猪腰段背根神经节通路建立与注射的椎板切开术

摘要

我们介绍一种用于猪的椎板切开术方法，该方法可暴露腰段背根神经节（DRG），以便进行节内注射。手术过程中可实时监测注射过程，并在术后长达21天内通过组织学方法确认注射效果。本方案可用于未来涉及DRG注射的临床前研究。

摘要

背根神经节（DRG）是解剖结构明确的组织，包含头面部以下所有的初级感觉神经元。这一特点使DRG成为治疗慢性疼痛的新疗法注射的理想靶点。在小型动物模型中，通常采用椎板切除术来辅助DRG注射，该手术需切除包绕每个DRG的椎骨部分。本文展示了一种在大型动物物种（即猪）中对腰段DRG进行节内注射的技术。通过椎板切开术，使用标准的神经外科技术、器械和材料直接暴露DRG。与更广泛的椎板切除所致骨质去除相比，我们采用椎板切开术在充分暴露DRG的同时保留脊柱的解剖结构。术中通过使用无毒染料实时监测DRG注射的进程。术后第21天实施安乐死后，通过组织学方法检测4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在DRG内的节内分布，以评估注射效果。本研究注射的是生物学惰性溶液，旨在演示该操作流程。该方法可用于未来的临床前研究，将治疗性溶液靶向递送至DRG。我们的技术方案有助于在大型动物中验证小型动物DRG节内注射模型的可转化性。此外，本操作流程可为计划开展猪DRG注射临床前研究的研究人员提供重要参考。

引言

背根神经节（DRG）是沿脊柱分布的解剖学上分离的神经元集合。每个背根神经节均包含初级感觉神经元，负责编码并从中枢神经系统（CNS）特定体区传递外周刺激信号。例如，骨关节炎的疼痛始于关节周围痛觉感受器感知有害刺激。此过程称为伤害性感受。长期感知有害刺激可导致慢性疼痛¹。

慢性疼痛是临床前研究的常见课题²，其中的一个目标是开发将镇痛药靶向递送至背根神经节（DRG）的有效方法，例如神经节内注射³。然而，由于DRG位于椎间孔的骨性结构内，难以接近⁴。已有多个研究团队通过在啮齿类动物中实施脊柱手术成功克服了这一障碍^5,6,7,8,9,10。

在临床中，椎板切除术是一种常见的脊柱手术，指通过外科手段切除椎板，从而打开椎管

方案

本文所述所有方法均已获得梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 严谨性与可重复性的先决条件

1. 为确保设计的严谨性，应始终遵循国家规定的良好实验室规范，并在动物参与实验前获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）或类似委员会的内部批准。
   注意：本方案旨在保持与临床实践高度一致的方法。因此，所涉及的材料、器械和技术均按照人类临床最高标准进行描述。例如，必须严格遵守无菌操作技术，绝不可使用过期材料。
2. 为支持该方法在实验环境中的可重复性，应制定内部标准操作程序，并对不同实验组间的猪品种、体重、性别和年龄等变量进行控制。
   注意：本方案的设计基于使用体重为 38 - 53 kg 的猪。

2. 术前动物护理

1. 在操作前1天，给予5 mg/kg剂量的头孢噻呋，进行预防性肌内注射。
2. 限制动物食用固体食物，并禁止动物接受美容处理， 即 油浴，操作前12小时。
3. 在操作前1小时内诱导全身麻醉，使用肌肉注射的替来他明-唑拉西泮（Telazol）5 mg/kg和肌肉注射的赛拉嗪2 mg/kg。
4. 诱导后，皮下注射（SC）缓释型布托啡诺（buprenorphine sustained release, SR），剂量为0.18 mg/kg。
....

