我们描述了一种在大鼠中通过立体定位引导来定位、暴露并损毁听觉皮层的方法。通过死后坐标图对损毁部位的定位进行评估。
本文内容
摘要
摘要
大鼠听觉皮层（AC）正日益受到听觉神经科学研究人员的关注，这些研究人员对经验依赖性可塑性、听觉感知过程以及皮层对皮层下听觉核团声音处理的调控机制感兴趣。为了应对新的研究挑战，开发一种能够精确定位并外科暴露听觉皮层的技术流程将显著加快相关研究进程。立体定位神经外科技术在动物模型的临床前研究中被常规用于将针头或电极植入听觉皮层的预设位置。在本实验方案中，我们以一种新颖的方式使用立体定位方法：通过识别大鼠颞骨表面的四个坐标点，界定出一个解剖窗口，打开该窗口后可准确暴露听觉皮层的初级（A1）和次级（背侧及腹侧）皮层区域。利用该方法，我们随后对听觉皮层实施外科消融手术。在完成此类操作后，必须评估皮层损伤的位置、大小及其范围。因此，我们还描述了一种简便的方法，即通过将听觉皮层的细胞构筑学边界映射至脑表面构建坐标图，从而在死后标本中准确定位听觉皮层的损毁区域。结合术中立体定位引导下的听觉皮层定位与消融操作，以及术后通过坐标图对损伤区域进行定位，有助于验证从实验动物获得的信息，并促进对研究数据的更深入分析与理解。
引言
大鼠是听觉神经科学研究中最常用的动物模型之一。其行为稳健，每天可完成数百次试验。大鼠听觉的敏感性和频谱分辨能力1,2，以及其中枢系统的解剖和功能组织与其他哺乳动物相似3，使其成为分析听觉神经科学广泛研究课题的合适动物模型。特别是大鼠听觉皮层（AC），已成为多项解剖学和生理学研究的对象，旨在理解其结构、组织特征及在声音处理中的作用3。如今，听觉皮层在致力于研究经验依赖性可塑性、听觉感知、感受野组织的突触基础，以及皮层对皮层下听觉核团声音处理调控的神经科学家当中日益受到关注4,5,6,7,8,9。为了应对这些新研究方法带来的挑战，能够精确定位并外科暴露听觉皮层的技术手段将加快研究进程。立体定位技术使得在无需生理测试的情况下即可方便地定位脑内特定区域。尽管动物间脑的大小略有差异，但通过参考大鼠颅骨上的解剖标志点所建立的立体定位坐标系，可以确定任何脑区的位置。
听觉皮层（AC）的局限性损毁是指手术切除与听觉最直接相关的皮层感觉区域。与其他用于阻断AC活动的方法（如冷却或局部利多卡因注射10,11,12）相比，手术损毁AC会导致功能的长期丧失。因此，AC损毁更适用于研究皮层剥夺的长期效应以及随后发生的损伤可塑性现象。立体定位技术与AC手术损毁相结合已被成功用于研究皮层调控缺失所引起的生理、行为和分子层面的影响13,14,15,16,17,18,19。例如，已有研究利用双侧AC损毁的大鼠模型来探讨皮层损毁对听觉惊跳反射和听觉脑干反应（ABR）的影响16。最近，我们比较了单侧与双侧AC损毁在损伤后不同时间点对大鼠ABR阈值、振幅和潜伏期所产生的效应18。此外，局限性AC损毁的大鼠模型还被用于研究皮层下行通路在下丘13,14,15和内耳17,19中的退变效应。在脑部进行此类操作后，有必要评估皮层中所造成损伤的位置、大小和范围。尽管基于神经元反应的音调图谱非常有用，但其主要局限在于需要使用电生理技术来定位大鼠脑内的听觉区域20,21。由于并非所有实验室都具备进行此类记录所需的设备和/或专业技术，我们构建了一张坐标图谱，该图谱通过将AC的细胞构筑边界转移到脑表面图像上来实现定位18。此图谱可在无需生理测试的情况下有效帮助定位AC。
本实验方案描述了一种在大鼠中通过立体定位引导，对前连合（AC）进行定位、手术暴露和损毁的方法。同时介绍了如何利用我们的坐标图谱18，将损毁区域的范围便捷地定位到损毁后脑组织表面图像上。
方案
本研究严格遵循西班牙法规（皇家法令53/2013 - 法律32/2007）和欧盟关于生物医学研究中动物护理与使用的指南（指令2010/63/EU）进行。
1 . 大鼠的准备
注意：我们使用雄性大鼠进行实验，以避免任何激素变化的影响。
