兔巩膜中二次谐波信号作为近视治疗性组织交联（TXL）疗效评估的工具

摘要

本方案描述了利用化学交联评估兔巩膜的方法 二次谐波成像与 差示扫描量热法.

摘要

通过向结构蛋白（纤维状胶原蛋白）引入化学键（非酶促交联）以增强组织的方法用于治疗，包括光化学交联和组织交联（TXL）技术。此类诱导组织力学性能改变的方法正被应用于角膜变薄（力学强度减弱）性疾病（如圆锥角膜）的角膜，以及进行性近视中出现后巩膜变薄与弱化并可能导致眼轴延长的情况。此类组织增强的主要靶标蛋白为纤维状胶原蛋白，其占角膜和巩膜干重蛋白的绝大部分。幸运的是，纤维状胶原蛋白也是组织细胞外空间中二次谐波生成信号的主要来源。因此，胶原蛋白的修饰（例如通过交联治疗所诱导的改变）有可能通过二次谐波生成显微技术（SHGM）进行检测和定量。利用配备红外激发光源的激光扫描显微系统监测SHGM信号，是一种在生物医学领域广泛应用的前沿成像方法。因此，本研究旨在评估SHGM显微技术作为检测诱导交联效应手段的可行性 离体 兔巩膜，在将化学交联剂注射至Tenon囊下腔（sT）后，该注射方式是眼科临床操作中实现眼部麻醉的标准实践。所用化学交联剂为羟甲基甘氨酸钠（SMG），属于一类称为甲醛释放剂（FARs）的化妆品防腐剂。巩膜与SMG反应后发生改变，导致SHG信号增强，并与热变性温度的偏移相关，后者是评估组织交联效应的常用方法。

引言

人们推测，通过非酶促性巩膜交联（光化学和/或化学方法）可治疗进行性近视，这一假设是合理的，因为抑制胶原蛋白的酶促交联会加剧实验性形觉剥夺（FD）诱导的近视¹Elsheikh 和 Phillips² 最近讨论了使用标准的紫外线A照射（UVA）联合核黄素介导的光化学交联（也称为德累斯顿方案），此处简称为核黄素CXL，用于后部巩膜稳定以抑制近视眼轴延长的可行性和潜力。该光化学方法已成功用于治疗眼球前部表面的不稳定即，圆锥角膜和LASIK术后角膜扩张中可见的角膜膨隆。然而，将这种交联（CXL）方案应用于巩膜时，受到诸多因素限制，包括难以用紫外（UV）光源照射到后部巩膜，以及需要处理更大的组织表面积。尽管如此，已有研究应用CXL方法成功抑制了视觉剥夺性（通过睑缘缝合术诱导）兔模型的轴向眼轴延长，但该研究中需对后部巩膜多个区域分别进行多次独立的照射处理³相比之下，注射一种化学稳定剂（即，交联剂）通过sT空间进行注射可能是一种更简便的后巩膜改性方法，可避免引入紫外光源。这种注射技术作为一种有效的眼科麻醉方法已被广泛应用，例如在白内障手术等眼科手术中诱导眼部麻醉^4,5,6. Wollensak⁷ 先前已有研究描述使用甘油醛（一种化学交联剂，其作用原理与本研究中所述的甲醛释放剂（FARs）类似）进行巩膜交联注射，以增强兔巩膜的硬度；此外，研究表明，京尼平可限制形觉剥夺性近视豚鼠的眼轴长度增长。^8,9。这些研究者已证明，使用可溶性化学试剂相较于光化学交联技术具有明显优势。因此，采用某种可注射化学试剂（包括FARs）进行巩膜交联即，TXL）¹⁰可能为控制近视中观察到的巩膜伸长进展提供一种可行的治疗方法。

