本方案通过使用微型渗透泵脑内灌注系统将拮抗剂MetCCL5递送至小鼠脑内，研究趋化因子（C-C模体）配体5（CCL5）在下丘脑中的作用。这种对CCL5活性的短暂抑制会中断下丘脑胰岛素信号传导，导致葡萄糖耐受不良和外周系统性胰岛素敏感性下降。
本文内容
摘要
摘要
胰岛素在下丘脑和外周胰岛素反应中调节全身代谢。外周脂肪组织中的炎症反应参与2型糖尿病（T2DM）的发生以及下丘脑对食欲的调控。趋化因子CCL5及其受体C-C趋化因子受体5型（CCR5）的水平被认为在2型糖尿病（T2DM）的动脉粥样硬化和葡萄糖耐受不良中起介导作用。此外，CCL5在下丘脑中通过调节摄食行为和体温发挥神经内分泌功能，这促使我们进一步探究其在下丘脑胰岛素信号传导及外周葡萄糖代谢调控中的作用。
微型渗透泵脑内输注系统是一种快速且精确调控CCL5功能并研究其在脑内作用的方法。该系统还提供了一种便捷的替代方案，以避免构建转基因敲除动物。在此系统中，通过微型渗透泵经脑室内（ICV）输注CCL5拮抗剂MetCCL5，阻断CCL5信号通路。外周葡萄糖代谢及胰岛素反应性通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）进行检测。随后，利用从动物组织样本中提取的蛋白进行蛋白印迹分析，以评估胰岛素信号通路活性。
在给予MetCCL5 7-14 天后，小鼠的葡萄糖代谢和胰岛素反应能力受损，这在口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐受性试验（ITT）的结果中可见。在抑制 CCL5 后，小鼠下丘脑神经元中 IRS-1 的丝氨酸302位点磷酸化水平升高，Akt 活性降低。综上所述，我们的数据表明，在小鼠脑内阻断 CCL5 会增加 IRS-1 S302 的磷酸化，干扰下丘脑胰岛素信号传导，从而导致外周组织胰岛素功能下降以及葡萄糖代谢受损。
引言
胰岛素影响多种组织，包括大脑。胰岛素可穿过血脑屏障进入中枢神经系统（CNS），并与下丘脑中的胰岛素受体（IR）结合，从而调节食物摄入、交感神经活性以及外周胰岛素反应。外周脂肪组织中的慢性炎症被认为与2型糖尿病（T2DM）的发生有关，但这些炎症反应如何影响下丘脑中的胰岛素信号传导，进而介导全身胰岛素反应和葡萄糖耐受不良，目前尚不明确。一些趋化因子参与下丘脑对食欲和体温的调节1，例如肿瘤坏死因子-α（TNFα）、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和CCL5（C-C基序配体5）。此外，下丘脑的炎症会导致T2DM中的胰岛素抵抗2,3。
在这些趋化因子中，趋化因子CCL5及其受体CCR5在脂肪组织中表达水平的改变，已发现在人类和动物的2型糖尿病（T2DM）中与动脉粥样硬化及葡萄糖耐受不良相关。CCL5还在下丘脑中具有神经内分泌功能，包括调节摄食行为和体温。因此，研究CCL5是否参与下丘脑或外周组织中胰岛素信号通路的激活具有重要意义。
胰岛素信号在细胞内受到严格调控。胰岛素与胰岛素受体（IR）结合后，可激活胰岛素受体底物（IRS）蛋白，进而激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（PKB/AKT），并促进葡萄糖转运蛋白-4（GLUT4）向细胞膜转位4。IRS蛋白是该信号通路中的关键调控因子：其含有多个酪氨酸和丝氨酸残基，可在正向或负向胰岛素信号作用下发生磷酸化修饰5。例如，IRS-1蛋白上丝氨酸302位点的磷酸化可导致IRS-1与IR之间的物理性解离，阻断胰岛素信号转导，从而引发胰岛素抵抗6。研究表明，在小鼠下丘脑中IRS蛋白活性受损可导致胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良7。
