通过高架十字迷宫检测大鼠的焦虑样行为时，结果会因测试环境的不同而表现出高度差异。本文展示了实验装置的设置（尤其是臂的结构）如何影响大鼠在迷宫中的行为，并介绍了一种可靠的研究抗焦虑药物效应的实验方案。本报告将有助于推动焦虑相关研究的发展。
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摘要
摘要
高架十字迷宫实验是一种用于评估啮齿类动物焦虑行为的行为学测试。尽管该测试在行为科学领域被广泛应用，但不同实验室常常得出相互矛盾的结果。为了找出导致结果差异的原因，我们此前重点关注了各实验室之间存在差异的臂部特征，尤其是开放臂两侧是否存在边缘，以及封闭臂壁的透明或不透明特性。在之前的一项研究中，我们使用自行设计的容器，在其他实验条件完全相同的情况下，比较了大鼠在不同开放臂与封闭臂组合设计中的行为，结果表明臂部特征的差异确实会干扰实验结果。简而言之，开放臂加装边缘会显著增加大鼠的类焦虑行为，而透明臂壁也可能降低此类行为。此外，我们验证了在无边缘开放臂与不透明壁封闭臂的组合下，抗焦虑药物作用的检测敏感性高于有边缘开放臂与透明壁封闭臂的组合。在本报告中，我们介绍高架十字迷宫实验的操作方案，并结合此前研究的关键结果及我们的实验经验进行讨论。我们相信本报告将为已使用或计划在研究中采用高架十字迷宫实验的研究人员提供有益的参考信息。
引言
患有焦虑症和抑郁症等情绪障碍的患者数量正在增加。尽管这些疾病的发病涉及遗传和环境因素，但其详细的致病机制尚未完全阐明1。因此，研究需要聚焦于揭示情绪障碍的潜在机制，以及开发副作用更少的有效药物。
用于实验动物的行为学测试有助于研究大脑的高级功能，包括情绪。由于动物行为具有高度变异性，即使使用相同的近交品系，不同实验室之间的实验结果也常常存在差异2。因此，研究人员还需了解其所采用实验装置的基本特性，以在实验室中获得可靠且精确的结果。
高架十字迷宫实验最初用于检测啮齿类动物的情绪反应性3,4。整个装置通常位于距地面500 mm的高度，由两个开放臂和两个封闭臂组成，呈十字形。在观察期间，记录动物对各臂的探索情况（包括进入各臂的持续时间和频率）、移动距离，以及伸展探查姿势等特定行为。通过这些指标，可将动物的焦虑水平评估为实验结果。
高架十字迷宫实验在全球范围内被广泛应用，但并非所有实验室都使用相同的设计装置5,6，而这些差异可能影响实验结果。例如，差异包括开放臂是否带有边缘凸起，以及封闭臂使用透明或不透明侧壁5,6。开放臂边缘凸起的设计旨在防止动物从装置上跌落7，而封闭臂采用透明侧壁则便于观察动物在封闭臂内的行为8,9。尽管已有部分研究探讨了单个臂部结构差异对检测动物焦虑能力的影响1,2,5,10,11，但开放臂（带或不带短边缘凸起）与封闭臂（透明或不透明侧壁）结构特征的组合效应对动物行为的影响尚未得到研究。
在最近的一份报告中，我们讨论了不同臂设计组合对大鼠类焦虑行为的影响12。简言之，开放臂带边缘显著增加了大鼠的类焦虑行为，而透明臂壁可能降低了此类行为。此外，我们验证了在无边缘开放臂与不透明壁封闭臂组合中，抗焦虑药物效应的检测敏感性高于带边缘开放臂与透明壁封闭臂组合。在本报告中，我们将介绍高架十字迷宫实验的操作方案，并结合此前报告中的关键结果进行讨论。我们相信，本报告将为已使用或计划在研究中采用高架十字迷宫的研究人员提供有用的信息。
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方案
此处描述的所有实验程序均已获得明治大学机构动物护理与使用委员会（IACUC 14-0002(1)）的批准。代表性结果中所用动物准备如下：雄性Sprague-Dawley大鼠从实验动物公司购得，在行为学实验开始前，每4只一组共同饲养于标准大鼠笼（宽200 × 深410 × 高250 mm）中，适应环境至少一周。 动物饲养室保持标准环境条件：光照（12:12明暗循环，光照开启时间为10:00）、室温（25.0 ± 0.5 °C）、湿度（55 ± 10%）、通风（每小时换气10次），并可自由摄取食物（日本东京Oriental Yeast公司）和饮水。动物饲养于标准大鼠笼（宽410 × 深250 × 高200 mm，日本爱知县Toyoriko公司）中，垫料为纸屑（alpha-dri，日本东京LSG Corporation公司）。
1. 高架十字迷宫实验
- 在定制容器（W1,500 × D1,500 × H2,000 mm）中设置高架十字迷宫装置（图1A) 在距地面500 mm处设有十字形金属框架，用于支撑跑道臂（图1B），容器顶部的照明装置用于照亮迷宫表面，使其达到所需光照强度（图1C），以及安装在中央天花板上的数码摄像机，用于对行为学实验进行实时视频监测（图1C).
