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方法文章

用于细胞应用的核壳结构掺杂镧系上转换纳米晶的合成

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DOI：

10.3791/56416

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2017年11月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical & Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 2Institute of Materials Research & Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于合成核壳结构的镧系元素掺杂上转换纳米晶体（UCNs）的方案，并展示了其在近红外（NIR）光照射下用于细胞中通道蛋白调控的应用。

摘要

近年来，掺杂镧系元素的上转换纳米晶体（UCNs）因其具有前景且可调控的光学特性而受到广泛关注，这类材料能够吸收近红外（NIR）光，并将其转化为覆盖从紫外到可见光再到近红外区域的多重发射。本文详细介绍了通过高温共沉淀法合成核壳结构UCNs的实验步骤，将不同的镧系离子掺入纳米晶体中，以高效地将可穿透深层组织的近红外激发光（808 nm）转化为在480 nm处的强蓝光发射。通过使用生物相容性聚合物（聚丙烯酸，PAA）进行表面修饰，所制备的UCNs在缓冲溶液中表现出优异的溶解性。亲水性纳米晶体进一步被功能化修饰，连接特定配体（二苯并环辛炔，DBCO），以实现其在细胞膜上的定位。在近红外光（808 nm）照射下，上转换产生的蓝光可有效激活细胞膜上的光控通道蛋白，特异性调控阳离子（例如，Ca2+）向细胞质内的流入。本实验方案为核壳结构掺杂镧系元素UCNs的合成及其后续用于细胞应用的生物相容性表面修饰提供了可行的技术方法。

引言

近年来，掺杂镧系元素的上转换纳米晶体（UCNs）因其优异的化学和光学特性，已在生物医学领域广泛应用，成为传统有机染料和量子点的替代品。这些特性主要包括良好的生物相容性、高抗光漂白性以及窄带发射。1,2,3更重要的是，它们可作为一种极具前景的纳米换能器，具有优异的组织穿透深度 体内 通过多光子上转换过程，将近红外（NIR）激发转化为从紫外、可见光到近红外区域的宽范围发射4,5这些独特性质使得掺杂镧系元素的上转换纳米颗粒成为生物传感、生物医学成像及疾病诊疗一体化极具前景的载体。6,7,8.

上转换纳米颗粒（UCNs）的基本组成主要基于掺杂在含有敏化剂的绝缘基质中的镧系离子例如, Yb3+，Nd3+）和一种激活剂（例如，Tm3+，Er3+，Ho3+在晶体内部均匀分布9纳米晶体的不同光学发射归因于4f内层电子跃迁f 镧系掺杂剂的轨道由于其阶梯状排列的能级10因此，精确控制含多组分镧系掺杂剂的上转换纳米颗粒（UCNs）的尺寸和形貌至关重要。目前，已建立了一些有前景的方法用于制备镧系掺杂的上转换纳米颗粒，包括热分解法、高温共沉淀法、水热合成法、溶胶-凝胶法。 等等。11,12,13 在这些方法中，高温共沉淀法是上转换纳米颗粒合成中最常用且最便捷的策略之一，可在相对较短的反应时间和较低成本下，通过严格控制条件制备出形貌均一、尺寸分布均匀的高质量纳米晶体14然而，通过该方法合成的大多数纳米结构主要被油酸和油胺等疏水性配体所包覆，由于疏水性配体在水溶液中的溶解度有限，通常会阻碍其进一步的生物应用15因此，在生物应用中制备生物相容性上转换纳米颗粒（UCNs）时，有必要采用适当的表面修饰技术。 体外 和 体内.

