从人脐血来源的CD34+细胞诱导巨核细胞分化及血小板生成

摘要

可从脐带血来源的CD34⁺细胞中获得高纯度的巨核细胞群体。本文介绍了一种CD34⁺细胞分离及巨核细胞分化的实验方法。

摘要

血小板的生成主要发生在骨髓中，该过程称为血小板生成（thrombopoiesis）。在血小板生成过程中，造血祖细胞分化形成血小板前体细胞，即巨核细胞（megakaryocytes），后者进一步终末分化，通过称为前血小板（proplatelets）的长胞质突起释放血小板。巨核细胞是局限于骨髓中的稀有细胞，因此难以获取足够数量用于实验室研究。高效生成人巨核细胞可通过 体外 通过培养CD34⁺ 在适宜条件下培养细胞。本文详细描述了CD34的分离方案。⁺ 通过磁性细胞分选法从脐带血样本中分离细胞。本文描述了在无血清条件下生成高纯度、成熟巨核细胞所需的步骤，并提供了巨核细胞分化表型分析、前血小板形成及血小板生成检测的详细方法。可在培养细胞中添加影响巨核细胞分化和/或前血小板形成的效应分子，如抗血小板抗体或血小板生成素模拟物，以研究其生物学功能。

引言

由于原代人巨核细胞（MK）在骨髓中所占比例极低，仅占有核细胞的约0.01%，因此常规实验室使用所需数量的原代人巨核细胞难以大量分离获取¹一种便捷的替代方法是 离体 在特定生长因子存在下扩增和分化造血干细胞和祖细胞。多种细胞因子，包括干细胞因子（SCF；c-kit配体）、白细胞介素（IL）-3和IL-11，已被用于培养系统以生成巨核细胞（MKs）。血小板生成素（TPO）是巨核细胞培养中最有效的生长和分化因子，可单独使用，也可与其他细胞因子（如SCF和IL-3）联合使用。²TPO 可作用于干细胞群体，促进巨核细胞的增殖与成熟².

巨核细胞通过称为前血小板的胞质突起产生血小板，并 体内 约 1 x 10¹¹ 血小板每日生成，以维持血小板计数在 150 - 400 x 10⁹/L. 血小板生成 体外 比……低达1000倍 体内 估计值³，并由此产生了大量使用CD34的培养条件⁺ 造血祖细胞以改善巨核细胞和血小板生成 体外. CD34的最初来源⁺ 用于巨核细胞分化的细胞为人外周血细胞^4<....

方案

本方案已获得南悉尼人类研究伦理委员会批准，并由新南威尔士大学人类研究伦理委员会确认。来自健康供体的脐带血由悉尼脐带血库（澳大利亚新南威尔士州悉尼）提供。本实验过程使用约 100 mL 体积的样本。

注意：在II级生物安全柜中使用无菌技术操作。用70%乙醇对脐带血袋外部进行去污染处理。本操作应使用无菌器械（剪刀、镊子）。

1. 脐带血细胞制备及CD34⁺细胞的分离

1. 配制无菌分离缓冲液（SB），成分为磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA。
2. 将10 mL SB加入50 mL锥形管中（每10 mL血液需使用一根管）。使用安装在10 mL注射器上的G18钝头针从血袋中抽取10 mL血液，并注入含有10 mL SB的50 mL管中。
3. 将15 mL淋巴细胞分离介质（见材料表）缓慢加入含稀释血液的管底，形成两层。
   注意：应缓慢将介质加至管底，避免不同液层混合。
4. 在室温（RT）下以1,200 × g离心30分钟，不启用刹车和加速功能。
5. 用巴斯德移液管将管中靠近中心、含有单个核细胞的液层（每管约5–10 mL）转移至新的50 mL管中。每管补加SB至总体积为50 mL。
6. 在室温下以400 × g离心10分钟....

结果

该方案可从脐血来源的CD34+细胞制备高纯度的巨核细胞（MK）培养物⁺ 细胞。CD34阳性细胞的百分比⁺ 脐带血中的细胞比例约为1.3%¹⁵ (图1A) 且单个核细胞总数（步骤 1.8）范围为 90 - 300 x 10⁶ 每 UCB 单位。分离后 CD34+/CD45+ 细胞的纯度范围为 90% 至 99%图1B）。MK（定义为CD41⁺ 细胞在无血清CD34培养早期即被观察到⁺ 在存在rhTPO的条件下进行细胞培养。第7天，成熟巨核细胞（CD41）的百分比⁺ 和 CD42a⁺ 细胞）通常为30%–40%（图1C）。CD41 的最高水平⁺ 和 CD42a⁺

