Method Article

发育小鼠垂体的解剖和冠状切片制备

DOI:

10.3791/56356

⸱

November 16th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pathophysiology, Second Military Medical University, 2Department of Cell Biology, Second Military Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了解剖垂体腺和准备垂体冠状区的发展小鼠的协议。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑垂体或垂体是一种重要的内分泌器官, 分泌荷尔蒙对体内稳态至关重要。它由两个腺体组成, 分别具有胚胎的起源和功能--垂体和垂体。发育中的小鼠垂体腺是微小的和微妙的细长椭圆形的形状。冠状部分是首选显示两个垂体和垂体在一个单一的切片的小鼠垂体。

该协议的目的是实现适当的垂体冠状部分与保存完好的组织结构从开发小鼠。在这个协议中, 我们详细地描述了如何解剖和处理脑垂体腺体正确地从开发小鼠。首先, 在解剖前, 用 transcardial 灌注甲醛来固定小鼠。然后应用三种不同的解剖技术, 根据小鼠的年龄, 获得完整的垂体腺。对于胚胎期小鼠 (E) 17.5-18.5 和4天的新生儿, 整个蝶鞍区包括蝶骨、腺体和三叉神经的解剖。对于幼崽的产后天数 (P) 5-14, 垂体腺连接与三叉神经是整体解剖。对于3周以上的小鼠, 脑垂体腺体是从周围组织中仔细解剖的。我们还显示如何在适当的方向上嵌入脑垂体腺体, 利用周围的组织作为地标, 以获得满意的冠状部分。这些方法可用于分析发育小鼠垂体腺的组织学和发育特征。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑垂体或垂体是一个重要的内分泌器官分泌荷尔蒙的必要的稳态1,2。从解剖学上来说, 脑垂体是一个由垂体和垂体组成的 "合一" 结构。这些部分有不同的胚胎起源和作用非常不同地。垂体来源于神经外胚层, 分泌催产素和抗利尿激素。垂体起源于拉特克的囊, 并负责释放激素, 包括生长激素, 催乳素, 促甲状腺激素, 卵泡刺激激素, 促黄体激素, 肾上腺皮质激素激素,黑刺激激素3,4,5。

脑垂体在小鼠颅骨的蝶骨 (蝶鞍鞍) 的背表面上, 由一个脆弱的茎附着在大脑的地板上。它由三叉神经和前在侧面围拢由光学交叉6,7。腺体有一个细长的椭圆形, 其长轴与头部垂直。在它的背表面上, 垂体和垂体可以很容易地被标定, 前者占据背内侧区, 后者在侧面和腹上伸展。在产后发育过程中, 垂体的大小在出生后的第一个月内迅速增加8,9。然而, 鼠脑垂体仍然是非常小的大小与平均重量1....

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Protocol

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C57BL/6 鼠在特定的无病原体条件下繁殖。所有动物实验方法都符合第二军医大学动物保育和伦理委员会批准的指导方针.

1. 产后发育性垂体的解剖

  1. 执行麻醉: 将新生小鼠 (P0-P5) 放在被压碎的冰上以诱发体温过低。对于年龄超过5天的小鼠, 注射5% 的氨基甲酸乙酯 (30 和 #181; 体重的腹腔) 以诱导麻醉。评估对尾部/脚趾捏的反应。只有在鼠标对有害刺激没有反应时才进行.
  2. 将前爪和 hindpaws 轻轻地贴在一个能被固定在一个化学油烟罩内的工作表面上 ( 即 " 发泡胶"), 将鼠标固定在仰卧位 (背面与脸向上).
  3. 执行 transcardial 的灌注.
    1. 用外科剪刀切开小鼠胸腔以暴露心脏 (和其他胸腔器官).
    2. 用钝钳固定跳动的心脏, 并在左心室插入一个 26G (0.45 毫米) 针。针是附着在10毫升注射器充满素磷酸盐缓冲盐水 (PBS; 补充5毫克/毫升亚硝酸钠和 10 U/毫升肝素, pH 7.4, 温暖到37和 #176; 使用前)。立即用细剪刀切割右心房, 并开始灌注身体与温暖的 PBS, 直到液体退出右心房是明确的.
      注意: 对于成年小鼠和 10-20 毫升 pbs, 需要大约 5-10 毫升 pbs.
    3. 保持针到位, 并更换为4....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议提出了一种解剖小鼠垂体腺的方法。对新生小鼠, 从颅底解剖了整个蝶鞍区, 包括垂体、三叉神经和蝶骨下方。在过程中 (图 1A) 中, 细小而精致的脑垂体保持完好。对于5天以上的小鼠, 附着在三叉神经外侧的垂体腺则被隔离。从 P7 小鼠中分离出的脑垂体的总结构保持完好 (图 1B)。对于 P21 小鼠, 与新生小鼠相比, 垂体腺的大小明显增加。在切除周围组织 (图 1C) 时, 脑垂体腺被成功地隔离, 并有隐形损伤。