在本研究所介绍的方案中，我们采用经巩膜注射（sT注射）的方式，将羟甲基甘氨酸钠（SMG）化学交联溶液递送至兔尸体眼的巩膜。此前，我们已应用过类似的方案，用于角膜的表面化学交联。值得注意的是，在先前报道的研究中，通过热变性分析证实，使用SMG可实现浓度依赖性的交联效应，其作用范围显著高于光化学CXL所能达到的水平¹¹。

本文描述了通过巩膜内注射递送SMG后评估其对巩膜组织交联效应的实验方案，包括采用差示扫描量热法（DSC）检测热变性，以及利用二次谐波生成显微成像技术（SHGM）进行分析。

利用差示扫描量热法（DSC），也称为热分析，可测量巩膜组织的热变性转变过程。由于纤维状胶原蛋白构成了巩膜组织中蛋白质的绝大部分，其热变性行为主要由这些胶原蛋白的性质决定。该方法用于评估胶原分子结构的稳定性以及稳定胶原原纤维的交联键，后者是主要的蛋白质三级结构。在DSC加热过程中，当达到某一临界转变温度时，胶原分子发生变性，导致三股螺旋结构解旋，这一过程通常形成明胶。这种热变性会破坏胶原分子链上的氢键，而通过诱导交联的方法可使变性温度向更高温度方向移动^12,13。该方法已应用数十年，尤其广泛用于生物材料领域以及制革等工艺中。然而，该方法需要提取巩膜组织，因此仅能作为离体（ex vivo）技术使用。

二次谐波生成显微技术（SHGM）基于具有非中心对称分子环境的特定材料的非线性光学特性。在这些材料中，强光（例如激光产生的光）会生成二次谐波信号，使入射光的频率加倍。已知能够产生二次谐波信号的生物材料包括胶原蛋白、微管和肌球蛋白。例如，当胶原蛋白被波长为860 nm的红外光激发时，会发射出波长为430 nm的可见光范围内的二次谐波信号。二次谐波生成（SHG）信号成像是一种评估治疗性胶原交联的有前景的方法。已知组织中的胶原原纤维能够发射二次谐波信号已有超过30年的历史。¹⁴然而，直到最近才获得了高分辨率的图像¹⁵ 在多种组织中，包括肌腱¹⁶皮肤、软骨¹⁷，血管¹⁸，以及在胶原凝胶中¹⁹.

基于这一认识，本研究评估了通过SMG化学诱导胶原交联在巩膜中引起的SHG信号变化。结果表明，巩膜经SMG修饰后，组织胶原纤维束（由胶原原纤维组成的高阶四级结构）产生的SHG信号增强，同时胶原纤维网络的结构形态也发生变化，表现为纤维束的"变直"。

方案

所有操作均使用完整异系繁殖兔头部中的尸体兔眼进行。遵循了所有机构和国家关于实验动物护理和使用的指南。

1. 溶液的配制

1. 用于TXL的SMG制备：
   1. 配制1 mL浓度为0.2 M的碳酸氢钠溶液（NaHCO₃）₃) 溶液，使用 0.0165 g NaHCO₃ 粉末溶于 1 mL 蒸馏水中制备。
   2. 将0.1016 mg粉末状羟甲基甘氨酸钠（SMG）溶解于1 mL蒸馏水中，得到终浓度为800 mM的SMG溶液。调节碳酸氢钠溶液至终浓度为0.1 M NaHCO₃。₃ 以及400 mM SMG。SMG的浓度根据所需的交联效果而定。在本方案中，我们使用了40、100和400 mM的SMG。

