本方案描述了利用化学交联评估兔巩膜的方法 二次谐波成像与 差示扫描量热法.
方法文章
本方案描述了利用化学交联评估兔巩膜的方法 二次谐波成像与 差示扫描量热法.
通过向结构蛋白(纤维状胶原蛋白)引入化学键(非酶促交联)以增强组织的方法用于治疗,包括光化学交联和组织交联(TXL)技术。此类诱导组织力学性能改变的方法正被应用于角膜变薄(力学强度减弱)性疾病(如圆锥角膜)的角膜,以及进行性近视中出现后巩膜变薄与弱化并可能导致眼轴延长的情况。此类组织增强的主要靶标蛋白为纤维状胶原蛋白,其占角膜和巩膜干重蛋白的绝大部分。幸运的是,纤维状胶原蛋白也是组织细胞外空间中二次谐波生成信号的主要来源。因此,胶原蛋白的修饰(例如通过交联治疗所诱导的改变)有可能通过二次谐波生成显微技术(SHGM)进行检测和定量。利用配备红外激发光源的激光扫描显微系统监测SHGM信号,是一种在生物医学领域广泛应用的前沿成像方法。因此,本研究旨在评估SHGM显微技术作为检测诱导交联效应手段的可行性 离体 兔巩膜,在将化学交联剂注射至Tenon囊下腔(sT)后,该注射方式是眼科临床操作中实现眼部麻醉的标准实践。所用化学交联剂为羟甲基甘氨酸钠(SMG),属于一类称为甲醛释放剂(FARs)的化妆品防腐剂。巩膜与SMG反应后发生改变,导致SHG信号增强,并与热变性温度的偏移相关,后者是评估组织交联效应的常用方法。
人们推测,通过非酶促性巩膜交联(光化学和/或化学方法)可治疗进行性近视,这一假设是合理的,因为抑制胶原蛋白的酶促交联会加剧实验性形觉剥夺(FD)诱导的近视1Elsheikh 和 Phillips2 最近讨论了使用标准的紫外线A照射(UVA)联合核黄素介导的光化学交联(也称为德累斯顿方案),此处简称为核黄素CXL,用于后部巩膜稳定以抑制近视眼轴延长的可行性和潜力。该光化学方法已成功用于治疗眼球前部表面的不稳定即,圆锥角膜和LASIK术后角膜扩张中可见的角膜膨隆。然而,将这种交联(CXL)方案应用于巩膜时,受到诸多因素限制,包括难以用紫外(UV)光源照射到后部巩膜,以及需要处理更大的组织表面积。尽管如此,已有研究应用CXL方法成功抑制了视觉剥夺性(通过睑缘缝合术诱导)兔模型的轴向眼轴延长,但该研究中需对后部巩膜多个区域分别进行多次独立的照射处理3相比之下,注射一种化学稳定剂(即,交联剂)通过sT空间进行注射可能是一种更简便的后巩膜改性方法,可避免引入紫外光源。这种注射技术作为一种有效的眼科麻醉方法已被广泛应用,例如在白内障手术等眼科手术中诱导眼部麻醉4,5,6. Wollensak7 先前已有研究描述使用甘油醛(一种化学交联剂,其作用原理与本研究中所述的甲醛释放剂(FARs)类似)进行巩膜交联注射,以增强兔巩膜的硬度;此外,研究表明,京尼平可限制形觉剥夺性近视豚鼠的眼轴长度增长。8,9。这些研究者已证明,使用可溶性化学试剂相较于光化学交联技术具有明显优势。因此,采用某种可注射化学试剂(包括FARs)进行巩膜交联即,TXL)10可能为控制近视中观察到的巩膜伸长进展提供一种可行的治疗方法。
在本研究所介绍的方案中,我们采用经巩膜注射(sT注射)的方式,将羟甲基甘氨酸钠(SMG)化学交联溶液递送至兔尸体眼的巩膜。此前,我们已应用过类似的方案,用于角膜的表面化学交联。值得注意的是,在先前报道的研究中,通过热变性分析证实,使用SMG可实现浓度依赖性的交联效应,其作用范围显著高于光化学CXL所能达到的水平11。