研究特定基因功能的一种常用方法是操控目标基因在整个生物体内的表达。然而，这种方法可能存在若干缺点：1）随时间推移可能引发不同的反馈调节或代偿效应；2）该方法无法帮助我们阐明目标蛋白在特定脑区中的作用。此外，组织和细胞特异性的基因敲除动物模型需要长时间繁育，且成本较高。因此，我们采用短期脑内灌注渗透压泵系统——一种相对快速且便捷的方法，通过使用拮抗剂药物干扰脑内目标蛋白的信号通路，从而克服上述问题。传统的立体定位注射技术需要复杂的外科操作技能，并在仪器设备和时间上投入较大。在本实验方案中，我们提供了一种简单且安全的立体定位注射方法，以及一种快速、损伤较小且即时的血糖浓度检测方法，用于探究CCL5在下丘脑胰岛素信号调控中的作用。
方案
注意：本研究中涉及动物实验的所有方案和方法均已获得中国台湾台北医学大学机构动物照护及使用委员会（IACUC）的批准（方案编号：LAC-2014-0387）
1. 微渗透泵输注系统的制备
注意：在无菌条件下准备泵、人工脑脊液（aCSF）缓冲液和药物（Met-CCL5/RANTES 蛋白溶液（10 ng/mL 溶于 aCSF）），使用 0.2 µm 滤器过滤的缓冲液，并在超净工作台内戴手套操作所有步骤。手术操作步骤如下：
- 手术前一天准备微型渗透泵：使用试剂盒中提供的1 mL注射器和钝头针将人工脑脊液（aCSF）注入脑用微型渗透泵中。将微型渗透泵浸入aCSF中，并置于摇床上，轻轻振荡过夜。
警告：应使用aCSF填充泵体，避免泵内产生气泡（图1A）。 - 开始手术前，配制实验所用的重组Met-CCL5/RANTES蛋白溶液（10 ng/mL，用aCSF稀释）。将泵中的aCSF排出，缓慢注入药物溶液，直至多余液体渗出。
注意：15 mL aCSF或Met-CCL5/RANTES溶液足以填充5–8个泵。
警告：重复此操作，确保泵内完全充满药物且无气泡。 - 将导管剪裁至所需长度，并与脑灌注试剂盒中的钝头脑灌注针连接。用药物溶液填充灌注试剂盒及导管。
- 最后，将脑灌注装置组装并连接至微型渗透泵。
警告：导管或泵内不得产生气泡（图1A）。 - 将完整的渗透泵-脑连接装置浸入无菌50 mL离心管中的aCSF内，防止泵体干燥。此时渗透泵-脑连接装置已准备就绪，可用于手术。
注意：微型渗透泵系统可用于长期药物输注，可确保向小鼠脑内安全、便捷地递送药物。
2. 脑室内手术——微型渗透泵的植入
警告：使用75%乙醇对手术环境进行灭菌，并确保参与研究的人员佩戴无菌手套和清洁的实验服。手术器械/工具在使用前必须经过高压灭菌并干燥，且在每只小鼠手术之间需用75%乙醇再次灭菌。
- 称量小鼠体重，并通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮/赛拉嗪麻醉（氯胺酮 50 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）。
警告：不建议对体重低于24 g的小鼠进行渗透泵植入手术。 - 将小鼠头部固定在立体定位仪上图1B).
- 使用手术剪刀和镊子剪开覆盖颅骨的外层皮肤。用碘液清洁颅骨周围区域。
- 使用钝头镊子在颈部区域将最外层皮肤与皮下组织分离，以便进行渗透泵-脑融合装置的植入图1C).
- 参照脑图标记灌注点（图1D) 使用立体定位仪。在此实验中，需要将针头植入 3rd 脑室区域（前囟：0.0 mm 水平，1.3 mm 后方，5.7 mm 腹侧）。
- 使用指甲钻在颅骨标记区域周围钻孔（图1E).