- 通过肌肉注射给予氯胺酮盐酸盐（30 mg/kg）和赛拉嗪盐酸盐（5 mg/kg）混合物以麻醉动物；此剂量可使大鼠深度麻醉约1小时。
- 轻捏大鼠脚趾；若无回缩反射，表明动物已完全失去意识。若大鼠对刺激有反应，则追加初始剂量三分之一的麻醉剂。
- 剃除头皮毛发，并用聚维酮碘对术区进行消毒。
- 将动物置于加热垫上以维持体温在38 °C，并使用两个耳杆和一个咬合杆将动物头部固定于立体定位仪中。操作时需注意避免耳杆刺破鼓膜。
- 通过在每只眼睛上滴加一滴眼用凝胶或生理盐水以保护角膜。
2. 大鼠颞骨中交流电的位置
- 使用手术刀沿中线切开，暴露颅骨，并剥离覆盖在颅骨表面的骨膜。
- 使用无菌棉签轻轻擦去覆盖在颅骨表面的血液，根据大鼠脑图谱 Paxinos 和 Watson 图谱22 定位前囟、后囟和双耳间零点（interaural 0）。
- 用手术刀在颞肌靠近其颅骨背侧附着处做一切口。用缝合线和针具将肌肉拉出，并将缝合线固定在立体定位架上，以暴露颞骨。若出现出血，用冷的无菌生理盐水冲洗。
- 将一根无菌直针安装至立体定位显微操作器上，确保其完全固定。
- 缓慢降低针头，使其刚好位于颅骨表面正上方，使针尖对准双耳间零点（interaural 0）。将此点设为零点，并从此点确定坐标。
- 根据感兴趣脑区的不同，调整立体定位坐标。通过参考大鼠脑图谱 Paxinos 和 Watson 图谱22 确定这些坐标。确定坐标后，移动针头以对准相应位置。
- 利用以下四个点的坐标定位前连合（AC）：A：A/P = -5.8 mm，M/L = ±6.4 mm；B：A/P = -2.7 mm，M/L = ±6.4 mm；C：A/P = -2.7 mm，M/L = ±8.67 mm；D：A/P = -5.8 mm，M/L = ±8.67 mm。将针头降至颞骨上方，依次定位这四个点。使用记号笔在颞骨上标记这些点，并按顺序连接形成一个矩形；该矩形将作为骨窗开窗的引导标记（图 1）。
3. 暴露踝关节的手术操作
- 使用电钻和小钻头（0.6 mm Ø）开窗。以8,000 rpm的速度沿矩形边缘钻孔，直至骨质松动。通过冲洗冷的无菌生理盐水冷却钻孔表面，以防止损伤皮层下结构。当骨质松动时，可感觉到阻力下降。注意避免钻伤脑组织。
- 当边缘骨质松动后，用精细镊子轻轻提起骨片，并将其保存在冷的无菌生理盐水中。
4. 消融AC
- 在手术显微镜（10倍）下，用显微外科刀轻轻切开脑膜，并用两把尖头镊子将其移除。如果发生出血，用冷的无菌生理盐水冲洗。
- 使用连接无菌20 G钝头针的外科吸引装置（压力-0.24 bar）轻轻抽吸大脑皮层（AC）。此步骤至关重要，需极为小心：仅抽吸六层皮质结构，避免损伤下方的白质。
- 持续抽吸至穿支动脉停止出血。
- 抽吸完成后，将取出的颅骨复位覆盖损伤区域，并敷上可吸收止血纱布。
- 使颞肌恢复至原始位置，然后使用伤口夹（9 mm）缝合皮肤（参见材料表）。术后每天两次在伤口涂抹抗生素软膏，持续三天。
注意：每次涂抹应为薄薄一层。 - 术后1小时，在大鼠背部皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）作为镇痛剂，之后每8小时注射一次，持续72小时。
- 将动物留在加热垫上直至其苏醒，然后将其送回饲养笼中恢复。
- 单独饲养动物，防止同笼动物触碰缝合部位，并提供适当的环境丰富化物品。每日更换木屑以预防感染，并仔细观察动物恢复情况，确保无任何不适症状。
5. 组织采集
注意：操作多聚甲醛（PFA）时，无论是固体还是水溶液，均应佩戴个人防护装备（PPE），并在安全柜中进行操作。
注意：通过将4%（w/v）PFA在55 °C条件下溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备750 mL甲醛溶液。使用滤纸过滤甲醛溶液。通过将8.5 g NaCl、0.25 g KCl和0.2 g NaHCO3溶解于1,000 mL水中，制备林格氏溶液（溶液pH = 6.9）。