要查看垂体和垂体在一个单一的脑垂体切片的最大区域, 一个冠状区是首选。经解剖的垂体腺是正确的定向, 以达到满意的冠状段。H 和 #38; E 染色显示 P0、P7 和 P21 垂体腺体的垂体和垂体的保存形态良好 (图 .......

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Discussion

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对于发育中的小鼠垂体, 由于其细小而脆弱的特征和独特的解剖特征6,8, 在技术上很难获得合适的冠状切面。因此, 一些研究小组选择 mid-sagittal 切片来分析胚胎和新生儿垂体的形态学11,12。虽然垂体的 mid-sagittal 部分也能够显示前、中、后叶在一个单一的切片, 冠状区是高度优先, 因为它可以显示这三叶的最大视图。特别是, 对于定量的研究, 如确定脑垂体的体积和面积和计数的凋亡和增殖细胞的数量, 冠状切面优于 mid-sagittal 节的代表。在这里, 我们提出了一个有用的方法解剖脑垂体腺体和准备垂体冠状段从开发小鼠。

为了避免在过程中损害垂体腺, 本协议中使用了几种技术。首先, 在解剖前, 用 transcardial 灌注甲醛来固定小鼠。这种固定剂不仅有助于保护器官的结构, 还能去除经常导致自动荧光

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国国家自然科学基金 (31201086、31470759和 31671219) 和上海自然科学基金 (12ZR1436900) 的资助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<强>工具/设备
手术剪刀-直金中J21010可以从其他供应商处购买
细剪刀-直金中WA1010可以从其他供应商处购买
钝钳金中JD1020可以从其他供应商处购买
细镊子分离垂体DumontRS-5015
心腔灌注26G （0.45mm） 针HongDa
注射器 （1 mL）BD300841可从其他供应商处购买
注射器 （10 mL）BD可从其他供应商处购买
35 mm 培养皿康宁430165可从其他供应商处购买
镜片清洁纸双泉可以从其他供应商处购买
解剖显微镜奥林巴斯SZX-ILLB2-200可以从其他供应商处购买
包埋盒Thermo Fisher22-272423可以从其他供应商处购买
组织包埋控制台系统KEDEEKD-BM11可以从其他供应商
切片机Thermo FisherHM315R可以从其他供应商处购买
Superfrost-Plus载玻片Thermo Fisher22-037-246可以从其他供应商处购买
盖上玻璃Thermo Fisher12-543其他供应商处购买
荧光显微镜OLYMPUSBH2-RFCA其他供应商处购买
名称公司<strong>目录号评论
试剂
氨基甲酸乙BBIEB0448
NaClSigmaS9625用于PBS
KClSigmaP9541
Na2HPO4.12H2OSigma71650用于 PBS
K2HPO4SigmaP2222用于 PBS
NaNO2Sigma237213
素钠注射SPHH31022051灌注盐
水多聚甲醛 （PFA）SigmaP6148
乙醇SCR10009218
二甲苯SCR10023418
石蜡Thermo Fisher8330
苏木精SigmaH9627用于 H&用于
曙红 YSigmaE4009E 染色
兔抗生长激素 （GH）免疫染色全国激素
垂体程序
兔抗小鼠 GFAP 抗体用于免疫染色的SigmaG9269
羊抗兔 IgG，用于Jackson111-035-003免疫染色
TSA 系统NEN 生命科学产品NEL700用于链
霉亲和素免疫染色，Alexa Fluor 594Thermo FisherS32356用于免疫染色
抗 FITC Alexa Fluor 488Thermo FisherA11090用于免疫染色
用于的 用于经的头 处购买可以从可以从酯 肝液 用于 H& 的 E 染色用于抗体的 山免疫染色的 HRP 用于

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
  2. Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
  3. Zhu, X., Gleiberman, A. S.....

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