注意：操作时需小心避免损伤小鼠脑膜和血管，以防破坏脑内微血管。 - 将含有aCSF（作为对照）或药物（Met-CCL5/RANTES蛋白溶液）的微型渗透泵-脑融合装置置于颈部后方皮下，并将脑部输注针插入钻孔中，以将药物输注至小鼠脑内图1E）。针头将穿透脑膜并进入脑室。使用表面脱敏凝胶将针头固定在颅骨上图1F）并等待1-2分钟，直至胶水干燥。接着，剪去针头顶部突出的部分（图1G- H)
- 使用组织粘合胶来闭合头部手术切口。在切口处滴加50 µL粘合胶，将皮肤两侧拉拢并保持30秒，使皮肤充分闭合。图1I).
注意：手术后使用100%酒精棉片清洁伤口，并使用100 μl青霉素-链霉素防止感染。 注意：使用外科胶水后，小鼠皮肤将在数天内形成瘢痕组织并愈合。胶水的主要优势在于避免了外科缝线可能引起的皮肤刺激或炎症。 - 将小鼠放入置于预热至37°C温热板上的清洁笼盒中，等待小鼠从麻醉作用中恢复。
注意：手术后维持小鼠体温对提高其存活率至关重要。 - 经过一周的恢复期后，小鼠即可用于后续实验，例如口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。
3. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）
注意：在灌注 aCSF 和 MetCCL5/RANTES（10 ng/mL，100 µL）7 天后进行口服葡萄糖耐量试验。OGTT 前对小鼠禁食 6 小时，期间提供充足的饮水。将动物置于即将进行实验的同一工作台，使其适应环境，以减少实验过程中的应激反应。
- 葡萄糖溶液的配制：实验前，将 3.75 g 葡萄糖溶解于 15 mL 蒸馏水（H2O）中，配制葡萄糖溶液。
- 制定实验过程中记录读数的时间表（表 1）。
注意：必须设置包含适当时间间隔的时间表，以便在每次采血检查之间留出足够时间，确保实验期间能够准确记录数据。 - 禁食后称量每只小鼠的体重，并计算应注射的葡萄糖剂量。例如，若小鼠体重为 30 g，则应给予 300 µL 葡萄糖溶液。
- 在实验台准备好以下仪器：
- 血糖仪（按下启动按钮检查电池状态，确保测试前仪器正常工作）
- 血糖试纸
- 胰岛素注射器（0.3 mL 胰岛素注射器）
- 刀片
- 计时器
- 实验台准备就绪后，按以下步骤测量并记录血糖水平：将一片洁净且全新的血糖试纸插入血糖仪，按下启动按钮进行归零。
- 抓住小鼠颈背部皮肤提起小鼠，并轻轻按摩尾部数次，以促进尾部区域的血液流动。
- 使用新的刀片剪去尾尖一小部分，挤出一滴血液（约 10–20 µL）至血糖试纸上。血液应完全填充试纸以确保准确测量。血糖仪将立即显示血糖值。若仪器显示 "error"，则更换新的血糖试纸后重复操作。
注意：每片血糖试纸仅需一滴血。若需多次采集血样，可在持住小鼠尾尖置于试纸上方的同时，用手指沿尾部反复挤压数次以收集血液。每次采血时无需重复剪切尾部。 - 随后，采用经口胃灌注法给予小鼠葡萄糖（0.25 g/mL）。给药体积应根据公式计算：10 × 体重（BW）µL 葡萄糖溶液（例如，若小鼠体重为 30 g，则给予 300 µL 葡萄糖溶液）。口服葡萄糖后立即启动计时器。
- 在给糖后 15、30、60、90 和 120 分钟时重复血糖测量步骤。
- 记录完所有血糖数值后，将使用过的刀片和血糖试纸丢弃至生物危害废物容器中。将食物重新放入小鼠笼内，并将小鼠送回动物房。
4. 胰岛素耐受试验（ITT）
注意：胰岛素耐受试验和口服葡萄糖耐受试验应至少间隔 7 天进行，以减少禁食对动物的影响。在胰岛素耐受试验（ITT）中，将通过腹腔注射给予人胰岛素（0.75 U/Kg）。
- 制备 0.25 U 胰岛素溶液：将 100 U 人胰岛素用生理盐水按 1:400 的比例稀释。
- 禁食后称量每只小鼠的体重，并据此计算胰岛素注射量：腹腔注射的 0.25 U 胰岛素体积（µL）= 3 × 体重（即 0.75 U 胰岛素/千克体重）。例如：对于体重为 28.8 g 的小鼠，注射量为：28.8 × 3 = 86.4 µL（0.25 U 稀释后的胰岛素）（表 2）。
注意：同一只动物在不同天禁食 6 小时后体重可能不同。因此，必须在禁食前后立即测量体重，并进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。小鼠体重可能因品系、性别和禁食时间长短而下降。过高的胰岛素剂量可能导致胰岛素休克，进而导致动物死亡。 - 建立一个表格（表 2）以记录实验过程中的各项读数。重复步骤 3.4 至 3.8，以测定血糖水平。
