人心脏组织对细胞外基质自组装水凝胶的处理体外和体内应用

摘要

该协议描述了人类心肌的完整细胞, 同时保留了其胞外基质成分。细胞外基质的进一步处理导致微粒和细胞自组装水凝胶的生产。

摘要

脱细胞细胞外基质制剂对研究细胞基质相互作用和促进再生细胞治疗的应用非常有用。一些商业胞外基质产品可作为水凝胶或膜, 但这些不具有组织特异性的生物活性。由于灌注细胞通常是不可能与人类心脏组织, 我们开发了3步浸泡细胞过程。在手术过程中获得的人心肌切片首先采用无洗涤剂高裂解缓冲液, 然后用离子洗涤剂、十二烷基硫酸钠进行孵化, 并利用其内在 dnasei 活性来完成。胎儿牛血清。这项技术的结果是在心脏细胞外基质的无细胞板, 主要保存纤维组织结构和生物成分, 这表明, 提供了具体的环境线索, 以心电池群体和多能干细胞细胞.心脏胞外基质片可进一步加工成微粒粉, 无需进一步化学修饰, 或者, 通过短期胃蛋白酶消化, 保存成自组装的心脏细胞外基质水凝胶。活性.

引言

细胞外基质 (ECM) 不仅提供结构支持, 而且对生物细胞和组织功能¹也很重要。在心脏, ECM 参与调节病理反应, 如纤维化, 炎症, 血管生成, 心肌收缩功能和生存能力, 和居民祖细胞的命运。除了其主要成分-纤维糖蛋白, 多糖, 和蛋白-它包含了一系列分泌生长因子, 细胞因子, 和膜囊泡含有核酸和蛋白质^2,3。

最近已经清楚的是, 脱细胞 ECM 制剂不仅对研究细胞基质相互作用, 而且对潜在的治疗细胞基础的应用是非常宝贵的。为治疗性细胞产品或工程组织提供适当环境的重要性现已得到广泛承认。试图结合细胞悬浮液或活性化合物与定义的 biopolymeric 凝胶^4,5,6或与小鼠肉瘤细胞分泌的蛋白鸡尾酒 (即,基质, Geltrex)⁷. 然而, 前者的生物活性有限, 后者在 GMP 级别的过程中存在问题, 且缺乏心脏 ECM (cECM)^{8、9、10、}的组织特异性生物活性.^11,12,13。

心肌的细胞先前是通过冠状动脉血管灌注的整个心脏,^14,15。虽然这是可能的在动物的心脏, 完整的人的心脏是很少可利用的。因此, 一个浸泡过程, 允许处理在手术室获得的组织样本受到青睐。我们的 "3 步" 协议包含3单独的孵化步骤, 即溶解, 增溶, 和 DNA 去除。它产生人心肌 ECM 与主要保存蛋白质和多糖构成^16,17。这些 cECM 切片允许体外研究细胞-基质相互作用, 但不适合潜在的人类规模的治疗应用。然后, 制造过程被扩展到生产冻干 cECM 微粒或 cECM 水凝胶¹⁸。

该协议允许从外科标本中获得的人心肌细胞, 保留心肌细胞外基质 (ECM) 的主要成分及其生物活性。在细胞基质相互作用的实验研究中, 或在细胞基心肌再生方法需要合适的环境时, 推荐使用具有组织特异性生物活性的人心脏 ECM。原则上, 也可以将此协议与 GMP 级别的条件相适应, 以便在将来的治疗应用中使用经过处理的 cECM 是可行的。

方案

《研究议定书》符合《赫尔辛基宣言》所述的道德原则, 并得到了 charit 医科大学机构审查委员会和道德问题小组的批准。所有患者都提供了书面的、知情的同意, 以供实验研究使用心脏组织。

1. 人心肌切片的制备

1. 获得左心室心肌 (大小取决于手术类型) 直接从手术室和运输在冷 PBS 在一个无菌容器。
2. 在无菌条件下, 用无菌手术刀将所有脂肪组织取出10刀片。
3. 用手术刀切割大约 1 x 1 x 1 cm 的立方体的心肌。
4. 将立方体置于无菌50毫升管中。
   注意: 要暂停, 请执行步骤 1.5, 否则继续步骤2.2。避免重复的冻融循环, 以防止蛋白质退化和组织质量下降。
5. 在-80 ° c 下储存含有立方体的管子。这些组织可以储存几个月。