- 将臂部（长500 mm × 宽100 mm）固定在十字形框架上，然后将方形中央平台（宽100 mm × 深100 mm）固定在四个臂的中心位置图1D - F).
注意：在我们的实验室中，有两种类型的开放臂（L500 × W100 mm）和两种类型的封闭臂（L500 × W100 × H450 mm）图1D）。封闭臂具有透明或不透明的侧壁（图1D），开放臂设计有或没有一个短凸缘（H5 mm， 图1E）。方形中央平台（100 × 100 mm）位于四个臂的中心图1D - F）。因此，可根据实验目的制备以下四种臂的组合：带凸缘的开放臂 + 带透明壁的闭合臂（Ledges/Transparent）、带凸缘的开放臂 + 带不透明壁的闭合臂（Ledges/Opaque）、不带凸缘的开放臂 + 带透明壁的闭合臂（No-Ledges/Transparent），以及不带凸缘的开放臂 + 带不透明壁的闭合臂（No-Ledges/Opaque）。臂跑道的表面为黑色，以便如文中所述，通过自动化行为分析软件更清晰地追踪动物轨迹。 第2节 行为分析 - 调节每条臂远端部分及中央平台表面的光照强度至约100 Lux。
- 每次测试前，用70%乙醇溶液清洁整个装置，再用蒸馏水擦拭。
- 点击 "记录按钮" 启动硬盘录像机以开始记录大鼠行为的数字视频摄像，用于第2节“行为分析”中所述的视频成像分析。
- 将动物放置于中央平台，使其朝向一个开放臂，允许其在装置上自由探索5分钟。
- 点击 "停止按钮" 在硬盘录像机上完成录制。
- 将测试动物送回动物饲养室后，统计排便和排尿次数。
- 重复步骤1.4直至实验结束。
注意：每次实验开始前，必须先进行一次无动物的预实验，以确保所有实验条件均已正确设置，然后再将实验动物暴露于实验环境中。否则，部分动物（尤其是第一只动物）可能会经历不同的环境条件例如，可能由实验者操作过程中产生的噪音和/或先前测试动物留下的动物线索所引起。
注意：实验人员在测试动物时位于容器附近。因此，即使实验人员不在动物的视线范围内，动物仍可能通过气味和/或声音感知到他们的存在。
2. 行为学分析
注意：行为学分析通过人工观察和自动化分析软件进行。
- 人工观察
- 将动物放置在平台上后，观察以下指标：进入臂的次数（定义为动物四肢全部进入任一臂的任意一次情况）、在各臂停留的时间，以及面向开放臂伸展探查姿势的次数，同时动物从中央平台向封闭臂后退。
- 从容器门关闭开始计时，使用秒表记录上述行为的持续时间及 频率，持续观察5分钟并进行计数。
- 自动化分析
- 使用现有的软件程序记录以下参数：移动距离、在开放臂不同区域（从中央平台起始的近端、中段和远端区域）停留的时间，以及在开放臂和封闭臂上每分钟的时间分布分析。
- 在开始人工观察的同时，点击自动化分析软件的"开始按钮"（若已设定录制时长，录制将在指定时间后自动停止）。
注：本研究所使用的动物行为分析软件通过动物与背景区域的对比度进行追踪；软件将动物识别为亮度较高的物体，并赋予其固定大小，通过追踪其中心点的运动实现动物定位。
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结果
在之前的研究中，我们比较了开放臂边缘和闭合臂壁透明度对大鼠在迷宫上探索行为的联合影响12。大鼠在无边缘的开放臂上停留的时间显著少于有边缘的开放臂（F[1, 60] = 13.49，P = 0.0005）（图2A）。在进入开放臂的次数方面也观察到类似结果（F[1, 60] = 11.17，P < 0.0014）12，表明边缘的存在可增加大鼠在开放臂上的探索行为。与闭合臂壁为不透明的装置相比，大鼠在闭合臂壁为透明的装置上表现出更少的伸展探查姿势（F[1,60] = 4.03，P = 0.0492）（图2B），提示透明的闭合臂壁可降低大鼠的类焦虑行为。大鼠在闭合臂壁为透明的装置上，其在开放臂远端区域停留的时间长于闭合臂壁为不透明的装置（F[1,60] = 8.00，P = 0.0983）（...
