本研究介绍了一种利用激光散斑对比成像仪在单次实验中测量和分析血液微循环交变速度的新技术。
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摘要
摘要
激光散斑对比成像技术（LSCI）提供了一种强大而简便的微循环血流测量方法。该技术适用于血流动力学响应的检测，其使用方式与传统的激光多普勒成像仪（LDI）相同。然而，由于LSCI的最大皮肤穿透深度约为1毫米，因此主要用于表层血流的监测，并可用于测量最大达15厘米×20厘米的皮肤表面区域。本文介绍了一种新方法，能够应对微循环中不同流速的变化，即可利用LSCI同时测量慢速和快速的血流灌注。该创新技术还克服了LSCI最主要的缺陷——对运动伪影的高度敏感性。通过引入一种粘性不透光贴片（AOP），将AOP处的LSCI信号从激光散斑皮肤信号中扣除，从而实现对微循环血流的满意记录。此外，本文还确定了最佳设置参数，因为当以参考基线为对照测量灌注量变化时，LSCI的效能最高，此时微循环血流灌注以相对于基线的百分比变化来表示。这些变化可用于分析血液循环系统的状态。
引言
激光散斑对比成像（LSCI）是一种经过验证的非接触式、实时监测方法，用于分析血流微循环1,2,3,4,5,6,7。本文所使用的LSCI设备为moorFLPI全视野成像系统。该设备的主要优势之一是利用一种称为"激光散斑"的现象，实现对大面积区域血流灌注的高空间和时间分辨率测量6。通过相机捕捉散射产生的散斑图样，可实现实时的微循环评估。由于moorFLPI LSCI系统专为临床和生理学研究设计，其图像处理软件基于以下原理：高灌注会导致激光散斑图样的快速变化，这种变化被电荷耦合器件（CCD）积分后形成低对比度区域8。系统对对比度进行量化，并将所得通量以颜色编码方式呈现，从而生成灌注图像8。
遗憾的是，激光散斑衬比成像（LSCI）对环境振动、伪影以及被测区域的运动非常敏感9。迄今为止，在研究交替血流状态时，这一特性带来了挑战。本文详细阐述了近期一项研究10中所采用的具体技术，该研究使用神经肌肉电刺激装置，在被检测肢体发生运动的情况下测量了微循环血流。
方案
所报道的方法已用于一项研究，该研究于2016年2月9日获得伯恩茅斯大学研究伦理委员会的伦理批准（编号10571）。
1. 激光散斑成像系统设置
- 将 moorFLPI LSCI 后面板连接至其三个接口（电源、通用串行总线 (USB) 和 IEEE1394），以使系统正常运行。
- 将 moorFLPI LSCI 倒置，使用 4 个螺丝将其固定在桌面支撑臂上，并完成支撑臂的组装。
- 安装时旋转支架，以实现向下成像。
注意：LSCI 具有三个控制装置：(1) 变焦调节器——当成像器位置固定后，可通过调节变焦获得较小或较大的视场，分别对应最小和最大放大倍数。为确保可重复性，配有带刻度环的标签；(2) 聚焦调节器——其设置取决于测量距离，需在确定成像位置后进行调节。为确保可重复性，同样配有带刻度环的标签；(3) 偏振器——配备线性偏振滤光片，可用于最小化暴露器官表面的镜面反射，旋转支架可实现 360° 旋转。 - 安装用于控制相机的软件。该软件分为两个模块，分别提供测量和回放功能。
2. 受试者准备
- 确保在温度受控的房间（22 ± 1 °C）内进行评估，并在测试前让受试者静坐10分钟，以适应室温。
- 避免强人工光源和阳光直接照射受试者或激光散斑对比成像仪（LSCI），因为环境光可能影响工作波长为785 nm的moorFLPI近红外激光光源。
注意：可通过打开成像装置窗口并遮挡激光来简单测试环境光水平是否可接受。若此时图像几乎完全呈黑色，则无需进一步操作；若图像中仍存在过多环境光，则需采取进一步措施。 - 确保受试者在整个评估过程中保持放松，若为坐姿，双脚应平放在地面上，并避免交谈。
- 放置 8 cm2 遮光性粘性敷料（AOP）(例如，Leukotape）覆盖于皮肤区域以遮蔽血流。此举旨在弥补激光散斑对比成像（LSCI）对运动伪影高度敏感的缺陷，信号的背向散射将用于微循环血流的测量。
3. 微循环图像测量
- 选择“空间处理”模式，以每秒25帧的速度进行152 × 113像素的图像采集。
- 选择“实时图像测量”，将成像仪置于距离受试者20 cm处，并调整变焦、对焦和偏振器，以尽量减少镜面反射。图像应显得较为“平坦”且无明显特征。
- 设置20 ms的曝光时间，以提高对微小变化和低通量的灵敏度。
- 采用25 Hz的显示速率和0.3 s的时间常数，以适应快速的血流变化，并通过降低图像噪声来实现最佳对比度。
