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方法文章

Dictyostelium discoideum 对急性机械刺激反应的评估

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DOI：

10.3791/56411

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2017年11月9日

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了评估细胞对急性机械刺激反应的方法。在基于显微镜的检测中，我们通过短暂的剪切流刺激后，观察荧光标记的生物传感器的定位变化。此外，我们还通过生物化学方法检测多种目标蛋白在急性机械刺激下的激活情况。

摘要

趋化性，即细胞沿化学引诱剂浓度梯度方向迁移，是目前理解最为清楚的定向迁移模式。利用社会性阿米巴原虫Dictyostelium discoideum进行的研究表明，由多条平行通路组成的复杂信号转导网络能够放大细胞对化学引诱剂的响应，从而导致肌动蛋白在梯度方向发生偏向性聚合，并形成朝向该方向的伪足。相比之下，其他类型的定向迁移（例如由剪切流或电场刺激引起的迁移）的分子机制尚不清楚。许多调控趋化性的因子在迁移细胞的前缘或后缘表现出定位特征，并且在受到化学引诱剂全局刺激后，其定位或活化状态会出现短暂变化。为了理解其他类型定向迁移的分子机制，我们开发了一种方法，可通过短暂（2–5秒）暴露于剪切流，实现对细胞急性机械刺激反应的检测。该刺激可在成像通道中施加，同时观察表达荧光标记生物传感器的细胞，以分析单个细胞的行为。此外，也可在培养板中对细胞群体进行刺激，随后裂解细胞并使用识别目标蛋白活性形式的抗体进行免疫印迹分析。通过结合这两种检测方法，可以广泛检测因亚细胞定位改变和/或磷酸化而被激活的多种分子。利用该方法，我们发现急性机械刺激可触发趋化性信号转导通路以及肌动蛋白细胞骨架网络的激活。研究细胞对急性机械刺激响应的能力，对于理解剪切流诱导细胞运动所必需的起始事件至关重要。该方法还提供了一种在不受化学引诱剂受体干扰的情况下研究趋化性信号转导网络的工具。

引言

真核细胞的迁移受到环境中多种化学和物理信号的引导，包括可溶性或基质结合性趋化因子的浓度梯度、基质刚度的变化、电场以及剪切流。尽管在趋化性驱动的分子机制方面已取得诸多进展，但对于其他类型的定向迁移，以及细胞如何在整体水平上整合这些多样化的信号以产生统一的迁移反应，目前仍知之甚少。

向趋化因子浓度升高的方向进行定向迁移涉及三个行为组分：运动性、方向感知和极性1。运动性是指细胞通过伪足伸出实现的随机移动。方向感知是细胞检测趋化因子来源的能力，即使在不能移动的细胞中也可发生。极性是指细胞内组分在前端与后端之间更为稳定的不对称分布，从而导致运动持续性的增强。

细胞对趋化因子的反应依赖于四个概念上定义的调控网络：受体/G蛋白、信号转导、肌动蛋白细胞骨架和极性1。趋化因子与G蛋白偶联受体结合后，通过异源三聚体G蛋白的α亚基和βγ亚基将信号传递至下游的信号转导网络，从而放大方向性信号。信号转导网络中的多条通路并行作用，并共同作用于肌动蛋白细胞骨架网络，以在浓度梯度方向上偏向性地促进肌动蛋白聚合及随之而来的伪足突出。在趋化性的重要调控因子中，包括Ras GTP酶、TorC2、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）以及鸟苷酸环化酶。信号转导网络内部以及信号转导与肌动蛋白细胞骨架网络之间的反馈机制进一步放大了细胞响应。最后，尚不明确的极性网络接收来自肌动蛋白细胞骨架的输入信号，并进一步偏向性地调节信号转导网络，以促进细胞沿浓度梯度方向持续迁移。