- 根据研究需要让动物存活相应时间。当完成对AC损毁大鼠的研究后，通过腹腔注射0.1 mL戊巴比妥钠（60 mg/kg）进行终末麻醉。通过夹趾反应及撤退反射的消失来评估麻醉深度。
- 当动物处于深度麻醉状态时，使用内径为1.8 mm的针头进行心内灌注，先灌注125 mL林格氏液，随后灌注750 mL甲醛溶液23。
- 灌注完成后，在第一颈椎处将大鼠断头。
- 使用剪刀去除头部的皮肤和肌肉以暴露颅骨。用剪刀剪开枕骨大孔并移除颅骨后部。
- 使用Spencer剪刀在眶骨上做横向切口，并用咬骨钳沿颅骨顶部边缘剪开以暴露脑组织。注意避免损伤脑组织。
- 脑组织暴露后，用尖头镊子小心剥离硬脑膜。用手指轻轻插入脑组织下方并将其抬起。抬起脑组织并切断神经，直至完全游离。将脑组织浸入甲醛溶液中，于4 °C保存24小时。
6. AC 损伤的定位
- 固定后，小心地将脑组织放入冠状面大鼠脑切片模具中，暴露脑的外侧表面。
- 使用相机支架将相机置于皮层表面上方 21 cm 处，选择 "超微距拍摄" 模式，拍摄脑表面的照片。
- 将脑组织放入矢状面大鼠脑切片模具中，暴露脑的背侧表面，并拍摄另一张照片。
- 使用图像编辑软件打开图像，并将其尺寸缩小 50%，以便于操作。根据 Paxinos 和 Watson 坐标19在图像上识别前囟（bregma）、后囟（lambda）和耳间线 0 点参考位置，并在图像中标记其位置（图 2）。在脑外侧图像上绘制消融区域的轮廓，并计算其周长。
- 将听觉皮层（AC）初级区（A1）和次级区（背侧和腹侧皮层）所在的位置坐标图18导入至正在处理图像的编辑软件文件中。点击坐标图并拖动，使其与消融脑的外侧照片重叠。
- 使坐标图中的前囟和后囟参考点与脑外侧图像中识别出的前囟和后囟参考点对齐。
- 利用鼻沟作为参考，调整脑图像与坐标图的位置，使其完全重合（图 2B）。
- 计算病变区域占听觉皮层（AC）总面积的百分比。
结果
我们对三只Wistar大鼠进行了立体定向引导下的定位、手术暴露以及单侧听觉皮层（AC）消融。病变定位结果证实，三只大鼠的消融范围均累及听觉皮层的主要亚区（初级、背侧和腹侧皮层），占整个听觉皮层总面积的80%至100%（图2B）。
本文所述的限制性听觉皮层（AC）损毁方案此前已在本实验室用于研究皮层控制剥夺对皮层下听觉核团的长期影响，以及随后发生的可塑性现象。在这些研究中，通过生理学（ABR）、行为学（惊跳反应、前脉冲抑制；PPI）以及分子生物学（DNA 微阵列、qPCR 和 Western Blot）方法对听觉皮层损毁方案进行了验证13,14,15,16,17,18,19。在此，为验证本方案的有效性，我们让三只接受听觉皮层损毁的大鼠存活一周，并在组织采集步骤中收集耳蜗，通过 qPCR 检测成年耳蜗中最重要的 AMPA 受体亚基 GluA2 和 GluA3 表达水平的变化。与仅完成全部手术流程但未进行皮层损毁的假手术对照组动物相比，听觉皮层损毁大鼠双侧耳蜗中 GluA2 表达下调，而 GluA3 表达上调（图3），该结果与我们先前的研究一致19。
图1：大鼠颞骨在三个不同手术步骤中的图像。（A）将前联合（AC）的立体定位坐标转移至颞骨。四个点的坐标分别为：A：前后（A/P）= -5.8 mm，内外（M/L）= ±6.4 mm；B：前后（A/P）= -2.7 mm，内外（M/L）= ±6.4 mm；C：前后（A/P）= -2.7 mm，内外（M/L）= ±8.67 mm；D：前后（A/P）= -5.8 mm，内外（M/L）= ±8.67 mm。（B）以上述坐标为参考，在颞骨表面绘制一个矩形，用于指导开窗位置。（C）显示钻孔后骨窗打开的情况。可在脑表面观察到带有血管的脑膜。R：吻侧，D：背侧。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：大鼠脑内损伤部位的定位方法。