本方案描述了在保留细胞外基质成分的同时，对人心肌组织进行完全脱细胞处理。对细胞外基质的进一步加工可制备出微颗粒及一种具有细胞保护作用的自组装水凝胶。
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摘要
摘要
无细胞的细胞外基质制备物可用于研究细胞与基质之间的相互作用，并有助于促进再生细胞治疗的应用。目前已有多种商业化的细胞外基质产品以水凝胶或膜的形式提供，但这些产品缺乏组织特异性的生物学活性。由于灌注脱细胞方法通常难以应用于人类心脏组织，我们开发了一种三步浸入式脱细胞流程。手术中获取的人心肌组织切片首先用无去垢剂的高渗裂解缓冲液处理，随后用离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）孵育，最后利用胎牛血清固有的DNase活性完成脱细胞过程。该技术可获得无细胞的心脏细胞外基质片层，其纤维组织结构和生物聚合物成分基本得以保留，并已被证明能够向心肌细胞群体及多能干细胞提供特定的微环境信号。所得的心脏细胞外基质片层可进一步加工成微粒粉末而无需额外化学修饰，或通过短期胃蛋白酶消化转化为具有保留生物活性的自组装心脏细胞外基质水凝胶。
引言
细胞外基质（ECM）不仅提供结构支持，而且对细胞和组织的生物学功能具有重要作用1。在心脏中，ECM参与调控纤维化、炎症、血管生成、心肌细胞收缩功能与存活能力以及定居祖细胞命运等病理生理反应。除了其主要成分——纤维状糖蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖之外，ECM还含有大量分泌型生长因子、细胞因子以及包含核酸和蛋白质的膜性囊泡2,3。
最近人们逐渐认识到，无细胞的细胞外基质（ECM）制剂不仅在研究细胞-基质相互作用方面具有不可估量的价值，而且在潜在的治疗性细胞应用中也具有重要意义。目前，人们已广泛认识到为治疗性细胞产品或工程化组织提供适宜微环境的重要性。已有尝试将细胞悬液或活性化合物与明确的生物聚合物水凝胶4,5,6，或与小鼠肉瘤细胞分泌的蛋白混合物（i.e., Matrigel、Geltrex）7相结合。然而，前者生物活性有限，后者在符合GMP标准的生产工艺中存在难题，且两者均缺乏心肌细胞外基质（cECM）所特有的组织特异性生物活性8,9,10,11,12,13。
通过冠状血管灌注对整个心脏进行心肌脱细胞化此前已有报道14,15虽然这在动物心脏中是可行的，但完整的人类心脏很少能够获得。因此，我们倾向于采用一种浸渍处理方法，以便于处理在手术室中获取的组织样本。我们的 "三步法" 该方案包含三个独立的孵育步骤，即裂解、溶解和DNA去除。可获得蛋白质和糖胺聚糖成分基本保留的人类心肌细胞外基质16,17这些cECM切片可实现 体外 细胞-基质相互作用的研究具有重要意义，但难以适用于潜在的人体规模治疗应用。随后，该制备工艺被进一步拓展，用于生产冻干的cECM微粒或cECM水凝胶。18.