我们对趋化性的机制理解在很大程度上得益于为调控网络中各种组分开发的荧光标记生物传感器。许多趋化性调控因子在调控分子本身或其活性上呈现不对称分布。例如，识别小GTP酶Ras和Rap1活化形式的生物传感器——分别为Raf1的Ras结合结构域（以下简称RBD）和RalGDS——会定位于趋化细胞的前缘2,3。类似地，PI3K及其产物磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸（PIP3）——可通过pleckstrin同源（PH）结构域识别——也定位于细胞前端4,5。相反，能将PIP3转化回磷脂酰肌醇（4,5）-二磷酸的3-磷酸酶PTEN则定位于细胞后缘6。重要的是，这些生物传感器在受到趋化因子全局刺激时会改变其定位。在静息细胞中位于细胞质或突起尖端的前缘标志物会重新定位于皮层，而在静息细胞中定位于皮层且在突起尖端缺失的后缘标志物在刺激后则变为细胞质定位。通过分析趋化因子全局刺激下生物传感器的分布，可最大限度减少运动性和极性对观察结果的干扰。对细胞悬液进行趋化因子的全局或均匀刺激，也常用于评估蛋白质活化在群体范围内的变化，这种变化通常通过蛋白质磷酸化来检测7,8,9。这种生化检测方法主要用于获取时间动态信息，而显微镜技术则用于获取调控网络中各组分行为的时间和空间信息。

信号转导网络具有可兴奋系统的一些特性10,11. 对高于阈值的趋化刺激的反应是 "全或无" 并表现出不应期。反应也可被随机触发，并呈现振荡行为。信号转导事件局限于皮层区域，并以波的形式传播。12,13,14,15前缘或后缘标记物会募集到传播波的激活区，或从这些区域解离。由于激活区后方存在不应期区域，当方向相反的波相遇时会相互湮灭。这种传播性的信号转导波驱动了介导细胞迁移的细胞突起形成。10.

上述关于趋化性的许多信息来源于对社会性变形虫Dictyostelium discoideum的研究，尽管类似的调控机制也适用于中性粒细胞和其他哺乳动物细胞类型16。Dictyostelium是一种公认的研究模型生物，在饥饿条件下表现出强烈的趋化反应，此时成千上万的单细胞会向聚集中心迁移，最终形成包含孢子的多细胞子实体。在该生物的单细胞生长阶段，趋化性对于定位细菌食物来源也至关重要。重要的是，单个Dictyostelium细胞的迁移与哺乳动物中性粒细胞或转移性癌细胞的迁移极为相似，这些细胞均表现出非常快速的变形虫样迁移。事实上，趋化过程中调控网络的整体拓扑结构以及许多具体的信号转导通路在Dictyostelium与哺乳动物白细胞之间是保守的17。此外，其他细胞（如成纤维细胞）则使用受体酪氨酸激酶（RTK）而非G蛋白偶联受体（GPCR）；然而，RTK可能同样作用于类似的调控网络。

与趋化性不同，目前对驱动其他多种定向迁移模式的信号机制尚缺乏全面理解。类似于在化学引诱剂梯度中迁移的细胞，已有若干研究报道，在响应剪切流或电场变化而发生定向迁移的细胞前端，会出现典型的前缘标志物的激活和/或定位，包括肌动蛋白聚合、PIP3 和/或细胞外信号调节激酶（ERK）1/218,19,20,21。然而，在这些研究中，细胞持续暴露于刺激因素下也会导致细胞迁移，因此仍存在疑问：例如，前缘标志物的定位是特异性地响应刺激而产生，还是仅仅由于迁移细胞前端伪足数量增加而被动出现在前缘位置。

我们开发了多种检测方法，能够观察细胞群体及单个细胞在剪切流引起的急性机械扰动下的响应22。与使用趋化因子进行全局刺激类似，通过剪切流进行的急性刺激可研究细胞对机械刺激的反应，同时避免了运动性或极性带来的干扰因素。将这些生化和显微检测方法与遗传学或药理学扰动相结合，有助于我们了解机械刺激是如何被感知和传递的。此外，该方法还提供了一种新颖的手段，可在无趋化因子存在的情况下，直接作用于趋化因子受体下游的信号通路，从而将信号转导和肌动蛋白细胞骨架网络与受体/G蛋白网络分离开来进行研究。

利用下述技术，我们最近证明了急性剪切应力可导致趋化信号转导和肌动蛋白细胞骨架网络中多个组分的激活22。通过在不同时间间隔施加急性机械刺激，我们证明了与趋化因子类似，细胞对机械刺激的反应也表现出可兴奋系统的特点，包括在饱和条件下反应的“全或无”行为以及存在不应期。最后，通过结合机械刺激与化学刺激，我们发现这两种刺激共享信号转导和肌动蛋白细胞骨架网络，这可能使细胞能够整合多种刺激信号，从而调控细胞迁移的方向。