结果

注射物扩散的组织学评估
通过DAPI染色的组织学分布情况来确定注射物是否成功递送至背根神经节（DRG）。该技术的关键在于将针尖准确定位至DRG的三维中心位置。因此，通过评估组织切片中DAPI染色在靠近针尖部位（DRG中央切片）和远离针尖部位（DRG外周切片）的分布范围，可判断注射是否成功。图1A 和 图1B 展示了一例成功的单个DRG注射，DAPI染色在DRG中央和外周实质中均呈均匀弥散分布。因此，成功的DRG注射表现为DAPI染色在整个DRG三维结构中的广泛扩散。染色不均则提示注射效果欠佳。例如，染色信号微弱（图1C）或仅在外周边缘区域出现局灶性染色而DRG内部无染色（图1D）均表明注射失败。此外，综合来看，图1C（DRG中央切片）与 图1D

讨论

我们旨在描述一种用于背根神经节手术暴露的方法 通过 在健康大型动物物种（ specifically，猪）中进行椎板切开术和节内注射。在啮齿类动物中，已有类似方法的详细描述 ¹² 并用于递送常规药理学药物 ^8,10 和病毒载体 ^6,7,9,12 用于DRG。上述小型动物研究的结果令人鼓舞，我们希望本方案能为其他研究者将先前的发现转化为猪模型的研究铺平道路。上述研究中使用了健康和患病动物，表明小型动物在临床前研究中的应用价值。然而，为了在DRG的尺寸和注射物分布方面最接近人类情况进行比较，不可避免地需要采用大型动物模型。例如，大鼠与人类在DRG尺寸上的差异显而易见。成年雄性大鼠的L5 DRG大小约为2.6 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大型人道动物吊带	Britz &和公司	002539	修改以包含腹部开口
粘性患者回路电极 - 9 英寸	美敦力	E7506	-
游走血细胞 &和液体加温系统	3M	24500	-
乳酸林格液	Hospira	0409-7953-09	-
强制气流加温装置	3M	77500	-
含涂抹器的杜拉普利溶液，26 mL（0.7% 聚维酮碘，74% 异丙醇）	3M	8630	-
无菌一次性手术巾	Medline	MDT2168286	-
Ioban 2 切口敷料	3M	6651EZSB	-
一次性吸液瓶及管路	Medline	DYND44703H	-
单极电外科笔式按钮开关	美敦力	E2450H	-
精细光滑直型双极电外科镊，4 1/2 英寸	Bovie	A826	-
#15 刀片	Miltex	4-315	-
#11 刀片	Miltex	4-311	-
4 × 4 外科纱布	Dynarex	3262	-
Weitlaner 自持式牵开器，8 英寸	Miltex	11-618	-
Meyerding 自持式牵开器，1 英寸 × 2 3/8 英寸	Sklar	42-2078	-
Gelpi 自动牵开器，7 英寸	Sklar	60-6570	-
自由升降器，5 毫米	Medline	MDS4641518F	-
骨蜡	Ethicon	W31G	-
Spurling 椎间盘咬骨钳，3 mm	Sklar	42-2852	-
Spurling 45度上咬式 Kerrison 咬骨钳，2 mm	Medline	MDS4052802	-
Leksell 角度咬骨钳，2 mm	Sklar	40-4097	-
明胶海绵，规格 50	辉瑞	AZL32301	-
棉片	美敦力	8004007	-
6 Fr 弗雷泽吸头	Sklar	50-2006	-
弗雷泽吸引头，10 Fr	Sklar	50-2010	-
丹迪钝头直角神经钩	Medline	MDS4005220	-
尼龙缝合线，6-0	Ethicon	697G	-
Castroviejo 平滑微型持针器	Medline	MDG2428614	-
22号Quinke点脊髓穿刺针	Halyard Health	18397	-
32 号 CED 针头，带锁定卢尔接头	参见评论	n/a	如：Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. 背根神经节生物制剂微创对流增强递送：猪模型验证及人体前瞻性建模。技术说明。J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014)。
聚乙烯管，5 英尺	科学用品	BB31695-PE/05	-
3 mL 一次性注射器	肯德尔	SY15352	-
NanoJet 注射泵	Chemyx	10050	-
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	-
快绿 FCF	Sigma-Aldrich	F7252	-
球囊灌洗注射器	Medline	DYND20125	-
细齿Adson镊	Medline	MDS1000212	-
Vicryl 缝合线，0 号	Ethicon	J603H	-
Vicryl 缝线，2-0	Ethicon	J317H	-
针头计数器	Medline	NC20FBRGS	-
1/2×4英寸皮肤闭合胶带	3M	R1547	-