本方案可用于处理手术样本获取的人类心肌组织，实现心肌组织的脱细胞化，同时保留心肌细胞外基质（ECM）的主要成分及其生物学活性。当实验研究需要具有组织特异性生物活性的人类心脏ECM，用于细胞-基质相互作用研究，或需要为基于细胞的心肌再生策略提供适宜环境时，推荐使用本方案。原则上，该方案也可根据需要调整为符合GMP级条件，从而使制备的cECM有望在未来治疗应用中得以使用。
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方案
该研究方案遵循《赫尔辛基宣言》中所述的伦理原则，并已获得夏里特医学院机构审查委员会和伦理委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书，同意将其心脏组织用于实验研究。
1. 人的心肌组织切片制备
- 直接从手术室获取左心室心肌组织（大小根据手术类型而定），并将其置于无菌容器中的冷磷酸盐缓冲液（PBS）中运输。
- 在无菌条件下，使用带有10号刀片的无菌手术刀去除所有脂肪组织。
- 使用手术刀将心肌组织切成约1 × 1 × 1 cm的立方体。
- 将组织块放入无菌的50 mL离心管中。
注意：如需暂停，请执行步骤1.5；否则继续进行步骤2.2。避免反复冻融，以防止蛋白质降解和组织质量下降。 - 将含有组织块的离心管在-80 °C下保存。组织可保存数月。
2. 将心肌立方体切片成薄片
- 从冷冻箱中取出装有已制备组织块的管子。
- 将样本置于冰上，运输至冷冻切片机。
- 将样品台和舱室温度设置为 -15 °C。
注意：合适的温度对于确保理想的切片质量至关重要。 - 将空的 50 mL 管和组织印模在舱室内或干冰上预冷。
- 在冰冷的印模上加入一层冷冻切片介质（约 0.5 - 1.0 mL），待其冻结至变白且呈固态。
- 再添加一层冷冻切片介质，并将心肌组织块放置于该层上。
- 确保冷冻切片介质和心肌组织完全冻结后再继续操作。
注意：若样本或冷冻切片介质未完全冻结，将影响切片效果。完全冻结的冷冻切片介质会从透明液态转变为白色、不透明的固态。从步骤 1.4 直接继续操作时，心肌组织块通常需要至少 30 分钟至 1 小时才能完全冻结。组织冻结后，用镊子触碰或操作时不应发生形变。 - 将带有冻结心肌组织的印模插入持样器中，并拧紧所有螺丝。
- 修切组织表面，直至获得平整的切片面。
- 将切片厚度设置为 300 µm。
- 使用自动切片模式对冻结的心肌组织进行切片，以确保切片厚度均匀。每个组织块大约可切出 30 - 40 片。
- 每切完一片后，将其松散地放入预冷的 50 mL 管中。
注意：切勿按压切片或紧密堆积。一个 50 mL 管中大约可容纳 40 片。 - 盖紧装满切片的管子，并置于冰上。
注意：如需暂停，请转至步骤 2.14；否则继续进行步骤 3.2。 - 将心肌切片在 -80 °C 条件下保存。切片可在此条件下储存数月。
3. 人心肌切片的脱细胞化
- 从-80 °C冰箱中取出所需数量的含有心肌组织切片的50 mL离心管，并置于冰上运输。
- 将步骤3.1中所有50 mL离心管的冷冻切片转移至一个无菌烧杯中。每支50 mL离心管约加入40片切片。烧杯的容积应为50 mL离心管的三倍；例如, 脱细胞处理一个50 mL离心管时，使用一个150 mL烧杯。
- 加入50 mL裂解液（10 mM Tris，0.1% w/v EDTA，pH 7.4，溶于H₂O）2O）每管50 mL含心肌切片。
- 在室温下，将心肌切片置于无菌烧杯中，以100 - 150 rpm持续振荡2小时。
- 用粗滤器将液体和组织切片一起过滤。用钝头镊子将组织切片转移至新的无菌烧杯中。每初始50 mL心肌切片管中加入50 mL PBS配制的0.5% SDS例如， 当对两管50 mL心肌切片进行脱细胞处理时，使用100 mL SDS溶液。
- 室温下以 100 - 150 rpm 持续振荡 6 小时。
- 用粗孔滤器将液体连同组织切片一起过滤。用钝头镊子将组织切片转移至新的无菌烧杯中，加入50 mL PBS，于150 rpm振荡洗涤10分钟，重复洗涤3次。随后，在含1%青霉素/链霉素和1%制霉菌素的PBS（PBS-P/S-N）中，于4 °C、100–150 rpm条件下振荡过夜洗涤。
注意：彻底清洗对于完全去除残留的SDS至关重要。当细胞外基质（ECM）与细胞联合使用时，残留的SDS具有毒性。 - 移除洗涤液，向每管初始体积为50 mL的心肌片脱细胞切片中加入25 mL预热的含1%青霉素/链霉素和1%制霉菌素的FBS（37 °C）。
- 37 °C 下孵育 3 小时。此步骤中，由于 FBS 具有内在的 DNase 活性，基质中任何残留的 DNA 均被去除。
- 将切片转移至新的无菌烧杯中，加入50 mL PBS，于150 rpm振荡洗涤10分钟，重复洗涤3次。
注意：ECM 切片可在 PBS-P/S-N 中于 4 °C 保存数天。然而，建议立即进行后续操作。
