本文描述了评估细胞对急性机械刺激反应的方法。在基于显微镜的检测中，我们通过短暂的剪切流刺激后，观察荧光标记的生物传感器的定位变化。此外，我们还通过生物化学方法检测多种目标蛋白在急性机械刺激下的激活情况。
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本文内容
摘要
摘要
趋化性，即细胞沿化学引诱剂浓度梯度方向迁移，是目前理解最为清楚的定向迁移模式。利用社会性阿米巴原虫Dictyostelium discoideum进行的研究表明，由多条平行通路组成的复杂信号转导网络能够放大细胞对化学引诱剂的响应，从而导致肌动蛋白在梯度方向发生偏向性聚合，并形成朝向该方向的伪足。相比之下，其他类型的定向迁移（例如由剪切流或电场刺激引起的迁移）的分子机制尚不清楚。许多调控趋化性的因子在迁移细胞的前缘或后缘表现出定位特征，并且在受到化学引诱剂全局刺激后，其定位或活化状态会出现短暂变化。为了理解其他类型定向迁移的分子机制，我们开发了一种方法，可通过短暂（2–5秒）暴露于剪切流，实现对细胞急性机械刺激反应的检测。该刺激可在成像通道中施加，同时观察表达荧光标记生物传感器的细胞，以分析单个细胞的行为。此外，也可在培养板中对细胞群体进行刺激，随后裂解细胞并使用识别目标蛋白活性形式的抗体进行免疫印迹分析。通过结合这两种检测方法，可以广泛检测因亚细胞定位改变和/或磷酸化而被激活的多种分子。利用该方法，我们发现急性机械刺激可触发趋化性信号转导通路以及肌动蛋白细胞骨架网络的激活。研究细胞对急性机械刺激响应的能力，对于理解剪切流诱导细胞运动所必需的起始事件至关重要。该方法还提供了一种在不受化学引诱剂受体干扰的情况下研究趋化性信号转导网络的工具。
引言
真核细胞的迁移受到环境中多种化学和物理信号的引导，包括可溶性或基质结合性趋化因子的浓度梯度、基质刚度的变化、电场以及剪切流。尽管在趋化性驱动的分子机制方面已取得诸多进展，但对于其他类型的定向迁移，以及细胞如何在整体水平上整合这些多样化的信号以产生统一的迁移反应，目前仍知之甚少。
向趋化因子浓度升高的方向进行定向迁移涉及三个行为组分：运动性、方向感知和极性1。运动性是指细胞通过伪足伸出实现的随机移动。方向感知是细胞检测趋化因子来源的能力，即使在不能移动的细胞中也可发生。极性是指细胞内组分在前端与后端之间更为稳定的不对称分布，从而导致运动持续性的增强。
细胞对趋化因子的反应依赖于四个概念上定义的调控网络：受体/G蛋白、信号转导、肌动蛋白细胞骨架和极性1。趋化因子与G蛋白偶联受体结合后，通过异源三聚体G蛋白的α亚基和βγ亚基将信号传递至下游的信号转导网络，从而放大方向性信号。信号转导网络中的多条通路并行作用，并共同作用于肌动蛋白细胞骨架网络，以在浓度梯度方向上偏向性地促进肌动蛋白聚合及随之而来的伪足突出。在趋化性的重要调控因子中，包括Ras GTP酶、TorC2、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）以及鸟苷酸环化酶。信号转导网络内部以及信号转导与肌动蛋白细胞骨架网络之间的反馈机制进一步放大了细胞响应。最....
