成年期垂体腺，应使其短轴垂直于底模的底面（即切片平面）。对于P0–P4期和P5–P14期垂体腺，分别以蝶骨和三叉神经作为解剖学定位标志。将标本调整至其三叉神经或蝶骨横板垂直于底模底面的位置。
   3. 用预热的精细镊子轻轻固定组织于所需位置，置于冷却板上直至石蜡半凝固。向模具中补加熔融石蜡，使石蜡块充分冷却至完全凝固。
      注：胚胎第18.5天（E18.5）的垂体可按新生期垂体的方式处理。但E16.5之前（Rathke囊）的垂体应连同整个头部一起包埋，并使其矢状轴（从口部至枕部）垂直于底模底面。
3. 将石蜡块在-20 °C下预冷10–20分钟，然后用切片机切成薄片（推荐厚度为4 µm）。为获得满意的冠状切面，在切片过程中需精细调整石蜡块的位置。将组织切片贴附于多聚赖氨酸包被的玻片上，以防止后续操作中切片脱落。
   注：也可选择将标本在4 °C下依次用15%、30%（W/V）蔗糖溶液（溶于PBS）脱水至沉底，采用相同的定位方法包埋于冷冻包埋剂中，并在干冰上迅速冷冻。随后用恒冷箱切片机将冷冻组织块切成8–10 µm厚的切片。然而，冷冻切片的形态学质量通常低于石蜡切片。

3. H&E 染色与免疫荧光标记

1. 将切片置于55 °C的加热板上孵育，并用二甲苯脱蜡，更换两次，每次4分钟。用95%乙醇和75%乙醇各两次进行脱水，每次3分钟。在摇床上用蒸馏水洗涤切片5分钟。
2. 进行H&E染色时，将切片置于明矾苏木精溶液中染色6分钟，流水冲洗2分钟，用0.2%氨水分化45秒，再用流水冲洗2分钟。随后用95%乙醇脱水1分钟，伊红染色2分钟。依次进行脱水、透明和封片。
3. 免疫荧光标记
   1. 在室温下用含3% H₂O₂和0.01% NaN₃的甲醇处理切片20分钟，以灭活内源性过氧化物酶。将切片置于压力锅中，在修复缓冲液（1 mM EDTA和1 mM Tris-HCl，pH 7.4）中煮沸2分钟进行抗原修复。随后在37 °C下用封闭缓冲液（含5%山羊血清的PBS）封闭30分钟。
   2. 将切片与兔抗生长激素（GH）抗体（1:2,000）或兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（1:2,000）在封闭缓冲液中稀释后，4 °C孵育过夜。
   3. 在37 °C下用二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:300稀释于封闭缓冲液中）孵育切片35分钟。
   4. 在室温下用生物素化酪胺（Biotinyl Tyramide，1:50稀释于含0.3% H₂O₂的Tris缓冲盐水中）扩增信号15分钟，随后用链霉亲和素-Alexa594或488（1:300稀释于封闭缓冲液中，37 °C孵育30分钟）显色。
   5. 在室温下用DAPI（50 mg/L，溶于PBS）对细胞核进行复染5分钟。
      注意：使用酪胺信号放大（TSA）系统扩增信号可能并非必需。也可选用荧光标记的二抗直接检测信号。
4. 使用配备DAPI、Texas Red和FITC滤光片组、×4/0.13至×40/0.75物镜及500万像素相机的荧光显微镜采集图像。分别采用360 nm、488 nm和594 nm激光波长对DAPI、Alexa 488和Alexa 594染色的切片进行成像。根据需要调节各通道的激光功率（通常使用0.8）和曝光时间。在图像采集软件控制下获取图像，并使用图像处理软件对荧光图像进行叠加。

