我们详细描述了两种基于化学方法培养小鼠胚胎干细胞的方案。这种新方法利用了促进Tet介导的氧化（通过维生素C）和抑制的协同机制 从头合成 通过PD0325901抑制5-甲基胞嘧啶的合成以维持小鼠胚胎干细胞的DNA低甲基化状态和多能性
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摘要
摘要
胚胎干细胞（ES 细胞）具有分化为三个胚层（内胚层、中胚层或外胚层）的潜能，并可产生多种细胞谱系，用于再生医学。ES 细胞培养 体外 长期以来备受广泛关注。传统上，小鼠胚胎干细胞（ES细胞）在含有血清和白血病抑制因子（LIF）的培养基中维持。然而，在血清/LIF条件下，细胞在形态和多能性相关基因表达谱方面表现出异质性，且大多处于一种亚稳定状态。此外，培养的ES细胞呈现全基因组范围的高甲基化，而囊胚内细胞团（ICM）和原始生殖细胞（PGCs）中的 naïve ES细胞则处于全基因组低甲基化状态。ICM和PGCs的低甲基化状态与其多能性密切相关。为了改进小鼠ES细胞的培养方法，我们近期开发了一种新方法，通过选择性联合使用两种小分子化合物，以维持DNA低甲基化和多能性状态。本文报道，维生素C（Vc）与PD0325901共处理可在5天内消除小鼠ES细胞中约90%的5-甲基胞嘧啶（5mC）。所获得的5mC含量与PGCs中的水平相当。机制研究表明，PD0325901通过上调Prdm14表达来抑制Dnmt3b从头合成 DNA甲基转移酶）和Dnmt3l（Dnmt3b的辅助因子），通过降低 从头合成 5mC的合成。维生素C（Vc）促进主要由Tet1和Tet2催化的5mC向5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的转化，表明该过程涉及被动和主动的DNA去甲基化。此外，在Vc/PD0325901条件下，小鼠胚胎干细胞（ES细胞）呈现出均一的形态和多能状态。综上，我们提出一种新型的化学协同培养方法，可实现小鼠ES细胞中DNA低甲基化状态的同时维持其多能性。这种依赖小分子化合物的方法克服了血清培养的主要缺陷，有望生成均一的ES细胞，用于进一步的临床应用与研究。
引言
ES细胞来源于囊胚的内细胞团1细胞处于多能性状态，能够分化为所有体细胞系和生殖系细胞2建立ES细胞为研究发育过程提供了机会 体外 并能基于其多能性生成具有医学意义的细胞，用于再生医学3.
1981年，两个研究团队首次建立了小鼠胚胎干细胞（ES细胞）系，当时从小鼠早期胚胎中分离的细胞在含有胎牛血清（FBS）的培养基中，以小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层进行培养1,4。MEFs在使用前经过有丝分裂失活处理，并预先在培养皿中生长。MEFs为小鼠ES细胞的贴附提供支持，并分泌促进增殖和抑制分化的生长因子5，而FBS则提供细胞增殖所必需的营养因子和激素。后续研究表明，饲养层细胞产生的白血病抑制因子（LIF）是维持小鼠ES细胞自我更新和多能性的关键细胞因子，向培养基中添加LIF可替代饲养层细胞的作用6。目前，将小鼠ES细胞培养在含FBS/LIF的培养基并辅以饲养层的方法仍是许多研究人员采用的标准方案。然而，这种经典培养方法存在一些问题。首先，饲养层细胞会分泌过量且不可控的因子，可能引起病原体污染
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方案
1. 准备工作
- 配制含有1.0 mM PD0325901（MEK抑制剂）和3.0 mM CHIR99021（GSK3抑制剂）的溶液。
- 称取2 mg PD0325901，加入4.15 mL DMSO至棕色玻璃小瓶中。
- 称取2 mg CHIR99021，加入1.43 mL DMSO至棕色玻璃小瓶中。
- 溶解后，将溶液分装（每管50 µL，置于200 µL PCR管中），于-20 °C避光保存。使用前从冰箱中取出一管冷冻原液，在室温下解冻。
- 称取0.0176 g Vc至1 mL离心管中，加入1 mL无菌水重悬，配制成终浓度为100 mM的溶液，使用前备用。
- 灭活FBS：将500 mL FBS置于56 °C水浴中孵育30分钟。
- 配制600 mL用于培养小鼠胚胎干细胞的基础培养基。
- 取一瓶DMEM高糖培养基（500 mL），移除40 mL。
- 向460 mL DMEM高糖培养基中添加20%灭活FBS（120 mL）、1,000 U/mL LIF（107 U/mL原液60 µL）、0.1 mM非必需氨基酸（NEAA）（10 mM原液6 mL）、1 mM丙酮酸钠（100 mM原液6 mL）、2 mM L-谷氨酰胺（200 mM原液6 mL....
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结果
Vc/PD0325901 协同诱导小鼠 ES 细胞的全基因组 DNA 甲基化擦除。在血清培养条件下，小鼠 ES 细胞呈现 DNA 高甲基化状态，而多能性的囊胚内细胞团（ICM）细胞和原始生殖细胞（PGCs）则表现出全基因组 DNA 甲基化的广泛擦除，这种低甲基化状态与其多能性密切相关9,10。
此前，我们及其他研究者发现，维生素C（Vc）可能增强Tet介导的5mC去甲基化15,17与此同时，还发现2i能够抑制 从头合成 5mC的合成。基于这些发现，我们进一步提出在小鼠胚胎干细胞中联合使用Vc与2i进行协同调控。通过UHPLC-MS/MS分析发现，在含血清培养基中添加Vc和2i后，小鼠胚胎干细胞中的5mC.......