2. 将心肌立方体切片

1. 把装有准备好的立方体的管子从冰箱里拿出来。
2. 在冰上运送到低温。
3. 将物体和燃烧室温度设置为-15 ° c。
   注意: 正确的温度是保证完美切片的关键。
4. 冷却空50毫升管和邮票在房间里或在干冰。
5. 在冰冷的邮票上加入一层 (约 0.5-1.0 毫升) 的 cryosection 介质, 并让它冻结, 直到它是白色和固体。
6. 加入第二层 cryosection 培养基, 并将心肌立方体放置在这层上。
7. 请确保 cryosection 培养基和心肌完全冻结, 然后再继续。
   注意: 当样品和 cryosection 培养基不结冰时, 切片将会受损。完全冷冻的 cryosection 介质由液体和透明变为固态、白色和非透明。如果立即从步骤1.4 继续, 心肌立方需要至少30分钟至1小时才能完全冻结。当组织被冻结, 它不应该变形, 当触摸/处理与镊子。
8. 将冰冻心肌的印记插入支架, 拧紧所有螺钉。
9. 修剪组织的表面直到获得均匀的切片表面。
10. 将切片厚度设置为300µm。
11. 冰冻心肌切片自动切片。这保证了一致的切口部分。大约 30-40 部分可以从一个立方体切片。
12. 在冷50毫升管中松散切片后放置每片。
    注意: 请勿按下切片或紧密包装。大约40片可以装在一个管。
13. 关闭填充管和放置在冰上。
    注意: 要暂停使用步骤 2.14, 否则请继续执行步骤3.2。
14. 在-80 ° c 贮存心肌切片。切片可以存储几个月。

3. 人心肌切片的细胞

1. 采取必要数量的50毫升管包含心肌部分出-80 ° c 冰箱和运输冰。
2. 将所有50毫升管子的冰冻切片从步骤3.1 转移到一个无菌烧杯中。大约40片被添加到烧杯每50毫升管。烧杯应为50毫升管体积的三倍;例如,对于一个50毫升管的细胞使用150毫升的烧杯。
3. 添加50毫升溶解液 (10 毫米三, 0.1% 瓦特/五 EDTA, pH 7.4 在 H₂O) 每50毫升的心肌切片管。
4. 在室温下连续 100-150 rpm, 在无菌烧杯中摇动心肌切片, 持续2小时。
5. 用粗糙的过滤器将液体与组织切片进行应变。用钝镊子将组织切片转移到新的无菌烧杯中。增加50毫升的 0.5% sds 在 PBS 每初始50毫升心肌切片管 (例如,使用100毫升的 sds 溶液时, 两个50毫升的心肌部分的管正在细胞)。
6. 在室温下连续摇动6小时, 在 100-150 rpm。
7. 用粗糙的过滤器将液体与组织切片进行应变。用钝镊子将组织切片转移到一个新的无菌烧杯中, 用50毫升 PBS 清洗3次, 每次10分钟, 同时晃动 150 rpm。接下来, 在 pbs 中用1% 青霉素/链霉素和1% 制 (pbs-P/S-N) 在 100-150 rpm 和4° c 的同时进行夜间清洗。
   注: 彻底清洗是至关重要的完全清除任何残留 SDS。当 ECM 与细胞结合使用时, SDS 的残留痕迹是有毒的。
8. 取出洗涤液, 并添加25毫升预热 FBS (37 ° c) 与1% 青霉素/链霉素和1% 制的细胞切片每初始50毫升管心肌切片。
9. 在37° c 孵育3小时。在这一步, 任何剩余的 DNA 从母体中移除, 由于 FBS 的内在 dnasei 活动。
10. 将切片转移到新的无菌烧杯中, 用50毫升 PBS 清洗3次, 每次10分钟, 同时晃动 150 rpm。
    注: ECM 切片可在4° c 下贮存数天。但是, 建议立即进行。