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方案

1. 溶液的配制

  1. 使用以下成分制备HL-5培养基：10 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、0.965 g/L Na2HPO4·7H2O、0.485 g/L KH2PO4，以及除特别说明外，加入去离子水中的0.03 g/L链霉素。将培养基高压灭菌后，室温保存。
    注意：由于不同供应商提供的蛋白胨和酵母提取物之间以及不同批次之间的差异，培养基的pH可能需要调整至典型的6.4至6.7范围内。
  2. 使用以下成分制备SM平板：10 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、1 g/L酵母提取物、2.31 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4和20 g/L琼脂，溶于去离子水中。高压灭菌后冷却，每10 cm培养皿倒入30 mL琼脂溶液。琼脂凝固后，将平板置于4 °C保存，最多可保存1个月。
  3. 使用去离子水配制10×磷酸盐缓冲液（PB），含13.4 g/L Na2HPO4·7H2O和6.8 g/L KH2PO4。将10×储存液置于4 °C保存。使用时用去离子水稀释至1×。
  4. 通过在1×PB中添加2 mM MgSO4和0.2 mM CaCl2制备DB缓冲液。
  5. 使用去离子水配制100 mM咖啡因溶液。于−20 °C保存。
  6. 将cAMP钠盐一水合物溶解于去离子水中，配制100 mM cAMP储存液。再用去离子水配制1 mM工作液。两种储存液均于−20 °C保存。实验当天，在DB缓冲液中配制所需浓度的终浓度cAMP溶液。
    注意：储存液可进行数次冻融循环。
  7. 在1×PB中配制25 mM叶酸溶液。加入数滴1 N NaOH，直至粉末完全溶解。于−20 °C保存。
  8. 使用以下成分配制3×上样缓冲液：187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8）、6%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）、30%甘油、126 mM二硫苏糖醇和0.03%（w/v）溴酚蓝。分装后于−20 °C保存。
    1. 使用前，在37 °C水浴中解冻，并通过将3×上样缓冲液稀释至1×，同时加入50 mM NaF、2 mM Na3VO4、25 mM焦磷酸钠以及1×不含EDTA的蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合液（溶于去离子水中），制备含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液。在开始步骤3.1.2–3.1.3所述操作前立即加入抑制剂。
  9. 用DMSO配制5 mM Latrunculin A溶液。分装后于−20 °C保存。

2. D. discoideum 细胞的制备

注意：将 D. discoideum 细胞在 HL-5 培养基中培养，可使用组织培养板或悬浮培养，具体方法如前所述23。必要时，根据标准电穿孔方案将细胞转染荧光标记的生物传感器24。各种 D. discoideum 菌株以及编码生物传感器或其他目的基因的质粒均可从 Dicty Stock Center (dictybase.org) 获得。

  1. 营养体的培养与收集 D. discoideum 细胞
    1. 为分析营养细胞，需在细菌存在条件下培养细胞，以减少巨胞饮泡的数量，这类结构通常在无菌培养的细胞中被观察到25.
      1. 制备一培养物 肺炎克雷伯菌 通过将甘油保存菌种或前次培养物中的少量细胞接种至所需体积的不含抗生素的HL-5培养基中进行培养。将细菌培养物置于摇床中，在室温（20–22 °C）下以200 rpm（0.42 × g）振荡培养16–18小时。
        注意： K. aerogenes 此处使用的菌株为非致病性（参见 材料表).
    2. 收集 D. discoideum 指数生长期的细胞，无论是来自组织培养板还是悬浮培养物，均需按照制造商说明书使用血细胞计数板进行细胞计数。接种 1 × 105 D. discoideum 细胞与 260 µL K. aerogenes SM 平板上的悬液。第二天将平板倒置。在室温下培养细胞直至 D. discoideum 细胞开始清除细菌菌苔，但尚未开始聚集时（约36-48小时）。
    3. 收集 D. discoideum 用玻璃涂布器在5 mL DB缓冲液中刮取细胞，将细胞转移至50 mL聚丙烯管中。用另外5 mL DB缓冲液冲洗培养板，并将冲洗液与原始悬液合并。用DB缓冲液定容至50 mL。
    4. 离心 D. discoideum 360 × g 离心 3–4 分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于 50 mL DB 缓冲液中。重复洗涤步骤，直至上清液澄清（约洗涤 3 至 4 次）。将最终的细胞沉淀重悬于 DB 缓冲液中，调整细胞密度至约 5 × 10⁶6 cells/mL
  2. 制备具有聚集能力的 D. discoideum 细胞
    1. 开发 D. discoideum 通过标准方案进行1小时饥饿处理，随后进行4小时饥饿，并每隔6分钟用50 nM cAMP脉冲刺激23.
    2. 发育完成后，测量细胞悬液的最终体积。
    3. 根据用于培养的初始细胞数量，计算最终悬液的细胞密度。
      注意：若每6分钟加入100 µL cAMP溶液，则每小时cAMP脉冲处理期间细胞体积增加1 mL。因此，在使用8 x 10⁶7 4 mL DB 中的细胞，经过 4 小时培养后，终体积为 7 mL，终细胞密度约为 1.1 × 107 cells/mL