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讨论
随着包括焦虑症在内的精神疾病患者数量不断增加，开展前沿研究以加深对焦虑基本机制的理解显得尤为重要。为此，优化实验流程也至关重要。因此，为了改进高架十字迷宫实验的应用，我们利用大鼠展示了迷宫臂特征对实验结果的影响。
高架十字迷宫最初用于检测啮齿类动物的焦虑行为4，尽管其基本结构通常保持一致（例如，距离地面500 mm，呈十字形），但实验中常采用多种不同的臂设计。最初，该装置由无挡板的开放臂和带有木质不透明壁的闭合臂组成。然而，近年来发展出带有挡板的开放臂，以防止动物从装置上跌落，同时也开发出带有透明壁的闭合臂，以便于观察动物在闭合臂内的行为。但目前尚无研究报告探讨这些臂部特征组合对高架十字迷宫实验结果的综合影响。我们的结果表明，开放臂挡板的存在以及闭合臂壁的透明性会减少大鼠对开放臂探索的回避行为（图2），这可能降低地西泮抗焦虑效应的检测敏感性（图3）。在使用Ledges/Transparent装置时，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢平野明弘先生在定制设备制作过程中提供的帮助。作者还要感谢高桥浩介先生和中岛真吾先生提供的技术支持。本研究得到了日本厚生劳动省健康与劳动科学科研基金“化学物质风险研究”项目（H25-KAGAKU-IPPANN-003）以及日本明治大学理工学研究所研究项目资助A类的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 定制容器（宽1500 × 深1500 × 高2000 mm） | NA | NA | 由Akihiro Hirano先生手工制作 |
| 照明装置 | NA | NA | 由Akihiro Hirano先生手工制作 |
| 高架十字迷宫装置 | NA | NA | 由Akihiro Hirano先生手工制作 |
| 数字摄像机 | Watec | WAT-250D2 | 任何合适的摄像机均可连接至硬盘录像机，用于记录动物运动轨迹。 |
| 硬盘录像机 | TOSHIBA | RD-R200 | 任何合适的硬盘录像机均可与数字摄像机连接。 |
| Sprague-Dawley大鼠 | Charles River Laboratories Japan, Inc. | NA | 可选用任何合适的大鼠用于您的研究 |
| 标准大鼠笼具 | Toyoriko | TP-105 | 可选用任何合适的笼具用于您的研究 |
| 光照强度测量仪 | AS ONE | 1-5818-02 | 可选用任何合适的光照强度测量仪器 |
| EthoVision XT 版本8.0 | Noldus | NA | 可选用任何合适的动物行为分析软件 |
| 地西泮 | Taiyo Pharmaceutical Industry | 1124402A2061 | 可选用任何合适的药物用于您的研究 |
| 吐温80 | Wako Pure Chemical Industries | 9005-65-6 | 可选用任何合适的药物用于您的研究 |
参考文献
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