4. 加工细胞 cECM 粉末

1. 将 ECM 切片松散地放在一个新的无菌6井板上。在-80 ° c 和 lyophilize 中冻结 ECM, 在冻中2天。
   注意: 每个切片可以放置一个以上。安排切片, 完全覆盖井面。重叠的切片不会影响随后的粉碎成功。
2. 对于 ECM 切片的粉碎, 请使用特定的铣管 (参见材料表), 其中包含 1.4 mm 陶瓷珠。用无菌钝镊子将管子松散地用冻干的 ECM 填满。为了获得最佳结果, 建议在 10-20 毫克之间进行 ECM 的总重量。
   注: 如果 ECM 在铣管中太紧, 粉碎过程将受到负面影响。
3. 用液氮把管子冻住。
   警告:液氮的温度极低, 佩戴适当的个人防护。
4. 将冷冻管插入铣床并粉碎 ECM。
   1. 设置三十年代和最大速度的持续时间并启动设备。
   2. 完成后, 取出试管, 再在液氮中再次凝固。
   3. 重复五次。
5. 通过添加1毫升 ddH₂O 每管和震动或漩涡, 为完整的磷清洗微粒从管。通过一个200µm 网格过滤到50毫升管的异构解决方案。
6. 将管在-80 ° c 或液氮中冷冻。
7. 用0.22 µm 过滤器更换管的标准盖子。这种过滤器盖子防止粉末流出管, 但允许空气循环为水蒸发。
8. 插入冻和 lyophilize 中的管子, 将水从步骤中取出 (步骤 4.5)
   注: 冻干在这一步可能需要长达3天。
9. 将粉末贮存在-80 ° c, 直至进一步处理或继续执行步骤5.1。

5. 基于酶的 cECM 微粒子的均匀化

1. 将猪胃蛋白酶溶于 0.01M HCl (pH 值 2.0), 浓缩1毫克/毫升。在旋转振动筛上放置室温, 直到完全溶解。
2. 溶解在胃蛋白酶溶液中的冻干人 ECM 粉末 (步骤 4.8), 最终浓度为10毫克/毫升。通过移彻底混合。总容量取决于所需的 ECM 解决方案的数量。例如, 在1毫升胃蛋白酶溶液中溶解10毫克 ECM 粉末。
   注: 溶解颗粒可通过温和的涡流 (1000-1500 RPM) 来支持。剩余的微粒会对消化产生负面影响。
3. 将溶液转移至2毫升管, 每管1毫升。
4. 把管子放在一个48小时27° c 和 1200 rpm 的管子振动器中。
5. 把管子从振动筛中取出, 放在冰上或预冷管架上。
6. 将冷 10x PBS (pH 7.4) 的 ecm 溶液体积的1/9 与1/10 的冷管中的冷0.1M 氢氧化钠的 ecm 溶液体积和冰的位置混合。这种混合物将抵消消化的 ECM 溶液和不可逆转地钝化胃蛋白酶。
7. 将 ECM 解决方案添加到中和混合物中, 并通过移或涡流进行彻底混合。
8. 使用 1x PBS (pH 值 7.4) 将 ECM 设置为所需浓度。溶液的 ph 值可以用 ph 值纸检查。
   注:10 毫升消化 ECM 解决方案的示例计算:
   添加10毫克猪胃蛋白酶到10毫升 HCl (pH 2.0)。
   加入100毫克 ECM 粉末到胃蛋白酶溶液。
   注: 中和10毫升消化 ECM 溶液的实例计算, 并将浓度设置为8毫克/毫升:
   _最终= c_开始x 卷_开始/c_最终= 10 毫克/毫升 x 10 毫升/8 毫克/毫升 = 12.5 毫升
   _10xPBS = 卷_开始/9 = 1/9 从10毫升 = 1.11 毫升 10x PBS
   _氢氧化钠= 卷_开始/10 = 1/10 从10毫升 = 1 毫升
   卷_1xPBS = 卷_最终-卷_开始-卷_10xPBS卷_氢氧化钠= 12.5 毫升-10 毫升-11 毫升-1 毫升 = 0.39 毫升