讨论

本方案适用于从脐带血体外稳定地培养生成巨核细胞和血小板。这些细胞可用于研究多种过程，例如药物或生物活性对巨核细胞增殖、分化、前血小板形成及血小板生成的影响。

文献中已报道了多种培养基和细胞因子组合。添加干细胞因子、Flt-3配体、IL-3和IL-6等细胞因子可促进CD34⁺细胞的增殖，但此类扩增会导致培养物中巨核细胞（MK）纯度降低¹⁴。本文所述方法仅使用无血清培养基和重组人血小板生成素（rhTPO），虽不能显著扩增祖细胞，但可实现单系巨核细胞的增殖与分化，并稳定生成高纯度巨核细胞（90 - 99%为CD41⁺CD42a⁺双阳性细胞），且无其他细胞谱系污染。巨核细胞形成的培养周期为10至12天，无需基质细胞或饲养层细胞支持。该周期明显短于其他需要更长培养时间（超过20天）的方法^17,18。本方案的血小板产量为每个巨核细胞产生19 - 42个血小板，或每输.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养试剂
重组人TPO	Miltenyi Biotec	130-094-013
StemSpan SFEM II	Stem Cell Technologies	9605	CD34+细胞的无血清培养基
名称	公司	目录编号	备注
CD34分离试剂
CD34 MicroBead超纯试剂盒	Miltenyi Biotec	130-100-453	该试剂盒包含FcR人IgG封闭试剂和CD34磁珠。这些磁珠含有抗CD34抗体克隆QBEND/10。纯度检测时应使用不同的抗CD34克隆（例如克隆8G12）。
Lymphoprep	Alere Technologies	1114545	淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL）
无菌分离缓冲液（SB）	Miltenyi Biotec	130-091-221	该缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA。可使用无菌、细胞培养级组分自行配制。使用前需脱气，因为气泡可能堵塞柱子。
名称	公司	目录编号	备注
流式细胞术与细胞染色试剂
PE小鼠抗人CD34	BD Biosciences	340669	克隆8G12。可用于CD34纯度检测。最终抗体浓度为1:10稀释。
PerCP小鼠抗人CD45	BD Biosciences	347464	1:10稀释
PerCP同型对照	BD Biosciences	349044	1:10稀释
FITC小鼠抗人CD41a	BD Biosciences	340929	最终抗体浓度为1:5稀释。
APC小鼠抗人CD42b	BD Biosciences	551061	该抗体也可用于检测成熟巨核细胞（阳性细胞百分比通常低于抗CD42a）。最终抗体浓度为1:10稀释。
Alexa Fluor 647小鼠抗人CD42a	AbD Serotec	MCA1227A647T	目前由Bio-Rad经销。最终抗体浓度为1:10稀释。
Alexa Fluor 647小鼠阴性对照	AbD Serotec	MCA928A647	目前由Bio-Rad经销。同型对照抗体
抗血管性血友病因子兔多克隆抗体	Abcam	AB6994	1:200稀释
V450小鼠抗人CD41a	BD Biosciences	58425	1:20稀释
V450同型对照	BD Biosciences	580373	1:20稀释
PAC1-FITC抗体	BD Biosciences	340507	1:10稀释
抗CD62p小鼠单克隆抗体	Abcam	AB6632	1:200稀释
Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG	Invitrogen	A11008	1:100稀释
Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG	Invitrogen	A11020	1:100稀释
Ig同型对照混合物-C	BD Biosciences	558659	同型对照抗体
碘化丙啶	Sigma Aldrich	P4864
CountBright绝对计数微球	Molecular Probes, Invitrogen	C36950	计数微球
名称	公司	目录编号	备注
材料
LS柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	更小或更大的柱子也可商业购买
MidiMACS分选磁铁	Miltenyi Biotec	130-042-302
MACS MultiStand支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
Falcon 5 mL圆底聚丙烯FACS管，带 snap cap，无菌	In Vitro technologies	352063
载玻片	Menzel-Glaser	J3800AMNZ
含DAPI的封片剂	Vector Laboratories	H-1200	含DAPI的抗荧光淬灭封片剂
名称	公司	目录编号	备注
设备
倒置显微镜	Leica	DMIRB倒置显微镜
荧光显微镜	Zeiss	Vert.A1
细胞分析仪	BD Biosciences	FACS Canto II
细胞离心涂片机	ThermoScientific	Cytospin 4
名称	公司	目录编号	备注
软件
细胞分析仪软件	BD Biosciences	FACS Diva软件
单细胞分析软件	Tree Star	FlowJo
荧光显微镜软件	Zeiss	Zen 2 blue edition