2. 使用SMG进行TXL的巩膜下注射

1. 用两支1 mL胰岛素注射器（25G针头）分别吸取400 µL的对照溶液和SMG溶液。
2. 使用垫子将兔子的头部置于侧位平面。可使用泡沫塑料或一叠纸张将头部固定于最佳位置。
3. 使用儿科眼睑撑开器撑开眼睑。
4. 使用压平式眼压计测量初始眼内压（IOP）。
5. 用组织标记笔在角膜缘上中部预定注射部位做标记。
6. 用结膜镊（或任何具有锯齿状圆头的镊子）牵拉注射部位周围的结膜，将针头穿过结膜，刺入标记的角巩膜缘位置稍外侧的滕囊即距角膜缘2-3 mm处）。也可使用虹膜剪在结膜上做一个小切口，以利于针头穿过滕囊。
7. 进入Tenon囊后，通过左右移动确保针头活动自如，此时眼球不应随之移动。这表明针头已正确置于巩膜上方的Tenon下（sT）间隙内。
8. 从注射器中注入溶液，然后丢弃针头。注射后立即可见液体在巩膜隧道内积聚，通过结膜可见前方隆起即，结膜水肿（chemosis）。
9. 重复眼内压测量，以确认其未因眼球意外穿孔而发生变化。
10. 取下开睑器，通过闭合的眼睑进行指压按摩，持续约2-3分钟。
11. 将头部置于孵育阶段，持续3.5小时（室温 = 18 °C），然后再进行下一步操作。

3. 组织制备

1. 使用眼睑拉钩将眼睑拉开，以充分暴露眼球。根据眼睛大小选择合适尺寸的拉钩。
2. 分离角膜缘周围的结膜组织。若注射部位附近已作切口，则沿切口环形扩大边界，使其范围足以容纳约 1×1 cm 的接种区域。
3. 在眼外肌与巩膜附着处将其切断。
4. 用镊子从眼球后方抬起并推动眼球，使其抬高。此举可暴露眼球后部，便于切断视神经以及位于眼球后极附近的视网膜中央动脉和静脉。
5. 切除包含标记注射部位作为外缘的角巩膜复合体。染色痕迹应仍可见于残留的巩膜部分。
6. 用组织镊牵拉，去除玻璃体（corpus vitreus）以及所有附着于巩膜内侧的组织层。
   注意：后续步骤取决于以下实验操作：4.-DSC 分析，5.-SHG 显微成像。

4. 区域DSC分析

1. 治疗眼： 用剪刀从剩余的巩膜杯上剪下四个巩膜扇形区，使注射部位位于上方扇形区并居中对齐。从两侧外侧将剩余的3个扇形区剪下即，鼻侧和颞侧），以及底部。
   注意：扇区（1-4）的编号及其进一步划分的方格（1-16）如图所示 图1A.
2. 将巩膜扇区（1-4）切成更小的方块（1-16），每个约4×4 mm。扇区1应分为9个方块（将注射位点精确划为独立方块[方块2]）。将扇区2和扇区3各分为2个方块（分别为方块10-11和方块12-13），扇区4分为3个方块（方块14-16）。
3. 为每个方格分配一个编号，如图所示 图1A，以确定所分析组织与注射区域之间的距离位置。
4. 对照眼： 将组织分为四个巩膜区域（与处理过的组织类似），从以下位置切取方形组织片：从顶部区域（区域1）切取3个方块，从两侧（区域2和区域3）各切取1个，从底部区域（区域4）切取1个。
5. 刮除残留的视网膜和脉络膜层，每次用新鲜的PBS洗涤两次，每次将组织块浸入溶液中约10秒。

5. 用于SHG成像

1. 使用剪刀剪取巩膜上部，制备一个1 x 1 cm的区域，使注射部位位于中央。
2. 刮除残留的视网膜和脉络膜层，并用新鲜的PBS洗涤两次，每次将组织块在溶液中停留约10秒。
3. 将组织置于装有PBS溶液的1 mL离心管中，用于运输至成像设施。所有操作从孵育结束后开始，包括眼球解剖，均应在一小时内完成。

