兔巩膜中二次谐波信号作为近视治疗性组织交联（TXL）疗效评估的工具

摘要

本方案描述了利用化学交联评估兔巩膜的方法 二次谐波成像与 差示扫描量热法.

摘要

通过向结构蛋白（纤维状胶原蛋白）引入化学键（非酶促交联）以增强组织的方法用于治疗，包括光化学交联和组织交联（TXL）技术。此类诱导组织力学性能改变的方法正被应用于角膜变薄（力学强度减弱）性疾病（如圆锥角膜）的角膜，以及进行性近视中出现后巩膜变薄与弱化并可能导致眼轴延长的情况。此类组织增强的主要靶标蛋白为纤维状胶原蛋白，其占角膜和巩膜干重蛋白的绝大部分。幸运的是，纤维状胶原蛋白也是组织细胞外空间中二次谐波生成信号的主要来源。因此，胶原蛋白的修饰（例如通过交联治疗所诱导的改变）有可能通过二次谐波生成显微技术（SHGM）进行检测和定量。利用配备红外激发光源的激光扫描显微系统监测SHGM信号，是一种在生物医学领域广泛应用的前沿成像方法。因此，本研究旨在评估SHGM显微技术作为检测诱导交联效应手段的可行性 离体 兔巩膜，在将化学交联剂注射至Tenon囊下腔（sT）后，该注射方式是眼科临床操作中实现眼部麻醉的标准实践。所用化学交联剂为羟甲基甘氨酸钠（SMG），属于一类称为甲醛释放剂（FARs）的化妆品防腐剂。巩膜与SMG反应后发生改变，导致SHG信号增强，并与热变性温度的偏移相关，后者是评估组织交联效应的常用方法。

引言

人们推测，通过非酶促性巩膜交联（光化学和/或化学方法）可治疗进行性近视，这一假设是合理的，因为抑制胶原蛋白的酶促交联会加剧实验性形觉剥夺（FD）诱导的近视¹Elsheikh 和 Phillips² 最近讨论了使用标准的紫外线A照射（UVA）联合核黄素介导的光化学交联（也称为德累斯顿方案），此处简称为核黄素CXL，用于后部巩膜稳定以抑制近视眼轴延长的可行性和潜力。该光化学方法已成功用于治疗眼球前部表面的不稳定即，圆锥角膜和LASIK术后角膜扩张中可见的角膜膨隆。然而，将这种交联（CXL）方案应用于巩膜时，受到诸多因素限制，包括难以用紫外（UV）光源照射到后部巩膜，以及需要处理更大的组织表面积。尽管如此，已有研究应用CXL方法成功抑制了视觉剥夺性（通过睑缘缝合术诱导）兔模型的轴向眼轴延长，但该研究中需对后部巩膜多个区域分别进行多次独立的照射处理³相比之下，注射一种化学稳定剂（即，交联剂）通过sT空间进行注射可能是一种更简便的后巩膜改性方法，可避免引入紫外光源。这种注射技术作为一种有效的眼科麻醉方法已被广泛应用，例如在白内障手术等眼科手术中诱导眼部麻醉^4,5,6. Wolle....

方案

所有操作均使用完整异系繁殖兔头部中的尸体兔眼进行。遵循了所有机构和国家关于实验动物护理和使用的指南。

1. 溶液的配制

1. 用于TXL的SMG制备：
   1. 配制1 mL浓度为0.2 M的碳酸氢钠溶液（NaHCO₃）₃) 溶液，使用 0.0165 g NaHCO₃ 粉末溶于 1 mL 蒸馏水中制备。
   2. 将0.1016 mg粉末状羟甲基甘氨酸钠（SMG）溶解于1 mL蒸馏水中，得到终浓度为800 mM的SMG溶液。调节碳酸氢钠溶液至终浓度为0.1 M NaHCO₃。₃ 以及400 mM SMG。SMG的浓度根据所需的交联效果而定。在本方案中，我们使用了40、100和400 mM的SMG。

2. 使用SMG进行TXL的巩膜下注射

1. 用两支1 mL胰岛素注射器（25G针头）分别吸取400 µL的对照溶液和SMG溶液。
2. 使用垫子将兔子的头部置于侧位平面。可使用泡沫塑料或一叠纸张将头部固定于最佳位置。
3. 使用儿科眼睑撑开器撑开眼睑。
4. 使用压平式眼压计测量初始眼内压（IOP）。
5. 用组织标记笔在角膜缘上中部预定注射部位做标记。
6. 用结膜镊（或任何具有锯齿状圆头的镊子）牵拉注射部位....