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方案
1. 溶液的配制
- 使用以下成分制备HL-5培养基：10 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、0.965 g/L Na2HPO4·7H2O、0.485 g/L KH2PO4，以及除特别说明外，加入去离子水中的0.03 g/L链霉素。将培养基高压灭菌后，室温保存。
注意：由于不同供应商提供的蛋白胨和酵母提取物之间以及不同批次之间的差异，培养基的pH可能需要调整至典型的6.4至6.7范围内。 - 使用以下成分制备SM平板：10 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、1 g/L酵母提取物、2.31 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4和20 g/L琼脂，溶于去离子水中。高压灭菌后冷却，每10 cm培养皿倒入30 mL琼脂溶液。琼脂凝固后，将平板置于4 °C保存，最多可保存1个月。
- 使用去离子水配制10×磷酸盐缓冲液（PB），含13.4 g/L Na2HPO4·7H2O和6.8 g/L KH2PO4。将10×储存液置于4 °C保存。使用时用去离子水稀释至1×。
- 通过在1×PB中添加2 mM MgSO4
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结果
趋化性调节因子对急性机械刺激的时间响应
为评估 D. discoideum 细胞对机械刺激的响应，将贴壁的具有聚集能力的细胞暴露于短暂的剪切流刺激下。具有聚集能力的 D. discoideum 细胞会分泌 cAMP，邻近细胞可感知该信号分子。为消除细胞间信号传导的干扰，使用咖啡因处理细胞，该物质可抑制 D. discoideum 中的腺苷酸环化酶，从而阻断 cAMP 的分泌28。事实上，经咖啡因预处理的细胞中，PKBR1 和 ERK2 的基础活性极低，并在剪切流刺激 5 秒后，这两种激酶关键位点的磷酸化水平出现显著升高（图 1A）。该响应呈瞬时性，PKBR1 的磷酸化在约 10–15 秒达到峰值，ERK2 则在约 30 秒达到峰值，这与先前报道的趋化因子激活这些蛋白的动力学特征相似
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讨论
本文所述方法为评估细胞群体和单个细胞在剪切流作用下的行为提供了便捷途径。重要的是，尽管以往研究聚焦于细胞迁移过程中前导边缘和尾随边缘标志物的定位，但本方法通过急性施加剪切流，可研究其即时效应。利用该方法，我们证明了细胞对剪切流的初始反应实际上并不依赖细胞迁移。相反，细胞对初始剪切流刺激产生的快速且短暂的反应，早于长时间暴露于剪切流所引起的定向迁移，这与趋化因子梯度诱导的初始全局反应类似。
尽管每种方法都有其独特的优缺点，生化和显微方法仍能提供互补的数据。例如，通过刺激细胞后裂解并进行PKBs、KrsB和ERK的免疫印迹分析，可检测整个细胞群体，从而平均化细胞间的变异，这与检测单个细胞行为的实验方法不同。然而，基于群体的检测往往掩盖了细胞行为中细微的变化，而这些变化在分析单个细胞时可被轻易观察到。此外，此处描述的生化检测仅对具有聚集能力的细胞有效，原因将在后文讨论。相比之下，基于显微镜的检测方法，例如RBD、RalGDS、PH-Crac、LimEΔcoil和PTEN在皮层与细胞质之间重新定位的检测，对营养生长期细胞和具有聚集能力的细胞均有效，因此可用于观察不同程.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助，资助号为 R35 GM118177，授予 PND。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 葡萄糖 | Fisher | D16-1 | 用于配制 HL-5 培养基和 SM 平板（步骤 1.1、1.2） |
| 蛋白胨 | Fisher | DF0120-17-6 | 用于配制 HL-5 培养基（步骤 1.1） |
| 酵母提取物 | Fisher | 50-550-445 | 用于配制 HL-5 培养基和 SM 平板（步骤 1.1、1.2） |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | 用于配制 HL-5 培养基和 10X 磷酸盐缓冲液（步骤 1.1、1.3） |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | 用于配制 HL-5 培养基、SM 平板和 10X 磷酸盐缓冲液（步骤 1.1–1.3） |
| 链霉素（二氢链霉素硫酸盐） | Fisher | ICN10040525 | 用于配制 HL-5 培养基（步骤 1.1） |
| 蛋白胨（Bacto） | Fisher | DF0118-17-0 | 用于配制 SM 平板（步骤 1.2） |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | 用于配制 SM 平板（步骤 1.2） |
| 琼脂 | Fisher | BP1423-500 | 用于配制 SM 平板（步骤 1.2） |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | 用于配制 DB 缓冲液（步骤 1.4） |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | 用于配制 DB 缓冲液（步骤 1.4） |
| 咖啡因 | Fisher | O1728-500 | 用于配制咖啡因溶液（步骤 1.5） |
| cAMP（EMD Millipore Calbiochem 3',5'-环磷酸腺苷钠盐） | Fisher | 11-680-1100MG | 用于配制 cAMP 溶液（步骤 1.6） |
| 叶酸 | Sigma | F7876 | 用于配制叶酸溶液（步骤 1.7） |
| Tris 碱 | Fisher | BP152-500 | 用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8） |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Fisher | BP166-500 | 用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8） |
| 甘油 | Fisher | G33-500 | 用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8） |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Bio-Rad | 1610610 | 用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8） |
| 溴酚蓝 | Bio-Rad | 1610404 | 用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8） |
| NaF | Fisher | S299-100 | 用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8） |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | 用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8） |