6. 显微镜操作方案

注意：本实验方案针对激光扫描显微镜优化，用于成像巩膜组织胶原蛋白的背向散射二次谐波信号。

1. 显微镜设置
   1. 进行SHG显微成像时，为获得最大信号强度和分辨率，应使用专为透射红外光设计且具有高数值孔径（NA）的物镜。我们使用的物镜为尼康Apo LWD 25倍/NA1.1水浸物镜。
   2. 调节物镜的校正环，使其与样品深度匹配，本例中即为盖玻片厚度，0.17毫米。
   3. 安装25倍物镜，并在放置样品前，在成像表面涂抹足量润滑性水基凝胶。该水基凝胶在实验过程中不会蒸发，从而保持图像质量。
   4. 将来自含1 mL PBS的离心管中的巩膜组织置于两片25毫米圆形盖玻片之间（表层巩膜面朝下），避免组织干燥，以实现表层巩膜与盖玻片表面的最大接触。
      注意：组织也可直接放置于单层盖玻片上而不加盖另一片盖玻片。此时应保证有足够的PBS在成像过程中保持组织湿润。若采用此方式，应在细胞腔室组装完成后，再加入组织样本和PBS。
   5. 通过将一片或采用夹心法的两片25毫米圆形盖玻片放置于腔室底部，并旋紧上部组件，组装成密封的圆形细胞腔室。若使用顶部盖玻片，旋紧时不宜过紧，以免人为压平或损伤组织。
   6. 将含有组织样本的细胞腔室安装至显微镜载物台上。
   7. 将显微镜设置为透射光观察模式，开启透射光源。
   8. 移动载物台并调节物镜高度，使样品的下表面处于焦点位置，该位置通过目镜进行明场观察确定。
   9. 关闭除计算机显示器外的所有光源，并用铝箔覆盖显微镜载物台区域，尽可能遮挡显示器发出的光线。最大限度减少到达探测器的杂散光，可确保低噪声采集，因为GaAsP NDD探测器具有高灵敏度。
   10. 在软件的Ti Pad面板中，检查物镜定义是否正确。
   11. 在A1 Compact GUI面板中，选择用于成像的红外激光，选择NDD探测器，并选择配备400–450 nm带通滤光片的DAPI通道。
   12. 在A1 MP GUI面板中，将红外激光波长设置为860 nm，并打开快门。
   13. 在A1 Compact GUI面板中设置激光扫描条件如下：选择（a）检流计扫描器，（b）单向扫描，（c）像素驻留时间6.2 µs，（d）帧尺寸1,024 × 1,024像素，（e）线平均2次。
       注意：检流计扫描器和单向扫描可确保逐点精确对齐。1,024 × 1,024的全视野尺寸对应像素大小为0.5 μm/像素。线平均可降低图像中的散粒噪声。
   14. 通过调节激光功率和探测器增益，在A1 Compact GUI面板中设置成像条件。打开查找表面板（LUTs），该面板显示当前图像中像素强度值的直方图。在“Find”模式下开启实时成像，并通过调节激光功率和探测器增益，最大化检测到的像素值范围，避免信号饱和。典型参数为：激光功率2.5%（860 nm下总功率为2.35 W），探测器增益100 HV。
   15. 注意：在此系统中，使用内置功率计测得的激光功率为5.2 mW。每次实验时，应重新调节激光百分比，使各次成像会话之间的内置功率测量值保持恒定在5.2 mW。设置激光功率时需格外谨慎。Chameleon II激光器在800 nm处输出功率为3 W，使用10%或更高功率可能引起组织损伤。
2. 图像采集
   1. 在预览模式下，使用XYZ概览工具扫描组织区域。
   2. 将成像分辨率设为较低水平（256 × 256像素，无线平均），以加快该模式下的图像采集速度。
   3. 采集5 × 5、3 × 3或单个视野图像，以覆盖组织整个表面。在每个位置采集概览图像前，开启实时"Scan"模式，并将组织调至焦点。注意，组织不同区域在轴向方向上的位置略有差异。
   4. 寻找一个胶原纤维在整个视野中均清晰可见的平坦区域，在概览工具中双击该位置，使载物台移动至该特定位置。
   5. 开启实时"Scan"模式，调节物镜的Z轴位置，使底部平面处于焦点，然后在Ti Pad中使用Z驱动将光学平面向上移动10–15 μm，高于该底层。
   6. 使用"Capture"按钮，以1,024 × 1,024像素和2次线平均的高分辨率采集图像。
   7. 使用"+"按钮在XYZ概览中保存该位置，以确保不会重复采集同一组织区域。
   8. 对每一块组织，采集10个非重叠视野的图像。