3. 细胞对机械或化学刺激反应的生化分析

  1. 细胞急性机械刺激及后续裂解
    1. 将发育4小时后的2 × 106个具有聚集能力的细胞（来自步骤2.2）接种于含2 mL DB培养基的35 mm培养皿中，室温孵育10分钟使细胞贴壁。用1 mL DB缓冲液洗涤细胞两次。在DB缓冲液中加入2.5 mM咖啡因，于未扰动条件下孵育30分钟 。
      注意：若需使用药理学抑制剂处理细胞，可在咖啡因预处理阶段加入所需浓度的抑制剂或等体积的相应溶剂对照。
    2. 进行机械刺激时，将培养皿（一次一个）置于轨道摇床上，立即以150 rpm（0.24 × g）振荡5秒。
      注意：也可通过手动方式以十字交叉运动对培养皿进行约5秒的机械刺激。
    3. 在刺激开始后的指定时间点吸除缓冲液，并立即加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的100 µL样品缓冲液裂解细胞。
    4. 将培养皿置于冰上，收集裂解液至1.5 mL离心管中。对于“0时间点”样品，不进行振荡直接裂解细胞。裂解后立即将离心管转移至95 °C金属浴中加热10分钟。随后进行免疫印迹分析，或将裂解液于-20 °C保存。
  2. 趋化因子刺激细胞
    1. 将发育4小时后具有聚集能力的细胞在轨道摇床上以200 rpm（0.42 × g）速度快速振荡，同时加入5 mM咖啡因，预处理30分钟。
      1. 将细胞悬液以360 × g离心3–4分钟，吸除上清液，沉淀用10 mL冰预冷的DB缓冲液重悬。重复洗涤一次。
    2. 根据初始接种细胞数量（见步骤2.2），将最终细胞沉淀用冰预冷的DB缓冲液重悬至终浓度为4 × 107个细胞/mL。刺激前将细胞悬液保持在冰上。
      1. 取50 µL 10 µM cAMP或溶剂对照加入置于轨道摇床上的聚苯乙烯杯中。
    3. 刺激时，向同一杯子中加入450 µL冰预冷的细胞悬液，并立即启动摇床以200 rpm（0.42 × g）振荡。在刺激开始后的不同时间点（例如 10、30、45、60、120秒），短暂停止摇动，取出50 µL细胞悬液，加入含25 µL 3×样品缓冲液的1.5 mL离心管中以裂解细胞。
      1. “0时间点”使用未经刺激的冰预冷细胞悬液中的细胞。
        注意：在此条件下，刺激过程中细胞悬液的最终温度约为9 °C26。该温度下信号响应峰值出现的时间略晚于室温下刺激所观察到的峰值（例如显微镜下贴壁细胞的趋化因子刺激或贴壁细胞的机械刺激）。
    4. 裂解后立即将离心管转移至95 °C金属浴中加热10分钟。随后进行免疫印迹分析，或将裂解液于-20 °C保存。
  3. 通过免疫印迹分析细胞响应
    1. 将步骤3.1.3或3.2.4获得的裂解液在4–15% Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，封闭后使用抗磷酸化PKCζ Thr410抗体进行免疫印迹（用于检测磷酸化PKBR1和磷酸化PKBA）。随后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育，采用增强型化学发光底物进行化学发光检测。
    2. 如需检测多种蛋白，可用洗脱缓冲液剥离膜上的抗体，再用抗磷酸化p42/44 MAPK Thr302/304抗体（用于检测磷酸化ERK2）重新孵育。通过考马斯亮蓝染色PVDF膜以确认各泳道蛋白上样量均一。