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讨论
在本研究中，我们展示了一种联合使用Vc和PD0325901维持小鼠胚胎干细胞处于未分化且低甲基化状态的新方法，该效果通过Vc促进DNA去甲基化与PD0325901抑制作用的协同实现 从头合成 PD0325901诱导的DNA甲基化。此外，小鼠胚胎干细胞在Vc/PD0325901培养体系下表现出良好的形态。
为了更好地在Vc/PD0325901培养体系中维持小鼠胚胎干细胞的状态，需注意以下几个关键步骤。首先，必须预先筛选胎牛血清（FBS）批次，以挑选并储备最佳批次；频繁更换血清会不利于细胞增殖及多能性的维持。其次，在传代过程中将细胞集落消化为单细胞悬液时，应避免过度吹打细胞。第三，在细胞传代时，为减轻胰蛋白酶对细胞培养的不利影响，应在胰酶覆盖培养皿中的细胞后立即去除胰酶。此外，由于Vc不稳定，Vc/PD0325901培养基需每日更换。
与经典的血清培养相比，在Vc/PD0325901条件下培养的小鼠胚胎干细胞表现出更均一的细胞群体（图3B、
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披露
作者声明不存在任何潜在的利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（21435008 和 21327006，资助 H.W.）以及中国科学院战略性先导科技专项（XDB14030200，资助 H.W.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清，澳大利亚来源 | Corning | 35-076-CV | 小鼠胚胎干细胞培养基组分 |
| DMEM/高糖 | Hyclone | SH30022 | 小鼠胚胎干细胞培养基组分 |
| LIF | Millipore | ESG1107 | 小鼠胚胎干细胞培养基组分 |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Gibco | 11140050 | 小鼠胚胎干细胞培养基组分 |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360070 | 小鼠胚胎干细胞培养基组分 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | 小鼠胚胎干细胞培养基组分 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | 15140122 | 小鼠胚胎干细胞培养基组分 |
| PBS | Sigma | P5493 | 细胞清洗 |
| 胰蛋白酶 | Hyclone | SH30042 | 细胞解离 |
| 明胶 | Sigma | 48722 | 培养皿包被 |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | 用于细胞培养的小分子化合物 |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | 用于细胞培养的小分子化合物 |
| 维生素C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | 用于细胞培养的小分子化合物 |
| Ultra Bioscience 水纯化系统 | Purelab | Ultra | 超纯水制备 |
| DMSO | Sigma | D8418 | 细胞冻存液组分 |
| 离心机 | Eppendorf | 5427R | DNA和蛋白质提取 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 | RIPA缓冲液组分 |
| PMSF蛋白酶抑制剂 | ThermoFisher Scientific | 36978 | RIPA缓冲液组分 |
| DTT | Sigma | 43815 | RIPA缓冲液组分 |
| EGTA | Sigma | E3889 | RIPA缓冲液组分 |
| 基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | A1125 | 基因组DNA提取 |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | DNA浓度测定 |
| 小牛肠磷酸酶 | New England Biolabs | M0290 | DNA消化 |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA消化 |
| 蛇毒磷酸二酯酶I | Sigma | P4506 | DNA消化 |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | 消化后DNA的过滤 |
| 1290 UHPLC系统 | Agilent | 1290 | UHPLC分离 |
| G6410B三重四极杆质谱仪 | Agilent | G6410B | MS/MS分析 |
| Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱 | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | UHPLC分离用色谱柱 |
| 5-甲基胞嘧啶 | Solarbio Life Sciences | SM8900 | 5mC标准品 |
| 5-羟甲基胞嘧啶（标准品） | Toronto Research Chemicals | M295900 | 5hmC标准品 |
| Prdm14抗体 | bioworld | BS7634 | Western blot分析-一抗 |
| Dnmt3a抗体 | bioworld | BS6587 | Western blot分析-一抗 |
| Dnmt3b抗体 | abcam | ab13604 | Western blot分析-一抗 |
| Dnmt3l抗体 | abcam | ab3493 | Western blot分析-一抗 |
| Dnmt1抗体 | abcam | ab13537 | Western blot分析-一抗 |
| β-微管蛋白抗体 | bioworld | BS1482MH | Western blot分析-一抗 |
| 山羊抗兔IgG | abcam | ab6721 | Western blot分析-二抗 |
| 山羊抗小鼠IgG | abcam | ab6789 | Western blot分析-二抗 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA提取 |
| 逆转录系统 | Promega | A3500 | RNA逆转录 |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG碱性磷酸酶染色与活性检测试剂盒 | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | 碱性磷酸酶染色分析 |
| 小鼠胚胎干细胞：WT, 129 SvEv | 由中国科学院上海生命科学研究院徐国良教授提供（中国上海市） | 小鼠胚胎干细胞株 | |
| 显微镜 | Zeiss | LSM510 | 细胞观察 |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | 统计分析 |
参考文献
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
- Murry, C. E., Keller, ....
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重印与许可
