在神经病理性动物模型中精确评估疼痛反应对于研究疼痛性疾病的病理生理机制以及开发新型镇痛药物至关重要。本文介绍一种利用自动化步态分析系统客观、灵敏地测定啮齿类动物后肢足底感觉功能的方法。
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摘要
摘要
von Frey试验是一种经典方法，被广泛用于检测神经病理性疼痛动物的感知功能。然而，该方法存在一些缺点，例如数据具有主观性，且需要技术熟练、经验丰富的实验人员操作。迄今为止，尽管已有多种改良方法优化了von Frey试验，但其仍存在若干局限性。近期研究表明，步态分析可从神经病理性疼痛动物中获得更为准确和客观的数据。本实验方案展示了如何进行自动化步态分析，以评估小鼠神经病理性疼痛的程度。在经过数天的适应期后，让小鼠在玻璃地板上自由行走，以留下足印。随后，通过视频片段对足印和步态进行量化分析，利用自动化系统分析多种行走参数，例如足印面积、摆动时间、足部角度 等等。
本研究的主要目的是描述自动化步态分析的方法学，并简要将其与使用冯·弗雷丝（von Frey filament）的经典感觉测试所得数据进行比较。
引言
创伤、代谢功能障碍、炎症、感染、缺血或自身免疫性疾病引起的神经系统病理性改变偶尔会导致神经病理性疼痛，其定义为躯体感觉系统受损或疾病直接导致的疼痛1。神经病理性疼痛通常难以忍受，且不幸的是，传统镇痛药物通常无法提供足够的疼痛缓解2。神经病理性疼痛的一个主要特征是包含自发性疼痛以及由刺激诱发的疼痛（即，异常性疼痛和痛觉过敏）。异常性疼痛是指通常非疼痛性刺激（如轻触或温热刺激）引发的伤害性感受反应。痛觉过敏是指对有害的机械和/或热刺激产生增强的疼痛反应3。尽管这两种症状均会严重损害患者的生活质量，但由轻微触觉刺激诱发的机械性异常性疼痛是最令人困扰的症状，因为在日常生活中很难避免轻微接触。
为了研究神经病理性疼痛的潜在机制并开发新的镇痛药物，精确测量疼痛反应至关重要。由于后肢足垫区域易于操作，已建立的多种神经病理性疼痛动物模型均在此区域表现出伤害性反应4,5,6,7。因此，大多数疼痛反应评估均通过特殊仪器（如 von Frey 纤维丝）对后肢足底或背侧表面施加机械刺激来完成。其中最常用的方法之一是 Dixon 描述的上下法8及其后续改进版本9,10。然而，von Frey 实验需要操作者具备高度熟练的技术和丰富经验，且实验结果可能具有主观性。
自动步态分析系统可通过测量自由活动啮齿类动物行走过程中的多种参数，来研究神经及神经肌肉系统疾病。在多种神经损伤动物模型中，无需施加疼痛刺激即可评估伤害性感受的程度以及多种治疗方案的镇痛效果11,12,13,14。该分析系统可检测静态和动态步态参数，例如：足印面积（足部与地面接触部分的完整面积）、足印强度（接触地面的足部区域的平均强度）、步长（同一只足连续两次着地之间的距离）、站立时相（单个后足与地面接触的持续时间）、步序（四足接触地面的顺序）、摆动时相（摆动阶段的持续时间）以及摆动速度（由步长和摆动持续时间计算得出，单位为像素/秒）。本文展示了该分析系统的使用方法，并利用慢性缩窄性损伤（CCI）神经病理性小鼠模型，将所得数据与von Frey实验结果进行了简要比较。
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方案
所有实验均遵循国际疼痛研究协会的伦理指南，并经韩国大田市忠南国立大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）的诱导
- 将体重为20 - 25 g的雄性ICR小鼠饲养在12 h光照/黑暗循环条件下，室温控制在20 - 25 °C，湿度控制在40 - 60%，自由摄食和饮水。在手术前，让小鼠在动物饲养室中至少适应1周时间。