4. 显微镜下对单个细胞进行急性机械刺激和活体成像

  1. 使用流动装置评估对急性机械刺激的反应
    1. 收集并稀释营养期或具有聚集能力的细胞至约 1 × 106 细胞/mL，具体操作如步骤2.1和2.2所述。将约600 µL样品加入带有通道的载玻片中（见 材料表 （详见正文）。让细胞贴附10分钟。确保载片上的所有进样口均完全充满液体，必要时补充额外缓冲液。
      注意：用于分析的特定载片具有三个输入端，可将液体引入狭窄的1-mm通道，随后合并为一条宽3-mm通道。通道高度为0.4 mm。尽管细胞在整个通道内接种，但仅对宽段区域进行成像。
    2. 将连接至50 mL储液器的一根管路穿过流体单元的前右侧阀门（参见 材料表 有关详细信息）。使用泵的软件，确保阀门处于关闭状态（即 向左）。用 DB 填充储液槽。
      1. 将压力设为 50 mbar 并打开。点击阀门使其开启，用 DB 冲洗并填充管路。约 30 秒后，将压力调回 0，并关闭阀门。
    3. 将管路连接至载玻片一侧的三个入口之一，确保无气泡残留。将另外两个入口堵住。将排水管路连接至载玻片另一侧的单一入口。
      注意：本装置中用于输入和排水管路的 tubing 内径为 1.6 mm。
    4. 将载玻片置于显微镜下，使用20倍干镜物镜观察。为冲洗通道，切换阀门以打开管路，并点击 "压力开启"，从较高压力开始（约50 mbar或约40 dyn/cm）2）以将液体推入排水口。
      1. 一旦液体从排水口流出，将外部压力降至零（即仅重力流，约15达因/厘米2），并继续冲洗约30秒。将阀门切换至相反位置以停止流动。
    5. 在倒置荧光显微镜下，使用40倍油镜，以3秒间隔在RFP或GFP激发光下采集图像。将阀门置于关闭位置后，开启压力系统，调节至所需压力，通常为15至40 dyn/cm。2 (0 - 50 mbar)
    6. 获取5帧图像后，通过切换阀门来施加刺激 "开放" 调整位置。通过将阀门切换至相反方向，关闭流体流动，持续 2-5 秒。
      注意：对于某些较弱的生物传感器（例如 PTEN、CynA 和 RalGDS）时，可能需要使用配备40倍油镜物镜的共聚焦显微镜对细胞进行成像。
  2. 使用流动装置检测药理学抑制剂对急性机械刺激反应的影响
    1. 将细胞接种到带通道的载玻片中，具体操作如步骤 4.1.1 所述。设置两条管路：一条通过右前阀，如步骤 4.1.2 所示；另一条通过左后阀。夹闭左侧管路，并将阀门置于 "关闭" （左侧）位置。用含有适当载体的 DB 填充一行，另一行则填充含有目标药理学抑制剂的溶液例如 5 µM Latrunculin A
      注意：必须对左侧管路进行物理夹闭，因为 "关闭" 左侧位置打开该管路的阀门。
    2. 通过将压力调至50 mbar并切换阀门至右侧管路，进行灌注和冲洗 "开放" （右侧）位置。约30秒后将阀门切换至左侧。松开夹子约30秒，以填充并冲洗左侧管路。将两条管路连接至载玻片一侧带有通道的两个入口，堵住其余入口，并将出口连接至另一侧的单一入口。
    3. 用缓冲液冲洗右侧线条中的载玻片，并在与上述步骤4.1.3和4.1.4所述相同的缓冲液中进行刺激。
      注意：尽管在此设置中选择右侧通路作为第一条，但顺序可以调换。
    4. 刺激后，将阀门切换至在零压力下打开右侧管路（即 仅重力流，约 15 达因/厘米2）。移除左侧管路上的夹子，并将阀门向左切换以打开该管路。夹住第一条管路。
    5. 加入含抑制剂的缓冲液3-5 mL流经柱体后，将阀门向右切换以停止液体流动，随后根据实验所需时间孵育细胞与抑制剂例如 15 分钟）。每隔约 10 分钟切换阀门约 15 秒，以开启流体流动，防止缺氧。使用第二条管路重复刺激。
  3. 使用微移液管评估对急性机械刺激反应的替代方法
    1. 根据标准方案安装装有DB的微量移液器23保持补偿压力为 1,500 psi。
    2. 收集并稀释营养细胞，方法如步骤2.1所述。取约7.5 × 10⁷个细胞悬浮液，每滴25 µL，置于适当容器中5 细胞/mL 加入至1孔板中，静置至少10分钟使其贴壁，然后加入3 mL DB覆盖。
    3. 将腔室置于配备40倍油镜的倒置荧光显微镜上，找到细胞。轻轻将微量移液器降至视野中央，直至其首次接触腔室底部。
      注意：由于补偿压力设定为 1,500 Psi，细胞将持续暴露于微移液管中极其缓慢流动的 DB。
    4. 以3秒为间隔，使用RFP或GFP照明开始采集图像。应用“Clean”功能，从微移液管释放一滴液体。继续成像，此时流动仅由补偿压力引起。
  4. 一种通过大量缓冲液添加来评估对急性机械刺激反应的替代方法
    1. 收集并稀释营养细胞，方法如步骤 2.1 所述。取 20 µL 细胞液滴，细胞浓度约为 1 x 106 在8孔板的孔中央加入DB中浓度为cells/mL的细胞。让细胞贴壁至少10分钟。
    2. 使用配备40倍物镜的倒置荧光显微镜，以RFP或GFP特异性激发光每3秒采集一次图像。聚焦于液滴边缘附近的区域。
    3. 迅速将 430 µL DB 加入孔的一侧。继续成像。
    4. 为分析机械刺激与化学刺激之间的相互作用，在机械刺激后12秒或45秒时，轻轻加入50 µL叶酸（终浓度20 nM）或溶剂对照（DB），注意避免引发机械反应。继续成像。
  5. 反应的定量分析
    1. 在图像分析软件中打开32位TIFF图像（参见 材料表 详情请见27.
    2. 在“分析”选项卡下，前往 "设置测量参数"勾选“平均灰度值”选项，确保其他选项未被选中，然后单击 "好的".
    3. 在“流程”选项卡下，点击 "减去背景"将滚动球半径保持在50像素，不要勾选菜单中列出的任何选项。使用“放大镜”工具放大一个细胞。
    4. 使用“矩形”工具绘制一个约 2.5 × 2.5 µm 的方框2) 在细胞质中，注意不要将其画在细胞核或质膜上方。按压 "Ctrl" + "M" 或转至“分析”选项卡并点击 "测量" 测定该方框的平均灰度值。前进到后续帧并再次测量，确保方框始终位于细胞质中。
      注意：由于 D. discoideum 细胞移动非常迅速时，可将方框从一个画面移动到下一个画面，以使其保持在细胞质中。
    5. 所有图像帧分析完成后，将数值复制到电子表格中。为消除不同细胞间各种生物传感器表达水平的差异，以时间为0时测得的平均灰度值对数据进行归一化处理。计算这些归一化值的倒数，以反映信号在细胞皮层的累积情况。