本文描述了通过巩膜内注射递送SMG后评估其对巩膜组织交联效应的实验方案,包括采用差示扫描量热法(DSC)检测热变性,以及利用二次谐波生成显微成像技术(SHGM)进行分析。
利用差示扫描量热法(DSC),也称为热分析,可测量巩膜组织的热变性转变过程。由于纤维状胶原蛋白构成了巩膜组织中蛋白质的绝大部分,其热变性行为主要由这些胶原蛋白的性质决定。该方法用于评估胶原分子结构的稳定性以及稳定胶原原纤维的交联键,后者是主要的蛋白质三级结构。在DSC加热过程中,当达到某一临界转变温度时,胶原分子发生变性,导致三股螺旋结构解旋,这一过程通常形成明胶。这种热变性会破坏胶原分子链上的氢键,而通过诱导交联的方法可使变性温度向更高温度方向移动12,13。该方法已应用数十年,尤其广泛用于生物材料领域以及制革等工艺中。然而,该方法需要提取巩膜组织,因此仅能作为离体(ex vivo)技术使用。
二次谐波生成显微技术(SHGM)基于具有非中心对称分子环境的特定材料的非线性光学特性。在这些材料中,强光(例如激光产生的光)会生成二次谐波信号,使入射光的频率加倍。已知能够产生二次谐波信号的生物材料包括胶原蛋白、微管和肌球蛋白。例如,当胶原蛋白被波长为860 nm的红外光激发时,会发射出波长为430 nm的可见光范围内的二次谐波信号。二次谐波生成(SHG)信号成像是一种评估治疗性胶原交联的有前景的方法。已知组织中的胶原原纤维能够发射二次谐波信号已有超过30年的历史。14然而,直到最近才获得了高分辨率的图像15 在多种组织中,包括肌腱16皮肤、软骨17,血管18,以及在胶原凝胶中19.
基于这一认识,本研究评估了通过SMG化学诱导胶原交联在巩膜中引起的SHG信号变化。结果表明,巩膜经SMG修饰后,组织胶原纤维束(由胶原原纤维组成的高阶四级结构)产生的SHG信号增强,同时胶原纤维网络的结构形态也发生变化,表现为纤维束的"变直"。
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所有操作均使用完整异系繁殖兔头部中的尸体兔眼进行。遵循了所有机构和国家关于实验动物护理和使用的指南。
1. 溶液的配制
2. 使用SMG进行TXL的巩膜下注射
3. 组织制备
4. 区域DSC分析
5. 用于SHG成像
6. 显微镜操作方案
注意:本实验方案针对激光扫描显微镜优化,用于成像巩膜组织胶原蛋白的背向散射二次谐波信号。
7. DSC 实验方案
注意: 组织制备完成后应立即进行此步骤,用于区域DSC分析;若进行SHGM,则在组织成像后进行此步骤。
8. 图像分析
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热变性温度(Tm)作为评估TXL交联效果的检测方法: 本实验共使用16对兔眼进行TXL操作。本研究的初步部分旨在评估在兔尸体头部通过巩膜隧道(sT)空间单次注射SMG交联剂后,交联效应在组织中的定位情况。此类实验与临床治疗具有相关性,因为在实际治疗中,可能需要在多个位置进行注射,以稳定特定区域的巩膜。
根据基本扩散原理可预测,该效应在注射部位最为显著,同时在邻近区域也产生一定影响,具体取决于溶液的浓度。图1A展示了巩膜分区(以红色空心数字字体编号1-4,进一步细分为16个方格,以黑色细体数字字体编号1-16)的示意图位置,各分区在单次sT注射后分别进行热变性分析,并以色谱索引表示结果。表1列出了各编号分区Tm值相对于相应对照组的变化情况,数据包含40 mM和400 mM两种注射浓度的结果,并提供了基于至少三次独立测定计算得出的...