本文中，我们介绍了通过高温共沉淀法合成核壳结构上转换纳米颗粒（UCNs）的详细实验步骤，以及一种可行的修饰技术，用于在UCNs表面功能化生物相容性聚合物，以进一步应用于细胞体系。该UCNs纳米平台将三种镧系离子（Yb3+、Nd3+和Tm3+）掺杂进入纳米晶体中，在808 nm近红外光激发下产生强烈的蓝色发射（~480 nm），该波长在活体组织中具有更深的穿透深度。众所周知，与传统在980 nm激发下的UCNs相比，掺杂Nd3+的UCNs在该光谱窗口（808 nm）下表现出更小的水吸收和过热效应16,17,18。此外，为了将UCNs应用于生物系统，首先通过在酸性溶液中超声处理去除UCNs表面的疏水性配体（油酸）19。随后，将去除配体的UCNs进一步修饰上一种生物相容性聚合物（聚丙烯酸，PAA），以获得在水溶液中良好的溶解性20。进一步地，作为细胞应用的概念验证，亲水性UCNs被进一步功能化修饰分子配体（二苯并环辛炔，DBCO），以实现其在叠氮（N3）标记的细胞膜上的特异性定位。在近红外光（808 nm）照射下，480 nm处的上转换蓝光发射可有效激活细胞膜表面的光门控通道蛋白——通道视紫红质-2（ChR2），从而促进阳离子（例如，Ca2+离子）跨活细胞膜内流。

本视频方案提供了一种可行的镧系掺杂上转换纳米颗粒（UCNs）的合成方法、生物相容性表面修饰技术，以及在活细胞中的生物应用。纳米晶体生长过程中合成方法和化学试剂的任何差异，都会影响用于细胞实验的最终UCNs纳米结构的尺寸分布、形貌和上转换发光（UCL）光谱。本详细的视频方案旨在帮助该领域的新研究人员提高采用高温共沉淀法合成UCNs的可重复性，并避免在UCNs生物相容性表面修饰以用于后续细胞应用时最常见的错误。

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方案

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。在高温（约 290 °C）下合成上转换纳米颗粒（UCNs）时，请采用所有适当的安全操作规程，包括使用工程控制措施（如通风橱）和个人防护装备（例如，护目镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。