7. DSC 实验方案

注意： 组织制备完成后应立即进行此步骤，用于区域DSC分析；若进行SHGM，则在组织成像后进行此步骤。

1. 准备DSC坩埚，称重并标记。
   注意：此步骤应在组织解剖前完成，以尽量减少组织脱水。
2. 用吸水纸将每块巩膜方片擦干，并使用齿状镊子将其平整地放置在DSC坩埚底部。
3. 将装有组织的坩埚加盖并压紧后称重，得到组织湿重（样品质量应在5至11 mg范围内）。
   注意：在处理下一个组织样品前，应使用压边器密封每个坩埚。坩埚为密封结构，可在热分析前防止任何水分流失。
4. 样品压紧后，将其放置于DSC样品盘上指定位置。对照组应有6个样品，处理眼应有16个样品。
5. 使用仪器管理软件创建方法，输入组织重量，并按照以下参数运行热分析：温度范围40至80 °C，升温速率1 °C/min，热流17.37 mW，气体（N₂）流速19.8 mL/min，气体压力2.2 bar。
6. 完成后，使用仪器管理软件分析每个样品的数据，提取发生热变性的相变温度峰值。

8. 图像分析

1. SHG 信号
   1. 从每种处理组及其对照组中选择至少 5-10 张最具代表性的图像，确保图像区域主要被胶原纤维占据。
   2. 将每张图像上传至 ImageJ 软件，并通过选择 分析> 测量 对活动图像进行平均像素强度的测量。
   3. 提取的数值以平均像素强度表示，也可通过菜单选择 分析 > 直方图 绘制强度直方图进行展示。
   4. 使用 Excel 表格创建数据表，根据样本编号系统记录所有测量数据。
   5. 计算每种处理组及对照条件下像素强度的均值和标准差。
   6. 采用学生 t 检验，对所有浓度间的成对比较进行差异分析（即，40 mM SMG 与 0 比较，400 mM SMG 与 0 比较）。[P≤0.05]。
2. 波状度（Waviness）
   1. 选择显示胶原纤维的图像。每份样本应至少分析 10 张图像（包括每个浓度的对照样本，总计至少 40 张）。
   2. 打开 ImageJ>插件> NeuronJ。NeuronJ 需预先安装。
   3. 通过将所有图像拖入已打开的 NeuronJ 窗口中进行加载。
   4. 沿纤维走向绘制追踪线，使用鼠标跟随原纤维轮廓进行描记（可使用手写笔绘图板），点击 M 键测量纤维总长度。
   5. 选择 "选项" 绘制一条切向直线，连接先前绘制的纤维轮廓的起点与终点。然后点击 M 键测量端到端的直线长度。
   6. 在每张图像中至少对 10 根原纤维重复上述操作。
   7. 收集每根原纤维的这两项测量值，并将数据输入 Excel 电子表格，分别将总纤维长度（轮廓）和端到端长度（直线连接）表示为 Length [curve] 和 Length [linear]。
   8. 使用公式计算波状度指数（W）：W = Length [curve] / Length [linear]。
   9. 使用以下公式，通过比较处理样本（SMG）图像与对照样本图像的数据，计算波状度的百分比变化：(W[SMG] - 1) / (W[control] - 1)。
   10. 对波状度指数（W）进行成对 t 检验，以确定不同处理条件与对照之间胶原纤维形态的统计学差异（p 值）。