4. 将脱细胞cECM处理成粉末
- 将 ECM 切片松散地放入新的无菌 6 孔板中。在 -80 °C 下冷冻 ECM，并在冷冻干燥机中冷冻干燥 2 天。
注意：每个孔中可放置多个切片。将切片排列以完全覆盖孔的表面。切片之间的重叠不会影响后续的粉碎效果。 - 为粉碎 ECM 切片，请使用含有 1.4 mm 陶瓷珠的专用研磨管（参见 材料表）。使用无菌钝头镊子将冻干的 ECM 松散地装入研磨管中。为获得最佳效果，建议 ECM 总重量在 10 - 20 mg 之间。
注意：若 ECM 在研磨管中装填过紧，将对粉碎过程产生不利影响。 - 在液氮中快速冷冻研磨管。
警告：液氮温度极低，操作时需佩戴适当的个人防护装备。 - 将冷冻的研磨管插入研磨机中，粉碎 ECM。
- 设定研磨时间为 30 秒，速度调至最高，然后启动设备。
- 研磨完成后，取出研磨管，并再次在液氮中快速冷冻。
- 重复上述步骤五次。
- 通过向每根研磨管中加入 1 mL ddH2O 并振荡或涡旋以充分溶解，将微粒从管中洗出。将不均一的溶液经 200 µm 滤网过滤至 50 mL 离心管中。
- 将离心管在 -80 °C 或液氮中冷冻。
- 将离心管的标准盖替换为带有 0.22 µm 滤膜的盖子。该滤膜盖可防止粉末逸出，同时允许空气流通以促进水分蒸发。
- 将离心管放入冷冻干燥机中再次进行冷冻干燥，以去除步骤 4.5 中引入的水分
注意：此步骤的冷冻干燥过程可能需要长达 3 天。 - 将所得粉末储存于 -80 °C，直至后续处理，或继续进行步骤 5.1。
5. 基于酶的cECM微颗粒均质化
- 将猪胃蛋白酶溶解于 0.01 M HCl（pH 2.0）中，使其浓度达到 1 mg/mL。置于室温下旋转摇床上，直至完全溶解。
- 将冻干的人体 ECM 粉末（第 4.8 步）溶解于上述胃蛋白酶溶液中，最终浓度为 10 mg/mL。通过移液充分混匀。总体积取决于所需 ECM 溶液的量。例如，将 10 mg ECM 粉末溶解于 1 mL 胃蛋白酶溶液中。
注意：可通过轻柔涡旋振荡（1,000 – 1,500 RPM）辅助颗粒溶解。残留的微粒团块将对消化过程产生不利影响。 - 将溶液转移至 2 mL 离心管中，每管装入 1 mL。
- 将离心管放入摇床中，在 27 °C、1,200 rpm 条件下振荡 48 小时。
- 从摇床中取出离心管，置于冰上或预冷的管架中。
- 在预冷的离心管中，加入相当于 ECM 溶液体积 1/9 的冷 10× PBS（pH 7.4）和相当于 ECM 溶液体积 1/10 的冷 0.1 M NaOH，并置于冰上。该混合液将中和消化后的 ECM 溶液，并不可逆地灭活胃蛋白酶。
- 将消化后的 ECM 溶液加入中和混合液中，通过移液或涡旋充分混匀。
- 用 1× PBS（pH 7.4）将 ECM 溶液调节至所需浓度。可用 pH 试纸检测溶液的 pH 值。
注意：以 10 mL 消化后的 ECM 溶液为例进行计算：
向 10 mL HCl（pH 2.0）中加入 10 mg 猪胃蛋白酶。
向胃蛋白酶溶液中加入 100 mg ECM 粉末。
注意：以中和 10 mL 消化后的 ECM 溶液并将其浓度调整为 8 mg/mL 为例进行计算：
VolFinal = cstart × Volstart / cFinal = 10 mg/mL × 10 mL / 8 mg/mL = 12.5 mL
Vol10xPBS = Volstart / 9 = 10 mL 的 1/9 = 1.11 mL 10× PBS
VolNaOH = Volstart / 10 = 10 mL 的 1/10 = 1 mL
Vol1xPBS = VolFinal - Volstart - Vol10xPBS - VolNaOH = 12.5 mL - 10 mL - 1.11 mL - 1 mL = 0.39 mL
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结果
本文所介绍的人类心肌脱细胞三步法可近乎完全去除细胞成分，同时保留关键的细胞外基质（ECM）组分及ECM的纤维结构。脱细胞后，组织颜色的变化直观地显示了细胞的大体清除（图1A）。苏木精-伊红（H&E）和马松三色染色的组织学分析显示，无完整残留细胞存在（图1B）。对各ECM组分的定量检测表明，与仅使用SDS脱细胞的方法相比，该方法可更彻底地去除DNA，并更好地保留总胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖（图2A）。cECM生物学活性的功能性证据如图2B所示。在此，采用RT-PCR检测小鼠胚胎干细胞（ESC）在自发分化过程中，接触cECM后对心肌细胞结构蛋白（Myh6、Tnnt2）、早期（Mef2c、Nkx2.5）和晚期（Gata4）心肌源性转录因子，以及内皮细胞表面标志基因（vWF、VE-钙黏蛋白）表达的影响。与未包被培养皿表面及Matrig...