1. NaYF4:Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)@NaYF4:Nd(20%) 核壳纳米晶的合成

  1. NaYF的合成4Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) 掺杂核结构纳米材料
    1. RE(CH的制备3CO2)3，NaOH，NH4甲醇储备液
      注：稀土（RE）镧系离子包括钇（Y）、镱（Yb）、铥（Tm）和钕（Nd）。
      1. 将500 mg乙酸钇(III)水合物溶于5 mL甲醇（100 mg/mL），250 mg乙酸镱(III)水合物溶于5 mL甲醇（50 mg/mL），10 mg乙酸铥(III)水合物溶于1 mL甲醇（10 mg/mL），以及10 mg乙酸钕(III)水合物溶于1 mL甲醇（10 mg/mL），置于玻璃小瓶中，使用超声清洗仪超声处理2 min。
      2. 在50 mL离心管中加入400 mg NaOH和20 mL甲醇，使用超声波清洗仪溶解，配制NaOH储备液（20 mg/mL）。
      3. 将600 mg NH4在50 mL离心管中加入30 mL甲醇，使用超声波清洗仪处理，以制备NH4F 储存液（20 mg/mL）。
        注意：将镧系配合物的储备液、NaOH 和 NH4将F置于玻璃小瓶中，用封口膜密封，于约4°C冰箱中保存备用。制备好的甲醇储备溶液每两周更换一次。
    2. NaYF的制备4Yb/Tm/Nd 核纳米结构
      1. 将3 mL油酸和7 mL 1-十八碳烯移入50 mL三颈烧瓶中。
      2. 将1.089 mL的Y(CH3CO2)3 储备液，0.608 mL 的 Yb(CH3CO2)3 储备液，83.6 µL 的 Tm(CH3CO2)3 储备液，以及 128.5 µL 的 Nd(CH3CO2)3 将储备液加入烧瓶中。
      3. 将一支温度计（量程 0 - 360 °C）安装于烧瓶中，使其尖端接触溶液。将烧瓶置于盛有苯甲基硅油的玻璃容器中。
      4. 将溶液用加热板加热至100 °C，以蒸发甲醇。将烧瓶连接至带有双真空/气体歧管的施伦克线，除去残留的甲醇，并在搅拌条件下使反应混合物保持真空状态2–3分钟。
      5. 将温度升至150 °C，并在此温度下保持60分钟。合成过程中维持搅拌速度为700 rpm。
        注意：设置中等搅拌速度，以避免溶液飞溅。
      6. 停止加热板，将烧瓶置于室温环境中，使溶液缓慢冷却。
        注意：此处可暂停本实验方案。
      7. 将 2 mL NaOH-甲醇储备溶液与 2.965 mL NH4将F-甲醇储备液加入15 mL离心管中。盖紧管盖，用力涡旋振荡5秒以混匀溶液。
      8. 加入 NaOH-NH₄Cl 缓冲液4在5分钟内用玻璃移液管将F混合物缓慢加入烧瓶中。
      9. 将混合物的温度升至50 °C，并在此温度下保持30分钟。
        注意：温度不得超过 50 °C，因为高温会促进晶体成核与生长。
      10. 升高温度（约100 °C）以蒸发除去甲醇，将烧瓶连接至带有双真空/气体歧管的施伦克线（Schlenk line），去除残留的甲醇，并将反应混合物在真空下保持2 - 3分钟。
      11. 转换旋塞的位置，使烧瓶中充满氮气。
      12. 将温度以约 5 °C/min 的加热速率升至 290 °C。在 290 °C 下保持反应混合物反应 1.5 h。
      13. 停止加热板，取下烧瓶，使反应混合物在室温下边搅拌边缓慢冷却。
        警告：请注意高温加热板的安全>400 °C）以避免皮肤接触时造成严重灼伤。
      14. 将烧瓶中的混合物转移至50 mL离心管中。用30 mL乙醇冲洗烧瓶，并将洗涤液转移至同一离心管中。
      15. 在室温下以 4,000 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
      16. 向离心管中加入10 mL己烷，通过超声处理（60 kHz，240 W）重新分散产物，持续2分钟。
      17. 向离心管中加入30 mL乙醇，在4,000 × g离心8分钟，然后弃去上清液。
      18. 用5 mL正己烷重新分散离心管底部的固体产物。将溶液于约4 °C冰箱中保存，用于下一步实验。
        注意：通过使用808 nm激光器（2 W）照射溶液，测试核-壳结构上转换纳米颗粒的上转换发光性能。
  2. NaYF的制备4Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)@NaYF4:Nd(20%)核-壳纳米晶体
    1. 将3 mL油酸与7 mL 1-十八碳烯混合加入50 mL三颈烧瓶中。加入1.082 mL Y(CH3CO2)3 储备液和 2.87 mL 的 Nd(CH3CO2)3 将储备液加入烧瓶中。
    2. 将步骤1.1.2.18中获得的核纳米结构（80 mg溶于5 mL己烷）加入烧瓶中，同时搅拌。
    3. 将一支温度计（量程 0 - 360 °C）插入烧瓶中，使其尖端接触混合物。将烧瓶置于盛有苯甲基硅油的玻璃容器中。
    4. 将混合物置于加热板上，于100 °C加热以蒸发甲醇和正己烷。将烧瓶连接至施伦克线（Schlenk line），通过双真空/气体歧管除去残留溶剂，并在搅拌条件下继续将反应混合物置于真空下处理2–3分钟。
    5. 将温度升至150 °C并保持60分钟。在合成过程中维持搅拌速度为700 rpm。
      注意：将搅拌速度设为中等，以避免溶液溅出。
    6. 停止加热板，取下烧瓶，使溶液在室温下缓慢冷却。
      注意：此处可暂停本实验方案。
    7. 移液2 mL NaOH-甲醇储备液和2.965 mL NH4将F-甲醇储备液加入15 mL离心管中。盖紧管盖，用力涡旋振荡5秒以混合溶液。
    8. 用玻璃移液管将混合物缓慢加入烧瓶中，持续5分钟。
    9. 将混合物的温度升至50 °C，并在50 °C下保持30分钟。
      注意：温度不得超过 50 °C，因为高温会促进晶体成核与生长。
    10. 升高温度（约100 °C）以蒸发除去甲醇，将烧瓶连接至带有双真空/气体歧管的施伦克线，去除残留的甲醇，使反应混合物在真空下保持2–3分钟。
    11. 切换旋塞位置，用氮气填充烧瓶。
    12. 将温度以约 5 °C/min 的升温速率升至 290 °C，将反应混合物在 290 °C 下保持 1.5 小时。
    13. 停止加热并移开烧瓶，使反应混合物在搅拌下于室温缓慢冷却。
      警告：请注意高温加热板的安全>400 °C）以避免皮肤接触时造成严重灼伤。
    14. 将烧瓶中的混合物转移至50 mL离心管中。用30 mL乙醇冲洗烧瓶，并将洗涤液转移至同一离心管中。
    15. 在室温下以 4,000 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
    16. 向离心管中加入10 mL己烷，通过超声处理（60 kHz，240 W）重新分散产物，持续2 min。
    17. 向管中加入30 mL乙醇。在4,000 × g下离心8分钟以沉淀产物，然后弃去上清液。
    18. 用5 mL 己烷重新分散离心管底部的固体产物。将溶液储存于约4 °C的冰箱中，直至使用。
      注意：通过使用808 nm激光（2 W）照射溶液，测试核-壳结构上转换纳米颗粒的上转换发光性能。