结果
对小鼠进行了手术植入渗透压输注泵，泵内分别含有作为对照的 aCSF 或 CCL5 拮抗剂 MetCCL5（用于阻断 CCL5 在脑内的作用）。术后第 7 天和第 14 天，按照前述方案，通过 OGTT（术后第 7 天）和 ITT（术后第 14 天）分析小鼠的外周葡萄糖耐受性和胰岛素反应性。小鼠在禁食 6 小时后进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐受试验（ITT）。通过口服给予小鼠葡萄糖，剂量根据其各自体重确定。记录血糖水平的变化，如图 3所示。胰岛素敏感性试验通过腹腔（IP）注射胰岛素至小鼠体内，并立即测定血糖水平的变化。在不同输注药物处理的小鼠中，记录胰岛素刺激后血糖水平的变化，如图 4所示。与输注 aCSF 的小鼠相比，输注 CCL5 拮抗剂（MetCCL5）的小鼠在葡萄糖给予后（图 3B）和胰岛素注射后（图 4B）血糖水平仅略有下降。这些结果提示，脑内给予 MetCCL5 的小鼠在外周葡萄糖代谢中存在胰岛素功能受损。
接下来，我们通过评估下丘脑组织中 IRS-1 的磷酸化水平和 Akt 激活水平，分析胰岛素信号通路的激活情况。在接受拮抗剂处理的小鼠中，IRS-1 第302位丝氨酸的磷酸化水平上调MetCCL5) (图5B- C）当小鼠正常进食时。在对照组中，向小鼠下丘脑给予 aCSF，胰岛素刺激激活了下游信号分子 Akt（磷酸化 Akt 丝氨酸 473）图 5D，F）而不增加 IRS-1 丝氨酸302的活化（图 5D-）以及Akt丝氨酸473位点的磷酸化水平。相比之下，输注了 MetCCL5，但IRS-1丝氨酸302位点的磷酸化水平却升高。同时，在小鼠脑内阻断CCL5信号会中断下丘脑中的胰岛素活性，并损害外周胰岛素功能。根据我们的整体研究结果，如胰岛素耐量试验（ITT）、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）的结果等， 离体 胰岛素刺激实验表明，下丘脑中的CCL5在胰岛素信号激活及外周葡萄糖代谢中发挥重要作用。
图 1. 小鼠渗透泵制备及植入手术操作流程。 （A）脑部输注套件与灌注了药物溶液的渗透泵的制备。红色箭头指示充满液体的导管。（B）将小鼠头部固定并安装至立体定位仪上。（C）分离皮肤最外层与皮下组织，以便植入微型渗透泵-脑输注装置；虚线表示渗透泵的植入位置。（D）箭头指示输注侧。（E）在颅骨标记区域附近钻孔。（F）将渗透泵-脑输注装置放置于小鼠背部，并将脑输注针插入所钻孔洞（虚线圈出）。（G）使用组织粘合胶将输注针固定于颅骨，并如图（H）所示，用剪刀剪断针头顶部（G图中剪刀所指）。（I）使用组织粘合胶封闭切口。请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 使用渗透泵将药物注入脑室区域时，药物扩散区域的代表性图像。伊文思蓝为渗透泵向脑室区域输注药物示意图中所使用的代表性药物，图中显示其在侧脑室（A）及侧脑室与第三脑室中的扩散情况（B）。比例尺 = 0.5 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）测定的小鼠术后葡萄糖代谢。在脑室内灌注aCSF的野生型小鼠（A）和灌注拮抗剂MCCL5的小鼠（B）中，口服葡萄糖后血糖水平的分布发生变化。数据以均值±标准误表示（图片改编自8）。*p<0.05，采用双因素方差分析。 请点击此处查看本图的高清版本。
图4. 小鼠血糖中的胰岛素功能——胰岛素耐受性试验（ITT）。在注射胰岛素后，接受aCSF灌注的野生型（WT）小鼠（A）以及接受拮抗剂MCCL5灌注的小鼠（B）的血糖水平分布发生变化。数据以均值±标准误表示（该图经修改自8）。***p<0.001，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 小鼠术后胰岛素信号活性。 （A）经aCSF或CCL5拮抗剂MetCCL5（MCCL5）输注泵处理后，小鼠下丘脑组织中胰岛素反应底物-1（IRS-1）的抑制性丝氨酸302位磷酸化形式（pIRS1S302）的蛋白印迹分析。（B）正常进食条件下，输注后小鼠下丘脑中磷酸化IRS-1S302的相对水平。（C）经aCSF或METCCL5输注后，下丘脑组织中IRS-1的S302位磷酸化及Akt活化（Ser473位磷酸化Akt，pAktS473）在有或无胰岛素刺激条件下的蛋白印迹结果。（D-E）pIRS-1S302、pS6KT421和pAktS473的相对水平。（每个柱状图中的“2”表示：所有定量分析的n=2）。图5D-E中左侧空心柱代表无胰岛素刺激组，右侧条纹柱代表有胰岛素刺激组）。请点击此处查看该图的高清版本。