结果

热变性温度（Tm）作为评估TXL交联效果的检测方法： 本实验共使用16对兔眼进行TXL操作。本研究的初步部分旨在评估在兔尸体头部通过巩膜隧道（sT）空间单次注射SMG交联剂后，交联效应在组织中的定位情况。此类实验与临床治疗具有相关性，因为在实际治疗中，可能需要在多个位置进行注射，以稳定特定区域的巩膜。

根据基本扩散原理可预测，该效应在注射部位最为显著，同时在邻近区域也产生一定影响，具体取决于溶液的浓度。图1A展示了巩膜分区（以红色空心数字字体编号1-4，进一步细分为16个方格，以黑色细体数字字体编号1-16）的示意图位置，各分区在单次sT注射后分别进行热变性分析，并以色谱索引表示结果。表1列出了各编号分区Tm值相对于相应对照组的变化情况，数据包含40 mM和400 mM两种注射浓度的结果，并提供了基于至少三次独立测定计算得出的...

讨论

已开展的实验表明，二次谐波生成（SHG）信号显微技术可用于评估巩膜胶原交联效应，这为将来将该技术用作针对胶原蛋白的交联治疗监测工具提供了可能。值得注意的是，目前已有一种可捕获该SHG信号的仪器投入临床使用。尽管该仪器最初主要设计用于人体皮肤真皮成像，但已成功应用于角膜和巩膜的成像²³。

在比较对照样本和处理样本时，必须保持相同的扫描和成像条件。巩膜组织中胶原的二次谐波生成显微成像需要配备多光子成像功能的荧光显微镜、波长可调范围为800-900 nm的脉冲红外激光器，以及高灵敏度探测器（如GaAsP非共轭扫描（NDD）探测器）。本文所述指南仅作为起点，具体实验条件应根据新实验或不同系统进行优化确定。

角膜和巩膜也已在使用该技术的研究中被同时评估^24,25,26,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore，美国马萨诸塞州		双蒸去离子水。— 步骤 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc.，美国新泽西州尤因		交联试剂 — 步骤 1.1.2
带鲁尔锁扣注射器的注射针	BD Eclipse，美国新泽西州		用于Tenon囊下注射的注射器。— 步骤 2.1
兔头	La Granja 禽类公司	远交系	动物死亡后1小时内分离并运送的兔头。— 步骤 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies，美国纽约州德佩		眼内压测量 — 步骤 2.4
DSC 6000 自动进样器	Perkin-Elmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆		热变性分析仪 — 步骤 7.4
Pyris 软件	Perkin-Elmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	Ver 11.0	步骤 7.5
CFI75 复消色差长工作距离 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		工作距离为2.0 mm、具有高红外透过率的水浸物镜 — 步骤 8.1.1
GenTeal	Alcon，美国德克萨斯州沃思堡	B000URVDQ8	以水性凝胶替代水作为物镜浸没介质，防止蒸发 — 步骤 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent，美国加利福尼亚州圣克拉拉，美国		脉宽140 fs、重复频率80 MHz、波长可调范围为680 nm至1080 nm的钛宝石脉冲激光器。— 步骤 8.1.11
AttoFluor 细胞培养腔室	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	用于固定盖玻片 — 步骤 8.1.3
25 mm 圆形盖玻片，#1.5	Neuvitro Corporation，美国华盛顿州温哥华	GG-25-1.5	步骤 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		步骤 8.1.4
非扫描式（NDD）GaAsP 检测器	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		配备400–450 nm带通滤光片 — 步骤 8.1.7
A1R-MP 激光扫描系统	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔		兼容红外（IR）多光子激发。— 步骤 8.1.8
NIS Elements 软件	Nikon Instruments，美国纽约州梅尔维尔	Ver 4.3	文中简称为 "软件" — 步骤 8.1.9
Fiji/ImageJ	美国国立卫生研究院		步骤 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering，荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/，用于步骤 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation，美国华盛顿州雷德蒙德	Ver 14	步骤 9.2.8