2. 生物相容性上转换纳米结构的合成

  1. 无配体上转换纳米粒子（UCNs）的制备
    1. 在50 mL离心管中，将30 mL乙醇与前述制备的油酸盐包覆UCNs溶液（步骤1.2.18）混合。在室温下以4,000 × g离心8分钟，弃去上清液。
    2. 在50 mL离心管中，将10 mL经HCl（0.1 M）调节至pH = 4的酸性水溶液加入沉淀中，并通过超声处理（60 kHz，240 W）30分钟使沉淀溶解。
    3. 将溶液转移至玻璃小瓶中，剧烈搅拌2小时。
    4. 用30 mL乙醚萃取水相以去除油酸，重复三次。
    5. 向合并的乙醚层中加入10 mL水，轻轻振荡。
    6. 收集合并的水相（20 mL），加入20 mL丙酮并涡旋5秒。
    7. 在35,000 × g下离心10分钟以沉淀产物，弃去上清液。将沉淀溶解于2 mL水中。
  2. 聚合物修饰UCNs（PAA-UCNs）的制备
    1. 将200 mg聚丙烯酸（PAA，Mw = 1,800）与20 mL水混合，超声处理（60 kHz，240 W）20分钟。将上述无配体UCNs加入PAA溶液中，并剧烈搅拌。
    2. 用NaOH溶液（1 M）调节pH至7.4，并在超声处理（60 kHz，240 W）条件下反应30分钟。持续搅拌，在室温下反应24小时。
    3. 在35,000 × g下离心10分钟收集沉淀。将产物用10 mL水重悬，超声处理（60 kHz，240 W）5分钟，再于35,000 × g离心10分钟。重复此步骤三次。
    4. 将产物用8 mL水超声重分散（60 kHz，240 W）5分钟。将溶液储存于约4 °C冰箱中，待用时取出。
  3. 功能化DBCO-UCNs纳米粒子的制备
    1. 将新制备的PAA@UCNs（1 mg）在35,000 × g下离心10分钟。将沉淀用1 mL无水DMF超声重悬（60 kHz，240 W）1分钟，再于35,000 × g离心10分钟。重复此步骤两次。
    2. 将沉淀溶解于玻璃小瓶中的200 µL无水DMF中。加入HOBT（12.2 mg）、EDC（14 mg）、DBCO-NH2（5 mg）和DIPEA（16 µL），磁力搅拌反应24小时。
    3. 在35,000 × g下离心10分钟收集产物，弃去上清液。将沉淀用1 mL DMSO重悬，再于35,000 × g离心10分钟。重复此步骤三次。
    4. 将产物分散于0.2 mL DMSO中，使用前储存于约4 °C冰箱中。