| # | 小鼠编号 | 体重 | 葡萄糖 | 开始时间 | 0分钟 | 15分钟 | 30分钟 | 60分钟 | 90分钟 |
| （克） | μL =10×体重 | （时间） | （时间） | （时间） | （时间） | （时间） | （时间） | ||
| 1 | 501 | 25.8g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 9:37 | 10:07 |
表1. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）记录时间表
| # | 小鼠编号 | 体重 | 胰岛素 0.25IU | 起始时间 | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| （g） | μL =3×体重 | （时:分） | 分钟 | 分钟 | 分钟 | 分钟 | 分钟 | ||
| 1 | 501 | 28.8g | 86.4 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | 25.3g | 75.9 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 | 10:37 |
表2. 胰岛素耐受试验（ITT）记录时间表
讨论
CCL5 及其受体 CCR5 在慢性炎症及其相关机制导致 2 型糖尿病发生发展中的作用尚不明确。慢性炎症可引起巨噬细胞浸润脂肪组织，影响脂肪因子的调节；同时也会招募 β 细胞，并损害胰岛朗格汉斯氏细胞对血糖变化的胰岛素分泌反应。大脑中的下丘脑作为调控中心，在协调来自全身外周组织的胰岛素和脂肪因子信号以调节食欲、外周血糖代谢及胰岛素反应方面发挥重要作用。许多研究还表明，下丘脑炎症会导致能量稳态调节障碍，以及胰岛和肝脏功能异常2,3,9,10。脑内的 CCL5 参与下丘脑对摄食行为和体温的调节11,12；然而，CCL5 与下丘脑及全身胰岛素信号通路之间的关联仍不清楚。已有研究构建了 CCL5 全身敲除小鼠（CCL5-/-），用于探讨这一问题，该模型表现出胰岛素抵抗表型，血液中胰岛素水平和血糖水平均升高8。然而，该模型发展出 2 型糖尿病表型所需时间较长，且由于可能存在长期代偿效应，难以准确研究 CCL5 在下丘脑胰岛素信号中的作用与机制。因此，直接调控下丘脑神经元中 CCL5 信号通路是最佳策略。然而，下丘脑区域存在多种类型的神经元，构建细胞特异性敲除小鼠成本高且耗时长。因此，采用脑室内灌注（ICV）系统可节省时间，并提供一种更为特异的方法，直接在脑内调控 CCL5 功能，从而避免可能的外周炎症反应干扰。
已有研究利用渗透泵并发表了相关成果，为在啮齿类动物中植入渗透泵的技术提供了很好的示例和演示13。然而，我们在本研究中遵循这些方案时遇到了一些挑战。首先，部分方案中使用的设备价格昂贵，包括：1）用于定位、穿刺并将针插入小鼠脑部的电动系统；2）用于维持小鼠体温的温控系统；3）用于向小鼠施加麻醉的氧气-异氟烷供应系统。其次，由于本研究只能使用体重和年龄范围较窄的动物，其他文献中描述的技术难以复制。我们清楚较大的小鼠更适合手术和植入操作。但在本研究中，我们必须使用体型较小且较年轻的小鼠，以避免肥胖和衰老对胰岛素及血糖调节的影响：因此仅选用体重为25 ± 2 g、年龄约2个月的雄性小鼠。因此，在小鼠头部进行手术和缝合伤口的操作难度较大。第三，由于本研究的目标是炎症因子，术后必须尽量减少炎症反应。小鼠和大鼠在术后容易自行撕扯缝线并撕开伤口，从而引发炎症并加剧趋化因子反应。因此，有必要采用一种能够准确定位并穿刺插入脑部、同时避免继发感染的策略。为此，我们对先前描述的方案进行了改进，使该技术更具成本效益、操作更简便，并减少对动物的伤害，具体改进如下所述。