- 创建两个面积相等（2 cm2）的兴趣区域（ROI），分别命名为ROI 1和ROI 2。将ROI 2对齐至8 cm2的AOP区域内。注意保持两个ROI相对位置固定，彼此间距控制在2–4 cm之间，以避免因机械移动导致ROI 2偏离AO区域而需重新定位。
注意：在信号强度过低或过高的区域，血流测量的准确性会下降，因此必须设置合适的增益值。增益范围为0–200，最佳增益值应在70–80之间。 - 相对于参考基线进行通量测量。在本方法中，将“静息”阶段设为参考基线，因此将“快速”和“慢速”阶段的血流量表示为相对于基线（即静息阶段）的百分比变化。
- 以视频格式记录血流测量结果，并使用图像回放模块保存以供离线分析。
4. 离线分析
注意：moorFLPI 图像分析软件可用于打开视频以进行分析。
- 在一系列平均血流记录后，计算感兴趣区域（ROI）内的平均通量。ROI 1 是皮肤血流的真实测量值，而 ROI 2 是来自 AOP 的激光散斑皮肤信号的背向散射。
- 通过从 ROI 1（皮肤血流）中减去 ROI 2 来计算平均血流。
ROI 1 - ROI 2 = 平均血流
结果
激光散斑衬比成像（LSCI）实验装置的设置如图1所示，并标出了各功能部件。图中展示了一名典型受试者在大腿前侧区域进行血流测量时的准备状态。可调节的安装支架可实现LSCI设备的旋转，从而对任意特定皮肤区域的微血管系统血流进行测量。图2展示了一个典型的原始散斑图像示例，以及根据本实验方案中所述的自定义设置所转换得到的散斑图像，用于微循环血流的测量。
图3展示了使用moorFLPI激光散斑成像系统进行交替血流连续数据记录时，皮肤区域及AOP探头放置位置（步骤3.1）、LSCI原始成像设置（步骤3.2）、慢速血流的实时图像（步骤3.3）以及快速血流的实时图像（步骤3.4）的示例。调色板颜色编码设置可用于区分不同的血流量级。在标准的16色调色板中，低血流量显示为蓝色，中等血流量显示为绿色，高血流量则显示为橙色和红色。
皮肤血流量以激光散斑灌注单位（LSPU）表示。 图4 显示了皮肤区域上 ROI 1、ROI 2 和 AOP 的图形表示。使用 ROI 1 和 ROI 2 的数据以及公式（1）在离线分析中计算平均血流量。
图1：moorFLPI LSCI实验装置示意图。 桌面支撑臂、电缆输出端口、位置控制装置（变焦调节器、焦距调节器和偏振器）、AOP以及用于图像参数设置的笔记本电脑。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：数据记录前的原始散斑图像。 2.1 - 2.2）由于设置不当导致增益过高、可见度差的通量图与原始散斑图像，这将导致血流测量结果准确性降低。2.3 - 2.4）按照实验方案正确配置系统，获得增益合适、可见度最大化的图像，从而得到可靠的结果。请点击此处查看本图的放大版本。
图3：使用moorFLPI激光散斑对比成像系统进行实验装置设置与测量记录的概述。 3.1) 皮肤区域（大腿）上带有2 cm2 AOP，用于校正人为移动造成的伪影。3.2) 原始散斑图像呈现“平坦且无特征”的外观，表明在最佳设置下具有良好的背向散射光强度。3.3) 慢速血流的实时图像记录。3.4) 快速血流的实时图像记录。 请点击此处查看此图的高清版本。
图4：皮肤区域上感兴趣区域1（ROI 1）、感兴趣区域2（ROI 2）及AOP布局的图示。请点击此处查看该图的放大版本。
| 静息状态（基线参考）（LSPU） | 缓慢血流（LSPU） | 中等血流（LSPU） | 快速血流（LSPU） | |||||||||||
| 平均通量 - ROI 1 | 平均通量 - ROI 2 | 平均血流量 | 平均通量 - ROI 1 | 平均通量 - ROI 2 | 平均血流量 | 相对于基线的血流量增加百分比 | 平均通量 - ROI 1 | 平均通量 - ROI 2 | 平均血流量 | 相对于基线的血流量增加百分比 | 平均通量 - ROI 1 | 平均通量 - ROI 2 | 平均血流量 | 相对于基线的血流量增加百分比 |
| 157.9 | 35.1 | 122.8 | 178.5 | 41.6 | 136.9 | 10.9 | 216.9 | 44.6 | 172.3 | 33.5 | 418.9 | 77.5 | 341.4 | 94.2 |
表1：基线、慢速、中等及快速血流条件下，ROI 1 和 ROI 2 的 LSPU 平均通量。血流增加以相对于基线阶段的百分比变化表示。