5. 显微镜下对单个细胞进行持续机械刺激和活体成像

  1. 按照上述4.1.1–4.1.3步骤中所述，设置细胞用于急性机械刺激分析。打开覆盖储液池的塞子，以便在每次分析反应持续数分钟以上时补充缓冲液体积。
    注意：由于储液 reservoir 在整个实验过程中保持开放，该检测在无外加压力的条件下进行，仅依靠重力流动。为增加重力流速，可将排水端置于显微镜下方的桌面上。
  2. 使用配备40倍物镜的倒置荧光显微镜，以3秒间隔对细胞进行RFP或GFP特异性激发成像，用于分析生物传感器响应。或者，使用20倍物镜以10秒间隔进行相差成像，用于分析整体细胞迁移。
  3. 在零压力设置下采集数帧图像后，开启流体流动（即 流动仅由重力驱动或约为 15 dyn/cm2通过将阀门切换至打开位置来实现。当储液罐中的液体液面降至5-10 mL时，补充更多缓冲液。添加液体时务必小心，避免气泡滞留在管路中。
    注意：必须加入相同温度的液体，以避免细胞产生应激反应。
  4. 使用迁移分析软件量化细胞速度和持续性（参见 材料表 按照制造商说明进行操作（详见说明书）。

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结果

趋化性调节因子对急性机械刺激的时间响应

为评估 D. discoideum 细胞对机械刺激的响应，将贴壁的具有聚集能力的细胞暴露于短暂的剪切流刺激下。具有聚集能力的 D. discoideum 细胞会分泌 cAMP，邻近细胞可感知该信号分子。为消除细胞间信号传导的干扰，使用咖啡因处理细胞，该物质可抑制 D. discoideum 中的腺苷酸环化酶，从而阻断 cAMP 的分泌28。事实上，经咖啡因预处理的细胞中，PKBR1 和 ERK2 的基础活性极低，并在剪切流刺激 5 秒后，这两种激酶关键位点的磷酸化水平出现显著升高（图 1A）。该响应呈瞬时性，PKBR1 的磷酸化在约 10–15 秒达到峰值，ERK2 则在约 30 秒达到峰值，这与先前报道的趋化因子激活这些蛋白的动力学特征相似

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讨论

本文所述方法为评估细胞群体和单个细胞在剪切流作用下的行为提供了便捷途径。重要的是，尽管以往研究聚焦于细胞迁移过程中前导边缘和尾随边缘标志物的定位，但本方法通过急性施加剪切流，可研究其即时效应。利用该方法，我们证明了细胞对剪切流的初始反应实际上并不依赖细胞迁移。相反，细胞对初始剪切流刺激产生的快速且短暂的反应，早于长时间暴露于剪切流所引起的定向迁移，这与趋化因子梯度诱导的初始全局反应类似。