3. DBCO-UCNs 在调控活细胞膜通道中的生物应用

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、100单位/毫升青霉素、100 µg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293细胞，并将细胞维持在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中。在12孔板中每孔接种1×105个细胞于1 mL DMEM中，于培养箱中培养24小时。
  2. 在微量离心管A中，将质粒（pCAGGS-ChR2-Venus，1 µg）与P3000转染试剂（2 µL）混合于100 µL伊格尔最低必需培养基（MEM）中；在管B中，将转染试剂（1.5 µL）加入100 µL MEM中。
  3. 将A管和B管中的混合液在室温下孵育10分钟。
  4. 将A管和B管中的溶液与400 µL MEM混合。用1 mL无血清DMEM洗涤细胞两次。
  5. 将600 µL转染混合液加入12孔板的每孔中，在37 °C培养箱中孵育细胞4小时。移除培养基，并用1 mL DMEM洗涤两次。
  6. 移除培养基，在孔中加入含1 µL Ac4ManNAz（50 mM溶于DMSO）的1 mL DMEM，于培养箱中继续培养2天。
  7. 移除培养基，用1 mL PBS洗涤一次。在12孔板的每孔中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育至细胞脱落（约2分钟）。将细胞重新接种于共聚焦培养皿中，每孔1×105个细胞，加入1 mL DMEM过夜培养。
  8. 移除培养基，在培养皿中加入含2 µL DBCO-UCNs（50 mg/mL）的新鲜DMEM 1 mL，于37 °C孵育2小时。进行共聚焦成像时，用DMEM洗涤细胞两次，然后加入1 µL Rhod-N3（10 mM）孵育30分钟。
  9. 进行细胞内钙离子分析时，在1 mL DMEM培养基中加入1 µL Rhod-3 AM（10 mM）、10 µL丙磺舒（250 mM）和10 µL上样缓冲液（Pluronic表面活性剂多元醇，0.1% w/v）的混合物，在避光条件下孵育30分钟。
  10. 用无血清DMEM洗涤细胞，然后以0.8 W/cm2的剂量用808 nm近红外光照射20分钟（每照射5分钟间歇5分钟）。
  11. 在共聚焦显微镜上记录成像结果（激光源：561 nm激光；检测范围：610/75 nm；物镜：100倍油镜，数值孔径1.4 NA；曝光时间：100 ms）。在每孔中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育至细胞脱落（约2分钟）。将细胞重悬于1 mL PBS中，用于流式细胞术（FCM）分析（激发：561 nm，发射：582/15 nm）。

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结果

核壳结构掺杂镧系元素上转换纳米颗粒（UCNs）的示意图合成过程如图1和图2所示。分别采集了核结构及核壳结构UCNs纳米材料的透射电子显微镜（TEM）和高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像（图1）。通过在酸性溶液中去除UCNs表面疏水性的油酸，制备得到无配体UCNs，并用亲水性聚合物（PAA）进行修饰。随后，COOH封端的PAA-UCNs通过酰胺缩合反应与DBCO-NH2功能化。无配体UCNs、PAA-UCNs和DBCO-UCNs的TEM图像如图2所示。分别采集了DBCO-UCNs的动态光散射（DLS）、zeta电位结果以及上转换发光（UCL）光谱（图3）。DBCO-NH2、PAA-UCNs和DBCO-UCNs的傅里叶变换红外（FT...