- 在饲养期间，观察小鼠的外观和行为，避免使用表现出异常运动活动的小鼠。
注意：在进行CCI手术前一天，使用von Frey纤维丝测定小鼠后肢的机械敏感性，并进行自动步态分析，以获得正常的基线数值。随后，将小鼠随机分配至对照组和实验组。
- 在饲养期间，观察小鼠的外观和行为，避免使用表现出异常运动活动的小鼠。
- 手术当天，通过腹腔注射2,2,2-三溴乙醇（250 mg/kg）麻醉小鼠。
注意：穿戴个人防护装备，例如手术服、手套和口罩。- 称取2.5 g 2,2,2-三溴乙醇，加入2-甲基-2-丁醇定容至5 mL。避光保存该溶液（例如，使用深色容器或用铝箔包裹。
- 在40 °C下加热并搅拌10–30分钟，使试剂完全溶解。
- 加入蒸馏水至终体积为200 mL，搅拌至充分混匀。
- 将分装样品于 4 °C 保存并避光。两周后，应使用新的分装样品替换麻醉剂。
- 按每克体重注射20 µL的剂量给药。例如，若小鼠体重为25 g，则给予500 µL溶液。该麻醉剂的典型作用持续时间为1 h。
注意：该溶液在光照和/或加热条件下会变得有毒，因此需小心避免接触光和热。强烈推荐采用腹腔注射途径。
- 当小鼠进入深度麻醉状态后，将其仰卧位放置于手术台上（即，俯卧位）并用70%酒精棉片消毒右侧外侧大腿中部区域。
注意：通过检查后肢或尾巴对捏压刺激无反应，确认深度麻醉状态。 - 在小鼠右侧坐骨神经上诱导CCI。
- 用手术刀片在大腿中部区域的皮肤上做一个长度为1.0–1.5 cm的切口。
- 用微型蚊式止血钳钝性分离大腿肌肉，以暴露坐骨神经。
- 使用4-0铬制肠线在暴露的坐骨神经上以1.0 - 1.5 mm的间隔结扎3次。
注意：通过结扎坐骨神经进行松结扎，直至同侧后肢足部出现轻微抖动。假手术组小鼠在相同条件下接受相同的外科切口处理，但不进行神经结扎。
- 使用5-0丝线以3-4针间断单纯缝合关闭手术切口，并用聚维碘酮对外周手术区域进行消毒。
- 手术后，将小鼠放入置于加热垫上的清洁笼具中。待动物从麻醉状态恢复后，将其放回原居住笼具。
注意：本研究中未使用抗生素。CCI+GBP 组作为阳性对照，每天一次腹腔注射给予加巴喷丁（GBP）50 mg/kg。
2. 机械性异常性疼痛的测量（von Frey试验）
注意：使用1 g的von Frey纤维丝刺激同侧后肢足底表面，评估对机械刺激的缩足反应频率。
- 每次测试当天，将小鼠带入行为测试室，并在测试前将其置于各自的家鼠笼中适应环境至少30分钟。
注意：穿戴个人防护装备，如手术服、手套和口罩。 - 将小鼠放入置于金属网地板上的透明丙烯酸盒中，适应环境30分钟。
- 轻柔地将1 g的von Frey纤维丝施加于后肢足底，直至纤维丝弯曲。
- 以至少10秒的间隔对同侧后肢进行10次纤维丝刺激，并记录结果。
注意：本研究中，10次试验中足部回缩反应的次数以足部回缩频率（PWF，%）的百分比形式表示。坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）手术后每两天进行一次von Frey测试。
3. 执行自动化步态分析
注意：步态分析系统可在动物行走时可视化每只足印，并自动分析多种步态参数，例如足印、足底强度、步长、支撑相、步序、摆动相、摆动速度 等等。 在本研究中，我们将数据转换为对侧左后足与同侧右后足之间的百分比变化，以显示足印面积和单步支撑时间。因此，50%的结果表明左右两侧足印大小以及足部与地面接触时间的持续长度相同。此外，接近0%的较低数据值表明，与对侧相比，同侧后足的接触面积和接触持续时间均减少（参见图B）。 图2 和 图3).