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讨论
在制备人心肌细胞外基质（ECM）时，目标包括：去除具有免疫原性的细胞成分，保持ECM的完整性与生物活性，确保终产品的无菌性与无毒性，符合GMP工艺要求，以及在操作性能上适用于特定应用。通过将三步脱细胞方案与后续加工为微颗粒或自组装水凝胶相结合，可获得具有特异性生物活性、易于操作且具备多种应用潜力的人心肌ECM材料 体外 和 体内，这与已在多种动物物种的细胞外基质产品中观察到的现象相似11,13,20,21.
在心肌组织的初始处理过程中，必须将心肌切成厚度一致的切片，因为试剂浓度和处理时间均是针对300 µm厚的切片进行优化的。较厚的切片将无法完全脱细胞，而较薄的切片则会导致细胞外基质（ECM）成分发生非预期降解，从而丧失生物活性。这一点在SDS处理过程中尤为重要，因为SDS的毒性可能对ECM特...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
该研究方案符合《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则。患者已知情同意将其组织用于科研目的，且组织采集过程已获得柏林夏里特大学医学中心机构审查委员会及伦理委员会批准（EA4/028/12）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 平衡 | DR Precisa，迪蒂孔，瑞士 | Precisa XR 205SM | |
| 10号刀片，3号手术刀柄 | InstrumenteNRW，德国艾尔夫特施塔特 | SK-10-004 | |
| 细胞培养板（6孔） | Greiner，德国弗里克豪森 | 657160 | |
| 冷冻切片机 CM | Leica，德国韦茨拉尔 | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | 8043.3 | |
| Eppendorf离心管（1.5 或 2 ml） | Greiner，德国弗里克豪森 | 616201, 623201 | |
| Falcon 15 ml，50 ml | Greiner，德国弗里克豪森 | 188271, 227270 | |
| 胎牛血清（FBS） | Biochrome，德国柏林 | S 0115 | |
| 冷冻干燥系统 | Labconco，堪萨斯城，美国 | 7670520 | |
| -80℃冰箱°C) | Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | Forma 900 系列 | |
| HCl | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | 281.1 | |
| 切片机刀片 型号819 | Leica，德国韦茨拉尔 | 14035838925 | |
| Minilys 匀浆器 | PEQLAB Biotechnologie GmbH，德国埃尔兰根 | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | K021.1 | |
| 制霉菌素 | PAN Biotech，德国艾登巴赫 | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 14190-094 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies，德国达姆施塔特 | 15140122 | |
| 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴 | P6887-1G | |
| Precellys 陶瓷研磨套件 1.4 mm | Peqlab Biotechnologie，德国埃尔兰根 | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 平板摇床 | 德国施瓦布阿赫，海道尔夫 | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | CN30.3 | |
| 体视显微镜 | 徕卡，德国韦茨拉尔 | M125 | |
| Steriflip-GP，0.22 µm | 默克密理博，德国达姆施塔特 | SCGP00525 | |
| 斯图尔特模拟摇床 &和滚轴混合器 | Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴 | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T. 包埋剂 | Hartenstein，德国维尔茨堡 | TTEK | |
| 输血器 200µm | Sarstedt, Nü德国 mbrecht | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | 5429.3 | |
| vedena 外科手术刀柄，型号 Fig. 3，标准型，125 mm | 医学亮点，德国罗尔多夫 | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | 美国纽约科学产业公司 | SI-0256 |
参考文献
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039(2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165(2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844(2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
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