图 5：皮肤表面区域（大腿）上 ROI 1 和 ROI 2 定位示例。 采用16色色谱标示灌注层次。以灌注单位记录 ROI 1 和 ROI 2 的数据，并按公式1所述进行相减，以测量血液微循环。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究旨在介绍一种利用激光散斑衬比成像技术（LSCI），在单次实验中对血液微循环交变速度进行测量与分析的新方法。测量结果可能受到环境光、振动以及受试者运动（包括呼吸和抽动）的影响。本方案中所述的各个步骤均经过设计，以最大限度地减少这些干扰因素，从而获得可靠且可重复的血液微循环测量数据。
需要强调的是，该方案中的每一步对于准确测量血液微循环都至关重要。所介绍的技术是在对所有可能的设置选项及组合（包括时间常数、缩放设置、曝光时间、显示速率、增益和通量图像调色板）进行逐次测试后发现的。通过实时视频显示和离线分析对结果进行分析与重复验证，以确定最佳成像设置。这一点至关重要，因为图像处理软件利用了高灌注会产生激光散斑图样快速变化的特性，从而在视频图像中生成对比度低且散斑清晰的区域。随后，灌注图像以颜色编码的方式呈现微循环灌注情况。
实验区域和受试者准备被认为至关重要，可通过避免在自然光（窗户）或强人工光源附近工作来加以控制，因为这些光源可能会干扰 moorFLPI 的近红外激光源。本方案还引入了人工光学探头（AOP），因为已知环境振动和受试者自身的运动均会产生与血流信号无法区分的干扰信号。AOP 被证明是一种简单而有效的选择，它提供了一种薄而不透明、轻便且易于获取的方案，其表面在显微尺度上具有粗糙结构，可避免显著的镜面反射。Omarjee 等人et al.11 的初步研究指出，Leukotape 会产生与皮肤不同的反射信号幅度，且在不同受试者之间存在显著差异，这可能构成一种潜在局限；然而 Mahe et al.1 未发现受试者之间存在显著差异。尽管 Leukotape 比其他定制的双层粘性贴片更易获取，但使用其他替代性 AOP 可能进一步提高公式（1）测量的准确性。
离线分析部分强调了感兴趣区域内感兴趣区域（ROI）的大小及其位置的重要性。最初尝试使用一个较大的ROI 1（约8 cm2），其覆盖在ROI 2之上。由于伪影移动导致ROI 2发生位移，该方法很快变得不可靠，必须中断实时实验以重新居中ROI 2。另一个缺陷是，由于ROI 1覆盖了动脉氧分压区域（AOP），平均血流信号不再包含AOP下方区域的信息，因为此时已无背向散射信号。这意味着大量血液微循环区域被忽略，因此所获得的血流数据不准确。因此，采用两个面积均为2 cm2的ROI，AOP为8 cm2，且ROI 1与ROI 2之间无重叠（但保持相距2–4 cm），可提供一种可靠且可重复的血液微循环测量分析方法。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| moorFLPI LSCI | Moor Instruments | 暂无提供 - 描述中已提供在线链接 | moorFLPI 是一种利用红外激光散斑对比分析技术测量微血管内血流的仪器。 https://gb.moor.co.uk/ |
| moorFLPI 图像回顾模块 | Moor Instruments | 暂无提供 - 已提供在线链接 | 与 moorFLPI 配合使用，用户可通过改变组织灌注的彩色编码图来记录和测量血流变化。 https://gb.moor.co.uk/ |
| Leukotape | BSN Medical | 72978-10 | 具有微孔表面的医用胶带。 http://www.bsnmedical.co.uk/fileadmin/z-countries/United_Kingdom/PDF/L/Leukotape_K_A46PP_low_res_11112013.pdf |
参考文献
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- Omarjee, L., et al. Optimisation of movement detection and artifact removal during laser speckle contrast imaging. Miscrovas Res. 97 (1), 75-80 (2015).
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