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方法文章

从人脐血来源的CD34+细胞诱导巨核细胞分化及血小板生成

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DOI：

10.3791/56420

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2017年12月27日

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

本文内容

摘要

可从脐带血来源的CD34+细胞中获得高纯度的巨核细胞群体。本文介绍了一种CD34+细胞分离及巨核细胞分化的实验方法。

摘要

血小板的生成主要发生在骨髓中，该过程称为血小板生成（thrombopoiesis）。在血小板生成过程中，造血祖细胞分化形成血小板前体细胞，即巨核细胞（megakaryocytes），后者进一步终末分化，通过称为前血小板（proplatelets）的长胞质突起释放血小板。巨核细胞是局限于骨髓中的稀有细胞，因此难以获取足够数量用于实验室研究。高效生成人巨核细胞可通过 体外 通过培养CD34+ 在适宜条件下培养细胞。本文详细描述了CD34的分离方案。+ 通过磁性细胞分选法从脐带血样本中分离细胞。本文描述了在无血清条件下生成高纯度、成熟巨核细胞所需的步骤，并提供了巨核细胞分化表型分析、前血小板形成及血小板生成检测的详细方法。可在培养细胞中添加影响巨核细胞分化和/或前血小板形成的效应分子，如抗血小板抗体或血小板生成素模拟物，以研究其生物学功能。

引言

由于原代人巨核细胞（MK）在骨髓中所占比例极低，仅占有核细胞的约0.01%，因此常规实验室使用所需数量的原代人巨核细胞难以大量分离获取1一种便捷的替代方法是 离体 在特定生长因子存在下扩增和分化造血干细胞和祖细胞。多种细胞因子，包括干细胞因子（SCF；c-kit配体）、白细胞介素（IL）-3和IL-11，已被用于培养系统以生成巨核细胞（MKs）。血小板生成素（TPO）是巨核细胞培养中最有效的生长和分化因子，可单独使用，也可与其他细胞因子（如SCF和IL-3）联合使用。2TPO 可作用于干细胞群体，促进巨核细胞的增殖与成熟2.

巨核细胞通过称为前血小板的胞质突起产生血小板，并 体内 约 1 x 1011 血小板每日生成，以维持血小板计数在 150 - 400 x 109/L. 血小板生成 体外 比……低达1000倍 体内 估计值3，并由此产生了大量使用CD34的培养条件+ 造血祖细胞以改善巨核细胞和血小板生成 体外. CD34的最初来源+ 用于巨核细胞分化的细胞为人外周血细胞4其他细胞来源包括骨髓5,6胚胎干细胞/诱导性多能干细胞（ESC/iPSC）7，以及脐带血（UCB）8,9,10人骨髓CD34+ 11 小鼠谱系阴性骨髓细胞5 生成MK和血小板 体外然而，由于人类骨髓的可获得性有限，限制了其作为CD34来源的使用+ 细胞。相比之下，ESC和iPSC为细胞提供了无限的来源 体外 血小板生成。这些细胞生成血小板需要饲养层细胞（如小鼠OP9细胞）以及更长的培养周期。在无饲养层条件下产生的血小板功能似乎较弱。12iPSC来源的血小板有望在临床环境中得到应用，因其可实现大规模扩增。该过程需要通过慢病毒介导的转录因子转导以及长期的细胞培养。13.

脐带血是CD34+细胞的易获取来源，可直接用于科研。单独使用TPO即可促进脐带血来源的CD34+细胞分化，从而在无需添加血清或饲养细胞共培养的条件下获得高纯度的成熟巨核细胞（MKs）。其他细胞因子如SCF可能抑制脐带血CD34+细胞的分化，而Flt-3配体和IL-11则促进不成熟巨核细胞的生成14。本方案描述了在无血清条件下由脐带血CD34+细胞培养高纯度巨核细胞的方法。

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方案

本方案已获得南悉尼人类研究伦理委员会批准，并由新南威尔士大学人类研究伦理委员会确认。来自健康供体的脐带血由悉尼脐带血库（澳大利亚新南威尔士州悉尼）提供。本实验过程使用约 100 mL 体积的样本。