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讨论

本文介绍了一种用于合成核壳结构镧系元素掺杂上转换纳米晶体（UCNs）的方法，并对其表面进行功能基团修饰以用于细胞应用。这种新型纳米材料具有优异的光学特性，可通过近红外光激发下的多光子上转换过程发射紫外光和可见光。在本实验方案中，核壳结构的UCN纳米材料（NaYF₄:Yb,Er/Tm@NaYF₄）首先通过热分解法在油酸存在下合成，随后通过配体交换或二氧化硅包覆实现水相分散及表面功能化。该方法制备的纳米颗粒具有良好的生物相容性，适用于生物成像、药物递送及光控治疗等生物医学应用。通过调控掺杂离子种类（如Yb³⁺作为敏化剂，Er³⁺或Tm³⁺作为激活剂）及壳层厚度，可优化上转换发光效率并减少表面淬灭效应。文中还详细描述了纳米颗粒的表征手段，包括透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）及上转换发光光谱分析。该合成策略具有可重复性高、粒径可控、发光性能稳定等优点，为发展基于上转换纳米材料的生物探针提供了可靠的技术路径。 关键词：上转换纳米晶体，核壳结构，镧系元素掺杂，近红外激发，多光子过程，表面修饰，生物相容性，细胞成像，NaYF₄:Yb,Er/Tm@NaYF₄4Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本工作部分得到了新加坡南洋理工大学资助项目 NTU-AIT-MUV NAM/16001、RG110/16 (S)、(RG 11/13) 和 (RG 35/15) 以及国家自然科学基金（NSFC）（编号 51628201）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-十八烯Sigma AldrichO806工业级
油酸Sigma Aldrich364525工业级
甲醇Fisher ScientificA412工业级
乙醇Fisher ScientificA405工业级
丙酮Fisher ScientificA18工业级
己烷Sigma AldrichH292工业级
乙酸铥(III)水合物 (Tm(CH3CO2)3)Sigma Aldrich36770299.9% 痕量金属基准
乙酸钕(III)水合物 (Nd(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32580599.9% 痕量金属基准
乙酸镱(III)水合物 (Yb(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32601199.9% 痕量金属基准
乙酸钇(III)水合物 (Y(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32604699.9% 痕量金属基准
氢氧化钠 (NaOH)Sigma AldrichS5881试剂级
氟化铵 (NH4F)Sigma Aldrich338869ACS 试剂
盐酸 (HCl)Fisher ScientificA144试剂级
聚丙烯酸 (PAA)Sigma Aldrich323667平均分子量 1800
1-羟基苯并三唑水合物 (HOBT)Sigma Aldrich54802ACS 试剂
1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC)Sigma AldrichE7750商用级
二苯并环辛炔-胺 (DBCO-NH2)Sigma Aldrich761540ACS 试剂
N,N-二异丙基乙胺 (DIPEA)Sigma AldrichD125806ACS 试剂
二甲基亚砜 (DMSO)Fisher ScientificBP231工业级
HEK293 细胞系ATCCCRL-1573人胚胎肾细胞
胎牛血清 (FBS)Sigma AldrichF1051ACS 试剂
青霉素-链霉素Thermo Fisher1514012210,000 U/mL
质粒 (pCAGGS-ChR2-Venus)Addgene15753以细菌琼脂穿刺形式寄送的质粒
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)Thermo Fisher11965092高糖
优化改良伊格尔培养基 (MEM)Thermo Fisher51985034低血清培养基
Lipofectamine 3000 转染试剂Thermo FisherL3000015脂质体转染
N-叠氮乙酰甘露糖胺，乙酰化 (Ac4ManNAz)Sigma AldrichA7605ACS 试剂
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)Thermo Fisher25200056酚红
Rhod-3 AM 钙离子成像试剂盒Thermo FisherR10145荧光染料
5-羧基四甲基罗丹明叠氮化物 (Rhod-N3)Sigma Aldrich760757Azide-fluor 545
共聚焦培养皿ibidi GmbH81158玻璃底，35 mm
50 ml 圆锥形离心管Greiner Bio-One227261聚丙烯
15 ml 圆锥形离心管Greiner Bio-One188271聚丙烯
1.5 ml 圆锥形微量离心管Greiner Bio-One616201聚丙烯
苯基甲基硅油Clearco Products63148-52-7低于 320 摄氏度
玻璃温度计GH ZealL0111/10范围从 -10 至 360 摄氏度
12 孔板Sigma AldrichZ707775聚苯乙烯

参考文献

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