尽管每种方法都有其独特的优缺点，生化和显微方法仍能提供互补的数据。例如，通过刺激细胞后裂解并进行PKBs、KrsB和ERK的免疫印迹分析，可检测整个细胞群体，从而平均化细胞间的变异，这与检测单个细胞行为的实验方法不同。然而，基于群体的检测往往掩盖了细胞行为中细微的变化，而这些变化在分析单个细胞时可被轻易观察到。此外，此处描述的生化检测仅对具有聚集能力的细胞有效，原因将在后文讨论。相比之下，基于显微镜的检测方法，例如RBD、RalGDS、PH-Crac、LimEΔcoil和PTEN在皮层与细胞质之间重新定位的检测，对营养生长期细胞和具有聚集能力的细胞均有效，因此可用于观察不同程...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助，资助号为 R35 GM118177，授予 PND。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
葡萄糖FisherD16-1用于配制 HL-5 培养基和 SM 平板（步骤 1.1、1.2）
蛋白胨FisherDF0120-17-6用于配制 HL-5 培养基（步骤 1.1）
酵母提取物Fisher50-550-445用于配制 HL-5 培养基和 SM 平板（步骤 1.1、1.2）
Na2HPO4·7H2OFisherS373-500用于配制 HL-5 培养基和 10X 磷酸盐缓冲液（步骤 1.1、1.3）
KH2PO4FisherP386-500用于配制 HL-5 培养基、SM 平板和 10X 磷酸盐缓冲液（步骤 1.1–1.3）
链霉素（二氢链霉素硫酸盐）FisherICN10040525用于配制 HL-5 培养基（步骤 1.1）
蛋白胨（Bacto）FisherDF0118-17-0用于配制 SM 平板（步骤 1.2）
K2HPO4FisherP288-100用于配制 SM 平板（步骤 1.2）
琼脂FisherBP1423-500用于配制 SM 平板（步骤 1.2）
MgSO4FisherM65-500用于配制 DB 缓冲液（步骤 1.4）
CaCl2FisherC79-500用于配制 DB 缓冲液（步骤 1.4）
咖啡因FisherO1728-500用于配制咖啡因溶液（步骤 1.5）
cAMP（EMD Millipore Calbiochem 3',5'-环磷酸腺苷钠盐）Fisher11-680-1100MG用于配制 cAMP 溶液（步骤 1.6）
叶酸SigmaF7876用于配制叶酸溶液（步骤 1.7）
Tris 碱FisherBP152-500用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8）
十二烷基硫酸钠（SDS）FisherBP166-500用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8）
甘油FisherG33-500用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8）
二硫苏糖醇（DTT）Bio-Rad1610610用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8）
溴酚蓝Bio-Rad1610404用于配制 3X 上样缓冲液（步骤 1.8）
NaFFisherS299-100用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8）
Na3VO4Fisher50-994-911用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8）
焦磷酸钠十水合物FisherS390-500用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8）
完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物（Roche）Sigma11873580001用于配制含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的上样缓冲液（步骤 1.8）
Latrunculin AEnzo Life SciencesBML-T119-0100用于配制 Latrunculin A 溶液（步骤 1.9）
4-15% Tris-HCl 聚丙烯酰胺凝胶Bio-Rad3450029用于免疫印迹（步骤 3.3）
聚偏氟乙烯膜Bio-Rad1620177用于免疫印迹（步骤 3.3）
磷酸化 PKC（泛）（zeta Thr410）（190D10）兔单克隆抗体Cell Signaling2060免疫印迹中使用的一抗（步骤 3.3）
磷酸化 p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）（D13.14.4E）XP 抗体Cell Signaling4370免疫印迹中使用的一抗（步骤 3.3）
驴抗兔 IgG HRP 标记全抗体GE HealthcareNA934-100UL免疫印迹中使用的二抗（步骤 3.3）