注意：在II级生物安全柜中使用无菌技术操作。用70%乙醇对脐带血袋外部进行去污染处理。本操作应使用无菌器械（剪刀、镊子）。

1. 脐带血细胞制备及CD34+细胞的分离

  1. 配制无菌分离缓冲液（SB），成分为磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA。
  2. 将10 mL SB加入50 mL锥形管中（每10 mL血液需使用一根管）。使用安装在10 mL注射器上的G18钝头针从血袋中抽取10 mL血液，并注入含有10 mL SB的50 mL管中。
  3. 将15 mL淋巴细胞分离介质（见材料表）缓慢加入含稀释血液的管底，形成两层。
    注意：应缓慢将介质加至管底，避免不同液层混合。
  4. 在室温（RT）下以1,200 × g离心30分钟，不启用刹车和加速功能。
  5. 用巴斯德移液管将管中靠近中心、含有单个核细胞的液层（每管约5–10 mL）转移至新的50 mL管中。每管补加SB至总体积为50 mL。
  6. 在室温下以400 × g离心10分钟，弃去上清液。
  7. 用巴斯德移液管小心地将细胞沉淀重悬于5–10 mL SB中。合并所有细胞悬液，并用SB调整体积至50 mL。
  8. 使用台盼蓝染色结合血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞（见材料表）。为测定样本中CD34+细胞的比例，将2.5 × 105个细胞重悬于100 µL SB中，加入10 µL抗CD34-PE抗体，在4 °C避光孵育15–30分钟，随后通过流式细胞术分析（图1A）。
  9. 在4 °C下以400 × g离心10分钟，弃去上清液。
    注意：若无需立即使用，单个核细胞可在该阶段冻存。
  10. 按每108个细胞加入300 µL SB的比例重悬细胞。每108个细胞加入100 µL FcR人IgG（封闭试剂，见材料表）和100 µL CD34磁珠。轻柔混匀后于4 °C孵育30–40分钟。
    注意：必须获得单细胞悬液（如有必要，在加入试剂前将细胞通过30 µm滤器过滤）。本说明中试剂用量适用于108个或更少细胞；若细胞数量超过108，应按比例增加试剂（SB、封闭液和CD34磁珠）用量。
  11. 在孵育期间准备LS分离柱：将LS柱置于磁力架上，用3 mL SB洗涤，弃去流出液。
    注意：LS分离柱最多可加载2 × 108个总细胞，也可选用更小或更大的柱子。
  12. 向细胞混合物中加入5–10 mL SB，以400 × g离心10分钟，弃去上清液。
  13. 将细胞重悬于1.5 mL SB中，将1.5 mL细胞悬液上样至LS柱。收集流出液（含未标记细胞）至15 mL收集管中（阴性组分#1）。待液体完全流尽后，用1.5 mL SB洗涤柱子。
  14. 将收集的流出液（共3 mL）再次上样至同一柱中，收集流出液至同一15 mL收集管（阴性组分#1）。用3 mL SB重复洗涤LS柱三次。
    注意：如有需要，可使用抗CD34抗体对阴性组分（共12 mL）中的细胞进行染色，以确认LS柱对CD34+细胞的捕获效率。
  15. 将柱子从磁力分离器上取下，用注射器活塞缓慢推注2 mL SB，将细胞洗脱至新的15 mL离心管中。
  16. 将柱子重新放回磁力分离器，将上述2 mL细胞悬液再次上样至柱中。收集流出液并用2 mL SB洗涤，此为阴性组分#2（共4 mL）。
  17. 将LS柱从磁力分离器上取下，加入2 mL SB。用注射器活塞稳定而有力地推注，收集CD34+细胞组分。使用台盼蓝染色结合血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
  18. 将阳性组分在4 °C下以400 × g离心15分钟，弃去上清液。将细胞重悬于CD34+细胞专用的无血清培养基（SFM，见材料表）中。
    注意：若无需立即使用，细胞可在该阶段于液氮中冻存。

2. 分离的CD34+细胞纯度检测

  1. 取阳性组的 2 × 104 个细胞，加入 10 µL anti-CD34-PE 抗体和 20 µL anti-CD45-PerCP 抗体，在 4 °C 下避光孵育 15 分钟（同型对照需单独设管）（图 1B）。
  2. 加入 1 mL SB 缓冲液洗涤，400 × g 离心 10 分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于 200 µL SB 缓冲液中。
  3. 进行流式细胞术分析，设门圈选活细胞群体以排除碎片（图 1B）；利用 PE 和 PerCP 同型对照设定 PE 和 PerCP 阳性群体的门控范围（图 1B），并计算 CD34+/CD45+ 细胞的百分比。