结果

本方案介绍了一种从小鼠胚胎发育过程中分离垂体的方法。对于新生小鼠，从颅底完整取出包含垂体、三叉神经及下方蝶骨的整个蝶鞍区域，微小而精细的垂体在操作过程中保持完整（图1A）。对于出生5天以上的小鼠，垂体与外侧三叉神经相连的部分被分离出来。从出生第7天（P7）小鼠分离的垂体大体结构保存良好（图1B）。在出生第21天（P21）小鼠中，垂体体积较新生小鼠显著增大。在去除周围组织的过程中，成功分离出无明显损伤的垂体（图1C）。

为了在垂体的单一切片中观察到腺垂体和神经垂体的最大区域，优先选择冠状切面。将分离的垂体腺适当定向，以获得理想的冠状切片。苏木精和伊红（H&E）染色显示，在出生后第0天（P0）、第7天（P7）和第21天（P21）的垂体腺中，腺垂体和神经垂体均保持良好的形态...

讨论

由于小鼠垂体体积微小、结构脆弱且具有独特的解剖学特征，获取合适的冠状切面在技术上一直存在困难^6,8。因此，一些研究团队选择采用正中矢状切面来分析胚胎期和新生期垂体的形态^11,12。尽管正中矢状切面也能在单一切片中显示前叶、中间部和后叶，但冠状切面更受青睐，因其能够最大程度地展示这三个部分的结构。特别是对于定量研究，如垂体腺体积和面积的测定，以及凋亡细胞和增殖细胞数量的计数，冠状切面在代表性方面优于正中矢状切面。本文介绍一种适用于分离发育期小鼠垂体腺并制备其冠状切片的方法。

为避免在操作过程中损伤垂体，本方案采用了多种技术。首先，在解剖前通过心脏灌注甲醛固定小鼠。这种固定剂不仅有助于保持器官的结构完整性，还能清除常导致自发荧光的红细胞¹³。其次，完整切取整个蝶鞍区域，以避免使用坚硬的外科器械直接接触垂体。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
工具/设备
直头手术剪	JinZhong	J21010	可从其他供应商购买
精细直头剪	JinZhong	WA1010	可从其他供应商购买
钝头镊子	JinZhong	JD1020	可从其他供应商购买
精细镊子	Dumont	RS-5015	用于垂体分离
26G（0.45 mm）针头	HongDa		用于心脏灌注
注射器（1 mL）	BD	300841	可从其他供应商购买
注射器（10 mL）	BD		可从其他供应商购买
35 mm 培养皿	Corning	430165	可从其他供应商购买
镜头清洁纸	ShuangQuan		可从其他供应商购买
解剖显微镜	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	可从其他供应商购买
包埋盒	Thermo Fisher	22-272423	可从其他供应商购买
组织包埋台系统	KEDEE	KD-BM11	可从其他供应商购买
切片机	Thermo Fisher	HM315R	可从其他供应商购买
Superfrost-Plus 载玻片	Thermo Fisher	22-037-246	可从其他供应商购买
盖玻片	Thermo Fisher	12-543	可从其他供应商购买
荧光显微镜	OLYMPUS	BH2-RFCA	可从其他供应商购买
名称	公司	目录编号	备注
试剂
乌拉坦	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	用于 PBS
KCl	Sigma	P9541	用于 PBS
Na₂HPO₄·12H₂O	Sigma	71650	用于 PBS
K₂HPO₄	Sigma	P2222	用于 PBS
NaNO₂	Sigma	237213
肝素钠注射液	SPH	H31022051	用于灌注生理盐水
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
乙醇	SCR	10009218
二甲苯	SCR	10023418
石蜡	Thermo Fisher	8330
苏木精	Sigma	H9627	用于 H&E 染色
伊红 Y	Sigma	E4009	用于 H&E 染色
兔抗生长激素（GH）抗体	National Hormone		用于免疫染色
抗体	Pituitary Program
兔抗小鼠 GFAP 抗体	Sigma	G9269	用于免疫染色
山羊抗兔 IgG，HRP	Jackson	111-035-003	用于免疫染色
TSA 系统	NEN Life Science Products	NEL700	用于免疫染色
链霉亲和素，Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	用于免疫染色
抗 FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	用于免疫染色