本方案描述了在保留细胞外基质成分的同时，对人心肌组织进行完全脱细胞处理。对细胞外基质的进一步加工可制备出微颗粒及一种具有细胞保护作用的自组装水凝胶。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
无细胞的细胞外基质制备物可用于研究细胞与基质之间的相互作用，并有助于促进再生细胞治疗的应用。目前已有多种商业化的细胞外基质产品以水凝胶或膜的形式提供，但这些产品缺乏组织特异性的生物学活性。由于灌注脱细胞方法通常难以应用于人类心脏组织，我们开发了一种三步浸入式脱细胞流程。手术中获取的人心肌组织切片首先用无去垢剂的高渗裂解缓冲液处理，随后用离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）孵育，最后利用胎牛血清固有的DNase活性完成脱细胞过程。该技术可获得无细胞的心脏细胞外基质片层，其纤维组织结构和生物聚合物成分基本得以保留，并已被证明能够向心肌细胞群体及多能干细胞提供特定的微环境信号。所得的心脏细胞外基质片层可进一步加工成微粒粉末而无需额外化学修饰，或通过短期胃蛋白酶消化转化为具有保留生物活性的自组装心脏细胞外基质水凝胶。
引言
细胞外基质（ECM）不仅提供结构支持，而且对细胞和组织的生物学功能具有重要作用1。在心脏中，ECM参与调控纤维化、炎症、血管生成、心肌细胞收缩功能与存活能力以及定居祖细胞命运等病理生理反应。除了其主要成分——纤维状糖蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖之外，ECM还含有大量分泌型生长因子、细胞因子以及包含核酸和蛋白质的膜性囊泡2,3。
最近人们逐渐认识到，无细胞的细胞外基质（ECM）制剂不仅在研究细胞-基质相互作用方面具有不可估量的价值，而且在潜在的治疗性细胞应用中也具有重要意义。目前，人们已广泛认识到为治疗性细胞产品或工程化组织提供适宜微环境的重要性。已有尝试将细胞悬液或活性化合物与明确的生物聚合物水凝胶4,5,6，或与小鼠肉瘤细胞分泌的蛋白混合物（i.e., Matrigel、Geltrex）7相结合。然而，前者生物活性有限，后者在符合GMP标准的生产工艺中存在难题，且两者均缺乏心肌细胞外基质（cECM）所特有的组织特异性生物活性8
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
该研究方案遵循《赫尔辛基宣言》中所述的伦理原则，并已获得夏里特医学院机构审查委员会和伦理委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书，同意将其心脏组织用于实验研究。
1. 人的心肌组织切片制备
- 直接从手术室获取左心室心肌组织（大小根据手术类型而定），并将其置于无菌容器中的冷磷酸盐缓冲液（PBS）中运输。
- 在无菌条件下，使用带有10号刀片的无菌手术刀去除所有脂肪组织。
- 使用手术刀将心肌组织切成约1 × 1 × 1 cm的立方体。
- 将组织块放入无菌的50 mL离心管中。
注意：如需暂停，请执行步骤1.5；否则继续进行步骤2.2。避免反复冻融，以防止蛋白质降解和组织质量下降。 - 将含有组织块的离心管在-80 °C下保存。组织可保存数月。
2. 将心肌立方体切片成薄片
- 从冷冻箱中取出装有已制备组织块的管子。
- 将样本置于冰上，运输至冷冻切片机。
- 将样品台和舱室温度设置为 -15 °C。
注意：合适的温度对于确保理想的切片质量至关重要。 - 将空的 50 mL 管和组织印模在舱室内或干冰上预冷。
- 在冰冷的印模上加入一层冷冻切片介质（约 0.5 - 1.0 mL），待其冻结至变白且呈固态。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本文所介绍的人类心肌脱细胞三步法可近乎完全去除细胞成分，同时保留关键的细胞外基质（ECM）组分及ECM的纤维结构。脱细胞后，组织颜色的变化直观地显示了细胞的大体清除（图1A）。苏木精-伊红（H&E）和马松三色染色的组织学分析显示，无完整残留细胞存在（图1B）。对各ECM组分的定量检测表明，与仅使用SDS脱细胞的方法相比，该方法可更彻底地去除DNA，并更好地保留总胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖（图2A）。cECM生物学活性的功能性证据如图2B所示。在此，采用RT-PCR检测小鼠胚胎干细胞（ESC）在自发分化过程中，接触cECM后对心肌细胞结构蛋白（Myh6、Tnnt2）、早期（Mef2c、Nkx2.5）和晚期（Gata4）心肌源性转录因子，以及内皮细胞表面标志基因（vWF、VE-钙黏蛋白）表达的影响。与未包被培养皿表面及Matrig.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在制备人心肌细胞外基质（ECM）时，目标包括：去除具有免疫原性的细胞成分，保持ECM的完整性与生物活性，确保终产品的无菌性与无毒性，符合GMP工艺要求，以及在操作性能上适用于特定应用。通过将三步脱细胞方案与后续加工为微颗粒或自组装水凝胶相结合，可获得具有特异性生物活性、易于操作且具备多种应用潜力的人心肌ECM材料 体外 和 体内，这与已在多种动物物种的细胞外基质产品中观察到的现象相似11,13,20,21.