（A）听觉皮层（AC）损毁后的大鼠脑背侧表面照片，立体定位针植入Lambda和Bregma（根据Paxinos与Watson坐标19）。虚线标示了9 cm × 9 cm网格中Bregma和耳间0点（Interaural 0）的位置，同时也标示在脑背侧表面。（B）损毁脑的外侧表面照片与AC坐标准确叠加。图中红色轮廓标记了损伤区域的边界，地图中黑色轮廓标记了AC区域的边界。本示例中，相对于AC所占总面积，AC损毁的比例为84.79%。AC：听觉皮层，IA：耳间，FR：嗅周裂。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：单侧听觉皮层损毁后7天，AMPA受体亚基GluA2和GluA3的mRNA水平变化。 结果以倍数变化的均值±标准差表示。GluA2转录本的变化以蓝色表示，GluA3转录本的变化以红色表示。与未进行皮层损毁的假手术对照组相比，在术后7天，双侧耳蜗（损毁同侧和对侧）均观察到GluA2显著下调和GluA3显著上调；该结果与我们先前的研究结果一致19。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
成功的脑外科手术取决于两个因素：确保动物在手术期间及术后存活，以及准确定位目标区域。确保大鼠在手术过程中处于深度麻醉状态（通过检测其缩足反射），并给予充分的镇痛剂和非耳毒性抗生素，有助于提高存活率。此外，应将大鼠置于加热垫上直至从麻醉中苏醒，以避免低体温。缝合可降低感染风险，操作技术至关重要：动物可能会抓挠伤口夹，因此应将夹子安装得足够紧密以防止其自行拆除，但又不能过度张紧伤口。
为了准确定位听觉皮层（或任何其他皮层区域），必须确定前囟、后囟以及耳间0点的位置，以此作为参考来计算目标区域的边界。在计算坐标时的任何错误都可能导致听觉皮层部分损毁，或意外吸除周围其他区域。因此，针尖仅应在耳间0点处接触颅骨，随后根据本方案所述方法转换前后方向和内外侧方向的坐标。
在本论文中，我们还描述了如何通过手术暴露并损毁听觉皮层（AC）。该过程包含三个关键步骤：钻颅、打开并去除脑膜，以及通过吸引进行损毁。钻颅操作应以低速并施加最小压力进行，因为高速钻颅会产生热量，可能影响邻近的皮层下结构。然而，保持低速并使用冷的无菌生理盐水冷却钻颅区域，通常可避免任何组织损伤。此外，施加最小压力至关重要，以防止颅骨突然破裂，进而造成下方皮层的损伤。覆盖在听觉皮层上的脑膜的切开与清除应谨慎操作，以避免损伤血管。如果发生出血，通常预后不良，且该动物是否符合可靠研究的纳入标准也值得怀疑。我们建议在此情况下实施安乐死。最后，吸引操作（可能是实现有效损毁中最困难的环节）必须仅限于灰质区域。有两个指标可帮助判断是否已触及白质：（1）颜色对比度的变化，白质比灰质更亮；（2）穿通动脉出血停止。
在对脑组织进行任何操作后，有必要评估该操作在皮层中的定位、大小及范围，以便对从动物实验中获得的数据进行后续分析和验证。在本论文中，我们详细说明了如何利用本课题组先前描述的坐标图谱18来定位皮层中的损毁区域。该图谱基于组织学切片的连续切面重建所获得的解剖学参考点，并与 Paxinos 和 Watson 大鼠脑图谱22相对应而构建。因此，该图谱可区分听觉皮层（AC）中的初级皮层（A1）和次级皮层（背侧和腹侧）。该坐标图谱的主要优势在于，可通过将置于矢状脑切片模具中脑组织外侧面拍摄的照片与图谱叠加，快速定位损伤区域。另一个优势是，解剖学经验较少的实验室也可将其适配于自身的动物模型并加以使用。只需在对照灌注脑组织中测量前囟（bregma）、后囟（lambda）和双耳连线零点（interaural 0）之间的距离，并相应地放大或缩小图谱即可。使用鼻沟（Rhinal Fissure）作为参考，对脑组织照片与图谱进行对齐。该坐标图谱无法确定损毁的深度，深度需通过脑组织的组织学切片来确定。