3. 巨核细胞分化

  1. 在12孔板中，每孔加入2 mL干细胞培养基（SFM），并补充50 ng/mL重组人血小板生成素（rhTPO），以5 × 105 个细胞/mL的密度接种CD34+ 细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润环境中培养。若在分析前细胞已长满，需收集细胞并用新鲜培养基和rhTPO将其分种至多个孔中。
    注意：应专门准备两到三个孔，用于在不同时间点（例如，第7、9、10天）监测细胞分化情况。
  2. 收集预留用于监测分化的孔中的细胞，注意不要扰动其他孔中的细胞。
  3. 在终体积为100 µL的条件下，使用20 µL抗GPIIb/CD41-FITC抗体和10 µL抗GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647抗体对细胞进行染色。设置对照管，使用相应的同型对照抗体。4 °C孵育15–30分钟。
  4. 加入1 mL SB洗涤。以400 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于200–300 µL SB中。通过流式细胞术进行分析。
  5. 针对每种荧光染料，分析同型对照以设定FITC和Alexa Fluor 647阳性群体的设门范围。分析染色后的细胞样本，确定CD41+/CD42a+双阳性细胞的百分比，该群体代表成熟的巨核细胞（图1C）。
  6. 如需通过显微镜观察细胞表面标志物，请按照步骤3.3所述方法对细胞进行染色。
    1. 加入1 mL SB洗涤。以400 × g离心10分钟。将沉淀重悬于100 µL SB中，以1,000 × g速度离心5分钟，使细胞沉降到载玻片上。将载玻片浸入甲醇中30秒以固定细胞。自然晾干后，加入20 µL含DAPI的封片剂（参见材料表），加盖盖玻片，并使用荧光显微镜观察（图2A）。
  7. 如需观察细胞内抗原，将细胞重悬于PBS中，并用终浓度为1%的多聚甲醛在室温下固定15分钟。为透化细胞，加入0.1% Triton-X 100，孵育15分钟。用2 mL PBS/0.1% Triton-X 100洗涤细胞。将细胞重悬于100 µL PBS/0.1% Triton-X 100中，加入抗vWf和抗CD62p抗体（1:200稀释），室温孵育30分钟。
    1. 用2 mL PBS/0.1% Triton-X 100洗涤，400 × g离心10分钟，将沉淀重悬于100 µL相同缓冲液中，加入抗小鼠IgG-Alexa 594和抗兔IgG-Alexa 488（1:100稀释），室温孵育30分钟。用2 mL PBS/0.1% Triton-X 100洗涤，将沉淀重悬于100 µL相同缓冲液中，再加入20 µL抗CD42b-APC抗体。然后按照步骤3.6.1所述方法将细胞离心至载玻片上，并按照步骤3.6.1所述方法制备样本用于显微观察。
  8. 进行倍性分析时，在分化第12或13天收集细胞。加入1 mL SB洗涤。以400 × g离心10分钟，然后在终体积为100 µL的条件下加入20 µL抗GPIIb/CD41-FITC抗体进行染色。4 °C孵育30分钟。
    1. 用1 mL SB洗涤一次，将沉淀重悬于300 µL低渗柠檬酸盐缓冲液（1.25 mM柠檬酸钠、2.5 mM氯化钠、3.5 mM葡萄糖）中，其中含20 µg/mL碘化丙啶和0.05% Triton-X 100。4 °C避光孵育15分钟。
    2. 加入RNase至终浓度为20 µg/mL，4 °C避光孵育30分钟。通过流式细胞术检测碘化丙啶荧光强度，采集CD41-FITC+群体的30,000至50,000个事件（图2C）。