增强型化学发光底物（Clarity Western ECL 底物）Bio-Rad1705060用于免疫印迹（步骤 3.3）
洗脱缓冲液（Restore Plus Western blot 洗脱缓冲液）PiercePI46430用于免疫印迹（步骤 3.3）
考马斯亮蓝FisherPI20278用于免疫印迹（步骤 3.3）
K. aerogenes 菌株（非致病性）Dicty Stock Center (dictybase.org)
名称公司目录编号备注
材料与设备
轨道摇床（型号 G-33，或相当替代型号）New Brunswick Scientific用于培养 K. aerogenes（步骤 2.1.1），以及用于基础培养和刺激 D. discoideum 细胞（步骤 3）。该摇床的回转半径为 9.5 mm。
10 cm 培养皿FisherFB0875712用于配制 SM 平板（步骤 1.2）
血细胞计数板Fisher02-671-51B用于计数 D. discoideum 细胞（步骤 2.1.2）
35 mm 培养皿（Corning Falcon 易握组织培养皿）Fisher08-772A用于接种 D. discoideum 细胞，以进行机械刺激后裂解（步骤 3.1.1）
聚苯乙烯杯（5 mL）VWR13915-985用于以趋化剂刺激 D. discoideum 细胞悬液（步骤 3.2.2）
带泵流体装置（ibidi 泵系统）Ibidi10902用于向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5）
带通道的载玻片（μ-Slide III 3in1 ibiTreat：#1.5 聚合物盖玻片，组织培养处理，已灭菌）Ibidi80316用于接种 D. discoideum 细胞，以通过流体装置施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5）
50 mL 储液槽（Ibidi 流体装置储液槽支架）Ibidi10978用于搭建流体装置，以向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5）
流体装置连接管（Perfusion Set 黄绿双色管）Ibidi10964用于搭建流体装置，以向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5）。注意：两根管也可从 1.6 mm 管（目录号 10842）中截取。
排水管（内径 1.6 mm 管）Ibidi10842用于搭建流体装置，以向通道中的 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.1、4.2 和 5）。
配备 40X/1.3 油镜和 20X/0.3 空气镜的 Zeiss Observer.Z1 倒置显微镜（或相当替代型号）Zeiss用于以相差或荧光照明方式成像 D. discoideum 细胞（步骤 4 和 5）
配备 40×/1.25–0.75 油镜的 UltraView 旋转盘共聚焦显微镜（或相当替代型号）Perkin-ElmerDM 16000用于成像 D. discoideum 细胞的替代设备（步骤 4.1.4）
FemtoJet 微注射仪（Eppendorf；型号 5247，或相当替代型号）配 Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D 和 5192000027用于通过微移液管向 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.3）。注意：目录号为该设备最新版本（4i）的编号。
微移液管（Femtotip；外径 1 μm，内径 0.5 μm）Eppendorf930000035用于通过微移液管向 D. discoideum 细胞施加机械刺激（步骤 4.3）
微加样头（Eppendorf Femtotips 微注射仪专用加样头）Eppendorf5242956.003用于向微移液管（Femtotip）中填充缓冲液（步骤 4.3.1）
单孔培养室（Thermo Scientific Nunc Lab-Tek 培养室盖玻片）Fisher12-565-472用于接种 D. discoideum 细胞，以通过微移液管施加机械刺激（步骤 4.3.2）
八孔培养室（Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II 培养室盖玻片）Fisher12-565-338用于接种 D. discoideum 细胞，以通过大量缓冲液添加施加机械刺激（步骤 4.4.1）
名称公司目录编号备注
软件
图像分析软件（Fiji）NIHhttps://fiji.sc/用于量化对机械刺激的响应（步骤 4.5）
迁移分析软件（Tracking Tool PRO）Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/用于量化细胞速度和持续性（步骤 5.4）

参考文献

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