立体定位技术与听觉皮层（AC）手术暴露的结合是基本方法，任何希望在大鼠中靶向听觉皮层的研究人员均可轻松采用。该方法可用于急性实验，也可用于需要植入永久性装置的实验。此外，听觉皮层的手术损毁此前已被用作研究慢性皮层听觉剥夺效应的模型。听觉皮层损毁还可用于研究单侧听觉皮层损毁对其他皮层区域的影响，或作为脑卒中模型。因此，本文所描述的实验设计是可广泛应用于多种实验设计中的有效方法，既可单独使用，也可联合应用。
披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本研究得到了西班牙政府经济与竞争力部（MINECO）资助项目 SAF2016-78898-C2-2-R 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 立体定位仪 | David Kopf Ins. | 900 | |
| 手术显微镜 | WILD M650 Heerbrugg | ||
| 加热垫 | DAGA | ||
| 牙科微电机 | W&H elco | 5118 | |
| 金刚砂钻头 | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
| 外科吸引装置 | Atmos | Atmoforte E2 | |
| 氯胺酮 | Merial | 30 mg/kg | |
| 赛拉嗪 | Bayer | 5 mg/kg | |
| 显微操作器 | Narishige | SM-11 | |
| 手术刀 | Lawton | ||
| 聚维酮碘 | Meda | Betadine | |
| 无菌生理盐水 | B.Braun | ||
| 20G 无菌针头 | Terumo Neolus | ||
| 棉签 | |||
| 缝合材料 | B.Braun | ||
| 抗生素软膏 | Quadriderm (倍他米松、庆大霉素、克霉唑) - Schering-Plough | ||
| 镊子 | dimeda | 10.331.12 | |
| 外科缝合针 | World Precision Instruments | 501940 | |
| 丁丙诺啡 | Indivior UK | Buprex | 0.05 mg/kg |
| 剪刀 | dimeda | 08.120.15 | |
| 斯宾塞剪刀 | dimeda | 08.804.14 | |
| 咬骨钳 | Lawton | ||
| 显微外科刀 | MSP | 7503 | |
| 可吸收止血纱布 | Surgicel | ||
| 大鼠矢状脑切片模具 | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
| 戊巴比妥钠 | Vetoquinol | 60 mg/kg | |
| 相机 | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | 镜头 F2.8-4.8 |
| 伤口夹 | Reflex 9 | 9 mm | |
| Canvas 12 | ACD Systems | ||
| 针头规格 | 直径 1.8 mm | ||
| 分液漏斗 | labbox | 11409 | 500 mL |
| GluA2 引物 正向 | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
| GluA2 引物 反向 | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
| GluA3 引物 正向 | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
| GluA3 引物 反向 | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |
参考文献
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