4. 前血小板计数、血小板数量测定及血小板活化

  1. 在分化第8或第9天收集细胞（来自步骤3.1），并以1 × 10⁶细胞/孔的密度接种于多孔板中4 细胞/孔，接种于48孔板中，每孔200 µL新鲜SFM培养基，添加50 ng/mL rhTPO。于37 °C、5% CO₂条件下培养5天2.
    注意：为定量目的，每个样本设置三个重复孔。此低密度培养条件对于观察和计数携带前血小板的巨核细胞（MK）是必需的。前血小板通常在培养2天后开始出现，第4至5天达到高峰。
  2. 在倒置显微镜下使用10倍或20倍物镜，对整个孔中带有血小板前体的巨核细胞数量进行计数。
    注意：建议使用加热（37 °C）的显微镜载物台，因为将细胞长时间置于室温下会导致血小板前体突起收缩。血小板前体表现为从巨核细胞体延伸出的长突起，每个巨核细胞可能具有多个血小板前体突起。随着血小板前体的发育，巨核细胞的胞体体积逐渐减小。
  3. 收集细胞，在室温下以 400 x g 离心 10 分钟。按照步骤 3.3 和 3.4 所述，用 20 µL 抗人 CD41-FITC 抗体对细胞进行染色。计算携带前血小板的巨核细胞（pbMK）百分比：pbMK (%) = [（携带前血小板的巨核细胞数/孔）/（总 CD41+ 细胞/孔）] × 100
  4. 为了计数培养基中释放的血小板，使用巴斯德吸管轻轻混匀细胞，并在培养第14天或第15天收集100 µL培养液。
    1. 使用20 µL抗人CD41-FITC抗体在4 °C避光孵育20–30分钟。同时设置同型对照管，使用相应的同型对照抗体。
    2. 加入150 µL SB缓冲液和50 µL计数微球。
    3. 进行流式细胞术分析时，将FSC和SSC设为对数尺度。使用4.4.1节中所述经CD41-FITC染色的富血小板血浆来源的正常人血小板，设定血小板的设门范围（图3A).
    4. 使用计数微球通过流式细胞术分析染色后的血小板。在FSC与SSC散点图上采集1,000个计数微球事件图3A). 根据 CD41-FITC 阳性事件计算血小板数量（图3B）使用公式：
      每微升血小板数 = [（CD41-FITC 阳性事件数）/ 1,000 个微球] × [（50 µL 中的微球数）/ 样本体积]
  5. 为分析血小板活化情况，在培养第14或15天时，用巴氏吸管轻轻混匀细胞，取100 µL细胞悬液。加入1 mL Tyrode's缓冲液（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1 mM MgCl₂，0.42 mM NaH₂PO₄，10 mM HEPES，5 mM 葡萄糖，12 mM NaHCO₃，pH 7.4），用含2%胎牛血清的Tyrode's缓冲液以1,200 × g离心5分钟。弃上清，将细胞重悬于含2%胎牛血清和0.1 U/mL丙氨酸-脱氨酶的Tyrode's缓冲液中，调节细胞密度至1 × 10⁸个/mL。在37 °C孵育15分钟以降解内源性腺苷酸。取100 µL细胞悬液，加入1 µL抗人CD42b荧光标记抗体（如CD42b-PE），混匀后于室温避光孵育20分钟。用500 µL含2%胎牛血清的Tyrode's缓冲液洗涤一次，1,200 × g离心5分钟，弃上清。将细胞重悬于200 µL缓冲液中，使用流式细胞仪检测CD42b表达水平以评估血小板表面标志物的表达。另取100 µL去腺苷酸化细胞悬液，加入5 µL 1 mM ATP标准品或等体积刺激剂（如10 µM ADP或20 µg/mL胶原），混匀后于37 °C孵育5分钟以诱导ATP释放。迅速冰浴终止反应，1,500 × g离心5分钟，取上清用于ATP释放检测。采用荧光素-荧光素酶生物发光法测定上清中ATP浓度，根据标准曲线计算释放量，以摩尔数每10⁸个细胞表示。同时设置未刺激对照组以扣除基础释放水平。2，1.8 mM CaCl2, 0.2 mM Na2HPO4，12 mM NaHCO₃3，5.5 mM D-葡萄糖，pH 6.5）中，200 × g 离心 5 分钟以沉淀细胞。
    1. 收集上清液，在800 × g离心10分钟，以沉淀血小板大小的颗粒。
    2. 弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL Tyrode's 缓冲液中。加入 20 µL PAC1-FITC 抗体和二磷酸腺苷（ADP），使 ADP 终浓度为 20 µM。室温孵育 20 分钟。通过流式细胞术分析，测定 FITC 阳性事件的百分比。以经相同处理的新鲜人血小板作为阳性对照（图3C).

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结果

该方案可从脐血来源的CD34+细胞制备高纯度的巨核细胞（MK）培养物+ 细胞。CD34阳性细胞的百分比+ 脐带血中的细胞比例约为1.3%15 (图1A) 且单个核细胞总数（步骤 1.8）范围为 90 - 300 x 106 每 UCB 单位。分离后 CD34+/CD45+ 细胞的纯度范围为 90% 至 99%图1B）。MK（定义为CD41+ 细胞在无血清CD34培养早期即被观察到+ 在存在rhTPO的条件下进行细胞培养。第7天，成熟巨核细胞（CD41）的百分比+ 和 CD42a+ 细胞）通常为30%–40%（图1C）。CD41 的最高水平+ 和 CD42a+