首先，我们使用牙科钻头手动在颅骨上标记的目标区域周围钻孔，具体操作如步骤2.6所述。该方法成本较低，并允许我们全程监控操作过程，以避免损伤小鼠的脑膜和血管。急性脑卒中（如脑出血）后，血糖调节功能会受到损害。在临床实践中，脑卒中后也观察到急性高血糖和类糖尿病综合征14,15。类似地，我们在脑内出血并伴有脓液的小鼠模型中也发现血糖水平调节异常及胰岛素反应受损。我们认识到，为了确保实验结果的一致性，有必要进一步提高手动手术操作的控制精度。其次，我们采用了临床上常用的新型医用生物材料——组织粘合胶（步骤2.8），在手术后封闭小鼠头部皮肤，从而避免缝合，加快愈合速度。这使得手术操作更加简便，并降低了继发性炎症的风险。第三，整个手术过程所需时间相对较短，提高了小鼠的存活几率，同时减少了腹腔注射麻醉药物的剂量。通过采用这一改进后的实验方案，我们观察到较高的存活率（95%），并获得了相对准确的实验结果。
该技术的局限性在于药物递送的时间相对较短。尽管可以另选方案将渗透泵植入小鼠体内而无需再次打开颅脑，但本研究仅关注脑内炎症趋化因子对周围系统性胰岛素信号的调控作用。若在周围组织进行额外手术，可能诱发周围组织的炎症反应，从而增加炎症趋化因子的表达并影响实验结果。其次，药物的半衰期也限制了研究的持续时间。趋化因子等重组蛋白通常半衰期较短，会随时间推移逐渐失去活性，尽管这一特性也使我们能够研究短期内阻断脑内CCL5信号通路的影响。我们之前的研究还描述了一种基因修饰方法，用于构建CCL5基因敲除小鼠模型，该模型可用于研究长期效应8。
目前存在一些新的技术和替代方法用于将药物递送至大脑。纳米技术是一种强大的手段，可用于将药物递送至中枢神经系统。然而，许多药物具有热敏感性，在尝试将其包载到纳米颗粒中时可能被破坏16。此外，纳米颗粒虽可穿过血脑屏障（BBB）并被细胞摄取，适用于siRNA或大多数常见药物，但对于配体-受体结合而言并非理想方法。CCL5需与下丘脑弓状核（ARC）神经元上的受体CCR5结合才能发挥作用8，而通过纳米颗粒将CCL5拮抗剂MetCCL5递送至神经元内，可能导致其丧失与细胞表面CCR5结合并阻断其功能的能力。
在口服葡萄糖耐量试验中，给予CCL5拮抗剂MetCCL5的小鼠血糖水平显著高于对照组（给予aCSF的小鼠）。在额外给予胰岛素（胰岛素耐量试验）后，接受MetCCL5的小鼠血糖水平仍无法降低（图4B），这表明当阻断下丘脑CCL5信号通路时，内源性和外源性胰岛素均不能降低血糖水平。当下丘脑中缺乏CCL5活性时，小鼠出现胰岛素抵抗。与接受aCSF的对照组小鼠相比，接受Met-CCL5的小鼠IRS-1蛋白的丝氨酸302位点磷酸化水平升高（图5A-B）。已有研究显示，IRS-1丝氨酸302位点的磷酸化会导致IRS-1与胰岛素受体发生物理性解离，这是引发胰岛素抵抗的主要机制之一6；胰岛素因而无法激活PI3K-Akt等下游信号通路。离体胰岛素刺激实验进一步证实，在灌注Met-CCL5的小鼠下丘脑组织中，胰岛素下游信号分子Akt（p-AktS473）未被胰岛素激活，而丝氨酸302位点的磷酸化水平反而升高。综上所述，生理学数据（OGTT和ITT）与分子生物学研究共同表明，下丘脑CCL5信号通路介导了下丘脑胰岛素信号的调控，进而导致系统性胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常。
CCL5和CCR5在肥胖相关糖尿病中的作用及其机制尚不明确。Kitake et al. 报道，CCR5缺陷可保护小鼠免受肥胖诱导的炎症、巨噬细胞募集以及胰岛素抵抗的影响17。然而，Kennedy et al. 的其他研究却得出了相反的结果，表明CCR5缺陷会损害全身葡萄糖耐受性以及脂肪细胞和肌肉的胰岛素信号传导18。这两项研究均采用高脂饮食诱导肥胖，从而导致全身慢性炎症和代偿性反应。因此，这些研究未能清晰阐明CCL5和CCR5在胰岛素信号调控中的明确机制。另一方面，渗透压泵技术可实现脑部特异性输注，并因其时间受限的给药方式而避免了代偿性反应。