结果

热变性温度（Tm）作为评估TXL交联效果的检测方法： 本实验共使用16对兔眼进行TXL操作。本研究的初步部分旨在评估在兔尸体头部通过巩膜隧道（sT）空间单次注射SMG交联剂后，交联效应在组织中的定位情况。此类实验与临床治疗具有相关性，因为在实际治疗中，可能需要在多个位置进行注射，以稳定特定区域的巩膜。

根据基本扩散原理可预测，该效应在注射部位最为显著，同时在邻近区域也产生一定影响，具体取决于溶液的浓度。图1A展示了巩膜分区（以红色空心数字字体编号1-4，进一步细分为16个方格，以黑色细体数字字体编号1-16）的示意图位置，各分区在单次sT注射后分别进行热变性分析，并以色谱索引表示结果。表1列出了各编号分区Tm值相对于相应对照组的变化情况，数据包含40 mM和400 mM两种注射浓度的结果，并提供了基于至少三次独立测定计算得出的.......

讨论

已开展的实验表明，二次谐波生成（SHG）信号显微技术可用于评估巩膜胶原交联效应，这为将来将该技术用作针对胶原蛋白的交联治疗监测工具提供了可能。值得注意的是，目前已有一种可捕获该SHG信号的仪器投入临床使用。尽管该仪器最初主要设计用于人体皮肤真皮成像，但已成功应用于角膜和巩膜的成像²³。

在比较对照样本和处理样本时，必须保持相同的扫描和成像条件。巩膜组织中胶原的二次谐波生成显微成像需要配备多光子成像功能的荧光显微镜、波长可调范围为800-900 nm的脉冲红外激光器，以及高灵敏度探测器（如GaAsP非共轭扫描（NDD）探测器）。本文所述指南仅作为起点，具体实验条件应根据新实验或不同系统进行优化确定。

角膜和巩膜也已在使用该技术的研究中被同时评估^24,25,26,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore，美国马萨诸塞州		双蒸去离子水。— 步骤 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc.，美国新泽西州尤因		交联试剂 — 步骤 1.1.2
带鲁尔锁扣注射器的注射针	BD Eclipse，美国新泽西州		用于Tenon囊下注射的注射器。— 步骤 2.1
兔头	La Granja 禽类公司	远交系	动物死亡后1小时内分离并运送的兔头。— 步骤 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies，美国纽约州德佩		眼内压测量 — 步骤 2.4
DSC 6000 自动进样器	Perkin-Elmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆		热变性分析仪 — 步骤 7.4
Pyris 软件	Perkin-Elmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	Ver 11.0	步骤 7.5
CFI75 复消色差长工作距离 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		工作距离为2.0 mm、具有高红外透过率的水浸物镜 — 步骤 8.1.1
GenTeal	Alcon，美国德克萨斯州沃思堡	B000URVDQ8	以水性凝胶替代水作为物镜浸没介质，防止蒸发 — 步骤 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent，美国加利福尼亚州圣克拉拉，美国		脉宽140 fs、重复频率80 MHz、波长可调范围为680 nm至1080 nm的钛宝石脉冲激光器。— 步骤 8.1.11
AttoFluor 细胞培养腔室	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	用于固定盖玻片 — 步骤 8.1.3
25 mm 圆形盖玻片，#1.5	Neuvitro Corporation，美国华盛顿州温哥华	GG-25-1.5	步骤 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		步骤 8.1.4
非扫描式（NDD）GaAsP 检测器	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		配备400–450 nm带通滤光片 — 步骤 8.1.7
A1R-MP 激光扫描系统	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		兼容红外（IR）多光子激发。— 步骤 8.1.8
NIS Elements 软件	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔	Ver 4.3	文中简称为 "软件" — 步骤 8.1.9
Fiji/ImageJ	美国国立卫生研究院		步骤 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering，荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/，用于步骤 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation，美国华盛顿州雷德蒙德	Ver 14	步骤 9.2.8