- 术前5天开始，每天将小鼠置于步态分析装置中适应10分钟。
注意：步态分析测试（包括适应过程）应在暗处进行。 - 将小鼠带至步态分析测试房间，在测试前于其饲养笼中适应至少30分钟。
- 在程序菜单的设置选项卡中，设置 "步道长度" 至30厘米，并设置 "最长运行时间" 至5秒并 "最大运行差异" 至 50%。
- 在“程序”菜单的“设置”选项卡中选择一个已注册的相机。
- 选择 "开放采集" 从“程序”菜单的“采集”选项卡中。
- 状态信息显示后，点击“拍摄背景”按钮，以获取空白（即，空白）通道。
- 点击“开始采集”按钮，并将小鼠放置于行走通道上；系统将根据小鼠的运动自动开始记录。
注意：当小鼠明显走过步道时，程序会自动将此动作归类为 "合规运行" 显示绿色图标。如果软件未能检测到足迹，实验者将看到红色图标，并必须重新进行记录。至少需要五次成功的合规运行才能进行分析。 - 测试结束后，从“程序”菜单的“采集”选项卡中选择“分类运行”。
- 选择需要分析的运行并点击“自动分类”按钮。
注意：分类完成后，所有统计参数将自动保存，实验人员可通过点击 "查看运行统计信息" 在“分析”菜单上。
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结果
我们对坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）小鼠在CCI手术后10天内进行了von Frey试验和自动步态分析。在统计学分析中，采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）评估总体效应，并通过Dunnett's post-hoc检验确定各实验组之间的p值。
所示结果 图1 显示经典冯·弗雷试验数据的时间进程。与假手术组相比，CCI小鼠的PWF（%）在CCI手术后2天升高，并持续10天。在CCI阳性对照组中，术后第1天开始每天一次腹腔注射GBP（50 mg/kg，连续给药10天）显著缓解了CCI诱导的PWF升高。在A图的假手术组中，术前（Pre）PWF（%）为8.00 ± 5.83，第2天为6.00 ± 2.45，第4天为4.00 ± 2.45，第6天为2.00 ± 2.00，第8天为4.00 ± 22.45，第10天为6.00 ± 2.45。在CCI组中，PWF（%）术前为2.86 ± ...
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讨论
目前，使用冯·弗雷细丝（von Frey filaments）测量机械性异常性疼痛是疼痛动物模型中最广泛使用的方法，用于证明触觉过敏现象。随着神经病理性疼痛动物模型的不断发展，感觉功能评估的方法也得到了改进8,9,10,15。这些研究报告指出，这些改进方法可为传统方法提供更准确、快速且操作更简便的替代方案。然而，这些方法所得数据仍可能受限于其主观性，以及操作者需要具备一定技能或经验的要求。此外，在进行冯·弗雷测试时无法避免对动物进行固定，因此由固定引起的动物应激反应可能会影响疼痛反应的结果。
自动步态分析系统可自动测量动物行走的多种参数例如，足部与地面接触的总面积，足印角度，站立时长， 等等。，因此实验人员可以使用更客观的数据进行分析12
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国忠南国立大学、韩国韩医学研究院（KIOM）以及韩国保健产业振兴院的健康技术研究开发项目资助&韩国健康产业发展院（KHIDI）通过#38;D项目，由保健福祉部资助 & 福利部，大韩民国（项目编号：HI15C0007）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理盐水 | JW Pharmaceutical | N/A | 药物溶媒 |
| 1ml 注射器 | BD Plastipak | 300013 | 注射装置 |
| 2,2,2-三溴乙醇（97% 纯度） | Sigma | T48402 | 麻醉剂 |
| 2-甲基-2-丁醇（99% 纯度） | Sigma | 152463 | 2,2,2-三溴乙醇的溶剂 |
| Catwalk 自动步态分析系统 | Noldus | N/A | 动物步态自动分析软件 |
| 铬制肠线（4-0 规格） | AILEE | C442 | 用于坐骨神经慢性压迫损伤的结扎线 |
| 加巴喷丁 | Sigma | Y0001280 | 镇痛药，本研究中用作阳性对照药物 |
| 格拉夫镊 | F.S.T | 11051-10 | 外科手术器械 |
| 加热垫 | DAESHIN ELECTRONICS | M-303AT | 体温调节装置 |
| ICR 小鼠 | Samtaco | N/A | 实验动物 |
| 丝线缝合线（3-0 规格） | ETHICON | W598H | 皮肤切口缝合材料 |
| 微型蚊式钳 | F.S.T | 13010-12 | 外科手术器械 |
| 显微剪刀 | F.S.T | 14090-09 | 外科手术器械 |
| 持针器 | F.S.T | 12002-12 | 外科手术器械 |
| 聚维酮碘 | Firson | N/A | 术后消毒剂，用于预防感染 |
| 手术刀片 | F.S.T | 10010-00 (#10) | 用于切开组织的外科手术器械 |
| 手术刀柄 | F.S.T | 10003-12 (#3) | 用于切开组织的外科手术器械 |
| 冯·弗雷纤维丝 | North Coast | NC12775-99 | 用于检测机械刺激下感觉功能的测量装置 |
参考文献
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