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已开展的实验表明,二次谐波生成(SHG)信号显微技术可用于评估巩膜胶原交联效应,这为将来将该技术用作针对胶原蛋白的交联治疗监测工具提供了可能。值得注意的是,目前已有一种可捕获该SHG信号的仪器投入临床使用。尽管该仪器最初主要设计用于人体皮肤真皮成像,但已成功应用于角膜和巩膜的成像23。
在比较对照样本和处理样本时,必须保持相同的扫描和成像条件。巩膜组织中胶原的二次谐波生成显微成像需要配备多光子成像功能的荧光显微镜、波长可调范围为800-900 nm的脉冲红外激光器,以及高灵敏度探测器(如GaAsP非共轭扫描(NDD)探测器)。本文所述指南仅作为起点,具体实验条件应根据新实验或不同系统进行优化确定。
角膜和巩膜也已在使用该技术的研究中被同时评估24,25,26,
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢Tongalp Tezel医学博士在sT注射方面的咨询;感谢Theresa Swayne博士在SHG显微镜方面的咨询;以及感谢哥伦比亚大学医学中心欧文研究所设计与生物统计资源中心及生物统计核心设施的Jimmy Duong。
部分由“防盲研究”(Research to Prevent Blindness)以及美国国立卫生研究院资助项目 NCRR UL1RR024156、NEI P30 EY019007、NCI P30 CA013696 和 NEI R01EY020495(DCP)支持。哥伦比亚大学拥有相关知识产权:美国授权专利号:8,466,203 和 9,125,856。国际专利申请中:PCT/US2015/020276。
图像由哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心的共聚焦与专业显微镜共享资源平台采集,该平台由美国国立卫生研究院(NIH)资助(资助号:P30 CA013696,国家癌症研究所)。共聚焦显微镜的购置由NIH资助(资助号:S10 RR025686)。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore,美国马萨诸塞州 | 双蒸去离子水。— 步骤 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc.,美国新泽西州尤因 | 交联试剂 — 步骤 1.1.2 | |
| 带鲁尔锁扣注射器的注射针 | BD Eclipse,美国新泽西州 | 用于Tenon囊下注射的注射器。— 步骤 2.1 | |
| 兔头 | La Granja 禽类公司 | 远交系 | 动物死亡后1小时内分离并运送的兔头。— 步骤 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies,美国纽约州德佩 | 眼内压测量 — 步骤 2.4 | |
| DSC 6000 自动进样器 | Perkin-Elmer,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 热变性分析仪 — 步骤 7.4 | |
| Pyris 软件 | Perkin-Elmer,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | Ver 11.0 | 步骤 7.5 |
| CFI75 复消色差长工作距离 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments,美国纽约州梅尔维尔 | 工作距离为2.0 mm、具有高红外透过率的水浸物镜 — 步骤 8.1.1 | |
| GenTeal | Alcon,美国德克萨斯州沃思堡 | B000URVDQ8 | 以水性凝胶替代水作为物镜浸没介质,防止蒸发 — 步骤 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent,美国加利福尼亚州圣克拉拉,美国 | 脉宽140 fs、重复频率80 MHz、波长可调范围为680 nm至1080 nm的钛宝石脉冲激光器。— 步骤 8.1.11 | |
| AttoFluor 细胞培养腔室 | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | 用于固定盖玻片 — 步骤 8.1.3 |
| 25 mm 圆形盖玻片,#1.5 | Neuvitro Corporation,美国华盛顿州温哥华 | GG-25-1.5 | 步骤 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments,美国纽约州梅尔维尔 | 步骤 8.1.4 | |
| 非扫描式(NDD)GaAsP 检测器 | Nikon Instruments,美国纽约州梅尔维尔 | 配备400–450 nm带通滤光片 — 步骤 8.1.7 | |
| A1R-MP 激光扫描系统 | Nikon Instruments,美国纽约州梅尔维尔 | 兼容红外(IR)多光子激发。— 步骤 8.1.8 | |
| NIS Elements 软件 | Nikon Instruments,美国纽约州梅尔维尔 | Ver 4.3 | 文中简称为 "软件" — 步骤 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 步骤 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering,荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心 | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/,用于步骤 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation,美国华盛顿州雷德蒙德 | Ver 14 | 步骤 9.2.8 |
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