总之，尽管带有脑部输注系统的渗透泵看似是一种"过时"的技术，但它确实提供了一种更廉价、更简便且创伤更小的给药方法，有助于研究脑内配体-受体信号传导的功能。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢中国台湾科技部——MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) 以及烟草制品健康福利附加税——MOHW106-TDU-B-212-144001 对 S-Y C. 的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Vetbond 组织粘合剂 | 3M | #1049SB | 用于密封小鼠头部损伤部位的胶水 |
| LOCTITE 454 瞬干胶 | Durect Corporation | #8670 | 用于将针头固定在小鼠颅骨上的胶水 |
| Alzet 微渗透泵 | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μ每小时升，28 天 |
| 脑内灌注系统 | Durect Corporation | #8851 | 1–3 毫米，用于将药物灌注至小鼠脑部 |
| 血糖仪 | 罗氏 | #06870244001 | 用于测量血糖水平 |
| 葡萄糖芯片 | 罗氏 | #06454011020 | 用于加载血样 |
| 伊文思蓝 | Sigma | #MKBK0523V | 以展示药物灌注区域 |
| 胰岛素注射器 | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | 用于胰岛素腹腔内注射 |
| MIO NE116 控制单元 （指甲钻） | Mio系统 | #E235-015 | 在小鼠颅骨上钻孔 |
| CCL5/Met-RANTES 蛋白 | R&研发 | #ADB0111081 | 重组人CCL5，大肠杆菌表达 |
| aCSF 配方 | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO₃3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM 葡萄糖 | 使用 0.22 μm 滤器进行过滤除菌 μm 滤器装置，并于 4 ℃ 保存°C. aCSF 可稳定保存 3–4 周 | |
| 磷酸化 IRS-1 丝氨酸302 抗体 | 细胞信号传导 | #12879 | 1:1000 稀释度 |
| IRS-1 (D23G12) 抗体 | 细胞信号传导 | #12879 | 1:1000 稀释 |
| 磷酸化 Akt 丝氨酸 473 抗体 | 细胞信号传导 | #9916 | 1:2000 稀释度 |
| Akt（全型）(C67E7) 抗体 | 细胞信号传导 | #9916 | 1:1000 稀释 |
| 动物：C57BL/6 | NAR Labs | 研究中使用的野生型小鼠品系 |
参考文献
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246(2012).
- Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
- Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
- Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659(2016).
- Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
- Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
- Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
- Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326(2013).
- Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
- Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
- De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).
重印与许可
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可