| 焦磷酸钠十水合物 | Fisher | S390-500 | 用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8） |
| 完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物（Roche） | Sigma | 11873580001 | 用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8） |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | 用于配制 Latrunculin A 溶液（步骤 1.9） |
| 4-15% Tris-HCl 聚丙烯酰胺凝胶 | Bio-Rad | 3450029 | 用于免疫印迹（步骤 3.3） |
| 聚偏氟乙烯膜 | Bio-Rad | 1620177 | 用于免疫印迹（步骤 3.3） |
| 磷酸化 PKC（泛）（zeta Thr410）（190D10）兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 2060 | 免疫印迹中使用的一抗（步骤 3.3） |
| 磷酸化 p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）（D13.14.4E）XP 抗体 | Cell Signaling | 4370 | 免疫印迹中使用的一抗（步骤 3.3） |
| 驴抗兔 IgG HRP 标记全抗体 | GE Healthcare | NA934-100UL | 免疫印迹中使用的二抗（步骤 3.3） |
| 增强型化学发光底物（Clarity Western ECL 底物） | Bio-Rad | 1705060 | 用于免疫印迹（步骤 3.3） |
| 洗脱缓冲液（Restore Plus Western blot 洗脱缓冲液） | Pierce | PI46430 | 用于免疫印迹（步骤 3.3） |
| 考马斯亮蓝 | Fisher | PI20278 | 用于免疫印迹（步骤 3.3） |
| K. aerogenes 菌株（非致病性） | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 材料与设备 | |||
| 轨道摇床（型号 G-33，或相当替代型号） | New Brunswick Scientific | 用于培养 K. aerogenes（步骤 2.1.1），以及用于基础培养和刺激 D. discoideum 细胞（步骤 3）。该摇床的回转半径为 9.5 mm。 | |
| 10 cm 培养皿 | Fisher | FB0875712 | 用于配制 SM 平板（步骤 1.2） |
| 血细胞计数板 | Fisher | 02-671-51B | 用于计数 D. discoideum 细胞（步骤 2.1.2） |
| 35 mm 培养皿（Corning Falcon 易握组织培养皿） | Fisher | 08-772A | 用于接种 D. discoideum 细胞，以进行机械刺激后裂解（步骤 3.1.1） |
| 聚苯乙烯杯（5 mL） | VWR | 13915-985 | 用于以趋化剂刺激 D. discoideum 细胞悬液（步骤 3.2.2） |
| 带泵流体装置（ibidi 泵系统） | Ibidi | 10902 | 用于向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5） |
| 带通道的载玻片（μ-Slide III 3in1 ibiTreat：#1.5 聚合物盖玻片，组织培养处理，已灭菌） | Ibidi | 80316 | 用于接种 D. discoideum 细胞，以通过流体装置施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5） |
| 50 mL 储液槽（Ibidi 流体装置储液槽支架） | Ibidi | 10978 | 用于搭建流体装置，以向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5） |
| 流体装置连接管（Perfusion Set 黄绿双色管） | Ibidi | 10964 | 用于搭建流体装置，以向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5）。注意：两根管也可从 1.6 mm 管（目录号 10842）中截取。 |
| 排水管（内径 1.6 mm 管） | Ibidi | 10842 | 用于搭建流体装置，以向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5）。 |
| 配备 40X/1.3 油镜和 20X/0.3 空气镜的 Zeiss Observer.Z1 倒置显微镜（或相当替代型号） | Zeiss | 用于以相差或荧光照明方式成像 D. discoideum 细胞（步骤 4 和 5） | |
| 配备 40×/1.25–0.75 油镜的 UltraView 旋转盘共聚焦显微镜（或相当替代型号） | Perkin-Elmer | DM 16000 | 用于成像 D. discoideum 细胞的替代设备（步骤 4.1.4） |
| FemtoJet 微注射仪（Eppendorf；型号 5247，或相当替代型号）配 Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D 和 5192000027 | 用于通过微移液管向 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.3）。注意：目录号为该设备最新版本（4i）的编号。 |
| 微移液管（Femtotip；外径 1 μm，内径 0.5 μm） | Eppendorf | 930000035 | 用于通过微移液管向 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.3） |
| 微加样头（Eppendorf Femtotips 微注射仪专用加样头） | Eppendorf | 5242956.003 | 用于向微移液管（Femtotip）中填充缓冲液（步骤 4.3.1） |
| 单孔培养室（Thermo Scientific Nunc Lab-Tek 培养室盖玻片） | Fisher | 12-565-472 | 用于接种 D. discoideum 细胞，以通过微移液管施加机械刺激（步骤 4.3.2） |
| 八孔培养室（Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II 培养室盖玻片） | Fisher | 12-565-338 | 用于接种 D. discoideum 细胞，以通过大量缓冲液添加施加机械刺激（步骤 4.4.1） |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| 图像分析软件（Fiji） | NIH | https://fiji.sc/ | 用于量化对机械刺激的响应（步骤 4.5） |
| 迁移分析软件（Tracking Tool PRO） | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | 用于量化细胞速度和持续性（步骤 5.4） |
参考文献
- Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A.
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重印与许可