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讨论

本方案适用于从脐带血体外稳定地培养生成巨核细胞和血小板。这些细胞可用于研究多种过程，例如药物或生物活性对巨核细胞增殖、分化、前血小板形成及血小板生成的影响。

文献中已报道了多种培养基和细胞因子组合。添加干细胞因子、Flt-3配体、IL-3和IL-6等细胞因子可促进CD34+细胞的增殖，但此类扩增会导致培养物中巨核细胞（MK）纯度降低14。本文所述方法仅使用无血清培养基和重组人血小板生成素（rhTPO），虽不能显著扩增祖细胞，但可实现单系巨核细胞的增殖与分化，并稳定生成高纯度巨核细胞（90 - 99%为CD41+CD42a+双阳性细胞），且无其他细胞谱系污染。巨核细胞形成的培养周期为10至12天，无需基质细胞或饲养层细胞支持。该周期明显短于其他需要更长培养时间（超过20天）的方法17,18。本方案的血小板产量为每个巨核细胞产生19 - 42个血小板，或每输...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢澳大利亚健康与医学研究理事会的支持（项目资助号 1012409，与 BHC 相关）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养试剂
重组人TPOMiltenyi Biotec130-094-013
StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605CD34+细胞的无血清培养基
名称公司目录编号备注
CD34分离试剂
CD34 MicroBead超纯试剂盒Miltenyi Biotec130-100-453该试剂盒包含FcR人IgG封闭试剂和CD34磁珠。这些磁珠含有抗CD34抗体克隆QBEND/10。纯度检测时应使用不同的抗CD34克隆（例如克隆8G12）。
LymphoprepAlere Technologies1114545淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL）
无菌分离缓冲液（SB）Miltenyi Biotec130-091-221该缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA。可使用无菌、细胞培养级组分自行配制。使用前需脱气，因为气泡可能堵塞柱子。
名称公司目录编号备注
流式细胞术与细胞染色试剂
PE小鼠抗人CD34BD Biosciences340669克隆8G12。可用于CD34纯度检测。最终抗体浓度为1:10稀释。
PerCP小鼠抗人CD45BD Biosciences3474641:10稀释
PerCP同型对照BD Biosciences3490441:10稀释
FITC小鼠抗人CD41aBD Biosciences340929最终抗体浓度为1:5稀释。
APC小鼠抗人CD42bBD Biosciences551061该抗体也可用于检测成熟巨核细胞（阳性细胞百分比通常低于抗CD42a）。最终抗体浓度为1:10稀释。
Alexa Fluor 647小鼠抗人CD42aAbD SerotecMCA1227A647T目前由Bio-Rad经销。最终抗体浓度为1:10稀释。
Alexa Fluor 647小鼠阴性对照AbD SerotecMCA928A647目前由Bio-Rad经销。同型对照抗体
抗血管性血友病因子兔多克隆抗体AbcamAB69941:200稀释
V450小鼠抗人CD41aBD Biosciences584251:20稀释
V450同型对照BD Biosciences5803731:20稀释
PAC1-FITC抗体BD Biosciences3405071:10稀释
抗CD62p小鼠单克隆抗体AbcamAB66321:200稀释
Alexa Fluor 488山羊抗兔IgGInvitrogenA110081:100稀释
Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgGInvitrogenA110201:100稀释
Ig同型对照混合物-CBD Biosciences558659同型对照抗体
碘化丙啶Sigma AldrichP4864
CountBright绝对计数微球Molecular Probes, InvitrogenC36950计数微球
名称公司目录编号备注
材料
LS柱Miltenyi Biotec130-042-401更小或更大的柱子也可商业购买
MidiMACS分选磁铁Miltenyi Biotec130-042-302
MACS MultiStand支架Miltenyi Biotec130-042-303
Falcon 5 mL圆底聚丙烯FACS管，带 snap cap，无菌In Vitro technologies352063
载玻片Menzel-GlaserJ3800AMNZ
含DAPI的封片剂Vector LaboratoriesH-1200含DAPI的抗荧光淬灭封片剂
名称公司目录编号备注
设备
倒置显微镜LeicaDMIRB倒置显微镜
荧光显微镜ZeissVert.A1
细胞分析仪BD BiosciencesFACS Canto II
细胞离心涂片机ThermoScientificCytospin 4
名称公司目录编号备注
软件
细胞分析仪软件BD BiosciencesFACS Diva软件
单细胞分析软件Tree StarFlowJo
荧光显微镜软件ZeissZen 2 blue edition

参考文献

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CD34
从人脐血来源的CD34+细胞诱导巨核细胞分化及血小板生成
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