结果

3步的人心肌细胞的协议, 导致了近完全去除细胞材料, 同时保留了关键的 ecm 成分和纤维结构的 ecm。细胞后, 通过颜色的变化 (图 1A), 明显去除组织中的细胞。组织学分析与 H & E 和马尾松三污渍显示完全没有剩余完整的细胞 (图 1B)。单个 ECM 成分的定量分析显示, 单独的 DNA 清除和更好地保存总胶原蛋白、弹力蛋白和多糖, 与 SDS (图 2A) 相比更完整。cECM 生物活性的功能性证据如图 2B所示。在这里, rt-pcr 用于定量表达结构心肌蛋白 (Myh6, Tnnt2), 早期 (Mef2c, Nkx2.5) 和晚期 (Gata4) 心肌转录因子, 和内皮细胞表面标记基因 (冯 Willibrand 因子 (vWF),VE-钙黏蛋白) 在小鼠 ESC 发生自发分化。与非涂层培养皿表面和基质-E...

讨论

在制备人体心肌 ECM 时, 其目的是实现以下目标: 去除相关的免疫细胞材料, 保护 ecm 的完整性和生物活性, 不育, 最终产品的非毒性, GMP-过程相容性, 以及产品在处理方面的适用性。将我们的3步细胞协议与进一步加工成微粒或自组装水凝胶结合, 获得了具有特定生物活性的人体心脏 ECM 材料, 易于处理, 并具有多个应用程序在体外和在体内, 类似于从几个动物种类中显示的 ECM 产品^{11、13、20、21}。

在心肌组织的初始处理过程中, 由于300µm 切片的复合浓度和处理时间的滴定, 对相同厚度的断面心肌切片很重要。较厚的切片将是不完全细胞和薄切片将遭受不必要的故障 ECM 组件的生物活性损失。这对于 SDS 的治疗尤为重要, 因为毒性会对 ECM 的性质和细胞分析产生负面影响

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
天平	DR Precisa，瑞士 Dietikon Precisa	XR 205SM
刀片 Nr.10 Skalpell Nr.3	仪器NRW，德国埃尔夫特施塔特	SK-10-004
细胞培养板（6 孔）	Greiner，Frickenhausen，德国	657160
低温恒温器 CM	Leica，Wetzlar，德国	3050S
EDTA	Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国	8043.3
Eppendorf 反应管（1.5 或 2 ml）	Greiner，Frickenhausen，德国	616201,623201
Falcon 15ml，50ml	Greiner，Frickenhausen，德国	188271,227270
胎牛血清 （FBS）	生物色素，德国柏林	S 0115
冻干系统	Labconco，堪萨斯城，美国	7670520
冷冻室 （-80°C;C）	Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	Forma 900 系列
HCl	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	281.1
切片机刀片 819 型	徕卡，德国韦茨拉	14035838925
Minilys 均质机	PEQLAB Biotechnologie GmbH，德国埃尔朗根	91-PCSM
NaOH	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	K021.1
制霉菌素	PAN 生物技术，德国艾登巴赫	P06-07800
PBS	Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	14190-094
青霉素/链霉素	Life Technologies，德国达姆施塔特	15140122
胃蛋白酶	Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴	P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm	Peqlab 生物技术，德国埃尔朗根	91-PCS-CK14
Rotamax 120 板振荡器	Heidolph，施瓦巴赫，德国	544-41200-00
SDS	Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国	CN30.3
体视显微镜	Leica，Wetzlar，德国	M125
Steriflip-GP，0,22 和微;m	默克 Millipore，德国达姆施塔特	SCGP00525
Stuart 模拟摇杆和滚轮混合器	Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴	Z675113-1EA
Tissue Tek OCT 化合物	Hartenstein，德国维尔茨堡	TTEK
输血套装 200µm	Sarstedt， Nümbrecht， 德国	798.200.500
TRIS	Carl Roth， 卡尔斯鲁厄， 德国	5429.3
vedena Skalpellgriff 图 3， 标准， 125 毫米	医疗亮点， 罗尔多夫， 德国	CV102-003
Vortex-Genie2	Scientific Industry， 纽约， 美国	SI-0256