在心肌组织的初始处理过程中，必须将心肌切成厚度一致的切片，因为试剂浓度和处理时间均是针对300 µm厚的切片进行优化的。较厚的切片将无法完全脱细胞，而较薄的切片则会导致细胞外基质（ECM）成分发生非预期降解，从而丧失生物活性。这一点在SDS处理过程中尤为重要，因为SDS的毒性可能对ECM特.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
该研究方案符合《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则。患者已知情同意将其组织用于科研目的，且组织采集过程已获得柏林夏里特大学医学中心机构审查委员会及伦理委员会批准（EA4/028/12）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 平衡 | DR Precisa，迪蒂孔，瑞士 | Precisa XR 205SM | |
| 10号刀片，3号手术刀柄 | InstrumenteNRW，德国艾尔夫特施塔特 | SK-10-004 | |
| 细胞培养板（6孔） | Greiner，德国弗里克豪森 | 657160 | |
| 冷冻切片机 CM | Leica，德国韦茨拉尔 | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | 8043.3 | |
| Eppendorf离心管（1.5 或 2 ml） | Greiner，德国弗里克豪森 | 616201, 623201 | |
| Falcon 15 ml，50 ml | Greiner，德国弗里克豪森 | 188271, 227270 | |
| 胎牛血清（FBS） | Biochrome，德国柏林 | S 0115 | |
| 冷冻干燥系统 | Labconco，堪萨斯城，美国 | 7670520 | |
| -80℃冰箱°C) | Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | Forma 900 系列 | |
| HCl | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | 281.1 | |
| 切片机刀片 型号819 | Leica，德国韦茨拉尔 | 14035838925 | |
| Minilys 匀浆器 | PEQLAB Biotechnologie GmbH，德国埃尔兰根 | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | K021.1 | |
| 制霉菌素 | PAN Biotech，德国艾登巴赫 | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 14190-094 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies，德国达姆施塔特 | 15140122 | |
| 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴 | P6887-1G | |
| Precellys 陶瓷研磨套件 1.4 mm | Peqlab Biotechnologie，德国埃尔兰根 | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 平板摇床 | 德国施瓦布阿赫，海道尔夫 | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | CN30.3 | |
| 体视显微镜 | 徕卡，德国韦茨拉尔 | M125 | |
| Steriflip-GP，0.22 µm | 默克密理博，德国达姆施塔特 | SCGP00525 | |
| 斯图尔特模拟摇床 &和滚轴混合器 | Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴 | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T. 包埋剂 | Hartenstein，德国维尔茨堡 | TTEK | |
| 输血器 200µm | Sarstedt, Nü德国 mbrecht | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | 5429.3 | |
| vedena 外科手术刀柄，型号 Fig. 3，标准型，125 mm | 医学亮点，德国罗尔多夫 | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | 美国纽约科学产业公司 | SI-0256 |
参考文献
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse En....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
