本文介绍了一种利用模式动物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）评估化学物质毒性的基本实验方案。该方法简便实用，不仅适用于药物研发，也适用于各类环境污染物的风险评估。
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本文内容
摘要
摘要
毒理学评估对于理解化学物质在基础和应用生物学领域对生物体的影响至关重要。一种非哺乳类土壤线虫， 秀丽隐杆线虫是一种在毒理学研究中具有重要价值的模式生物，相较于哺乳动物系统，其具有操作便捷且无动物伦理问题的优势。本方案中，详细描述了在该生物中进行化学品毒理学评价的具体步骤。 秀丽隐杆线虫 描述了一种方法。选择了一种临床抗癌药物依托泊苷（etoposide）作为模型测试化合物，该药物靶向人类拓oisomerase II并抑制人类癌细胞的DNA复制。采用年龄同步化的 秀丽隐杆线虫 卵子分别暴露于二甲基亚砜（DMSO）或依托泊苷中，随后观察其生长情况 秀丽隐杆线虫 通过体视显微镜观察，连续4天每天监测一次。记录产下的卵总数 秀丽隐杆线虫 用立体显微镜对经DMSO或依托泊苷处理的样本进行计数。依托泊苷处理显著影响了生长与繁殖能力 秀丽隐杆线虫通过比较经不同处理时间的化学物质处理后线虫产卵总数，可以确定这些化学物质对线虫生殖毒性的效应。 秀丽隐杆线虫 生殖功能是否可逆或不可逆。这些方案可能对各类药物的开发以及环境毒物的风险评估均有帮助。
引言
毒理学评价对于药物、营养保健品和化妆品的研发，以及各种环境毒素的风险评估至关重要。in vivo 实验系统中，啮齿类动物模型是毒理学研究最常用的模型之一；此外，非哺乳动物生物如 C. elegans 也被广泛应用。非哺乳动物毒理学评价模型不仅有助于解决动物伦理问题，而且在成本效益、易维护性、实验速度和可重复性方面具有显著优势1,2,3,4。
C. elegans 是一种土壤线虫，已被广泛用作多种基础和应用生物学及化学研究的模式生物。它是一种长约1毫米的透明线虫，可在固体或液体线虫生长培养基（NGM）中简单培养，并以大肠杆菌菌株Escherichia coli OP50作为食物来源。C. elegans 生命周期短，野生型N2品系的C. elegans 可产约300个卵，因此易于扩增，可大量获得实验材料3,4,5。C. elegans 也已广泛应用于多种药物和环境污染物的毒理学研究6,7,8,9。
由于许多抗癌药物以快速分裂的癌细胞为靶点，它们也可能损害其他快速分裂的正常细胞，例如骨髓细胞、肠上皮细胞和毛囊细胞。例如，拓扑异构酶抑制类抗癌药物通过靶向癌细胞的DNA复制过程发挥作用，因此也会抑制快速分裂的正常细胞。所有生物体都含有拓扑异构酶，而这些拓扑异构酶抑制剂很可能对生态环境系统产生影响6,10,11。因此，利用模式动物建立的药物毒理学评价平台，对于药物研发和环境风险评估均具有重要价值。
本文中，我们描述了以依托泊苷（etoposide）作为模型毒性化学物在C. elegans中检测其毒性的详细实验方案。依托泊苷是一种靶向拓扑异构酶II的临床抗癌药物。为此，我们将介绍对经依托泊苷处理的C. elegans进行体长测量以及总产卵数测定的方法。
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方案
注意：整个实验必须在洁净的隔离实验室中进行，室温维持在 20 °C，粉尘含量低，并在处理线虫和细菌时尽量减少污染。为此，实验必须在酒精灯火焰下或使用洁净工作台进行。
1. 维持 秀丽隐杆线虫 以及化学检测用卵的制备
- 维持 秀丽隐杆线虫 N2（布里斯托变种）线虫，饲养于含活菌的NGM琼脂平板上 E. coli OP50，20 °C12,13.
- 使用漂白液处理制备年龄同步的卵5 或产卵时间法6,14,15.
注意：在准备卵之前，用热灭活的含依托泊苷的NGM平板进行包被 E. coli OP50，如下所述。热灭活 E. coli OP50 用于最小化代谢活性 E. coli6,16.
2. 热灭活的制备 E. coli 喂食 OP50 秀丽隐杆线虫 毒性测试期间
- 按照表1所述配制500 mL双倍酵母胰蛋白胨（DYT）培养基，并接种一株在Luria-Bertani（LB）琼脂平板上培养的单菌落大肠杆菌（E. coli）OP505。
- 将E. coli OP50置于摇床培养箱中，在37 °C、150 rpm条件下培养14小时。
- 在3,220 × g、20 °C条件下离心30分钟，弃去上清液中的DYT培养基，加入预混液（含25 mL S缓冲液、250 µL 1 M MgSO4和25 µL 5 mg/mL胆固醇（溶于乙醇））。所有溶液均为无菌。
- 重悬细菌沉淀，并转移至50 mL一次性塑料离心管中。
- 进行热灭活处理时，将重悬的E. coli OP50置于水浴中，65 °C孵育30分钟。
- 冷却至室温后，于4 °C保存备用，可保存长达一个月。
3. 制备含1% DMSO或750 µM 依托泊苷的NGM平板
- 准备两个洁净的 200 mL 玻璃瓶。向其中一个瓶中加入 0.6 g NaCl、0.5 g 胰蛋白胨、3.4 g 琼脂、195 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子。向另一个空瓶中放入一个磁力搅拌子。
- 将这两个瓶子在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟，然后在 55 °C 水浴中冷却 30 分钟。
- 向其中一瓶中加入 0.2 mL 1 M CaCl2、0.2 mL 5 mg/mL 胆固醇、0.2 mL 1 M MgSO4 和 5 mL 1 M KPO4（所有溶液均为无菌），然后在 55 °C 的加热板上通过磁力搅拌混合均匀。
- 将混合好的 NGM 培养基等量分装至两个瓶子中（每瓶 100 mL）。接着向其中一瓶加入 1 mL DMSO，并再次使用磁力搅拌混合。将另一瓶保留在 55 °C 水浴中，直至进行下一步操作。将含 DMSO 的培养基每 3 mL 分装至一个 35 × 10 mm2 的培养皿中。此步骤可制备约 33 个含 DMSO 的 NGM 平板。
- 用磁力搅拌混合另一瓶培养基，加入 1 mL 75 mM 依托泊苷（母液溶于 DMSO），再次混匀，并重复分装步骤（步骤 3.4）。此步骤可制备约 33 个含依托泊苷（750 µM）的 NGM 平板。
注意：在相关前期研究6中，我们测试了 0、250、500 和 1,000 µM 的依托泊苷浓度。根据该数据，本文选择了 750 µM 的依托泊苷剂量。 - 将含有化学物质的 NGM 平板在室温下静置约 3 小时，冷却至室温，随后于 4 °C 保存备用。
注意：若化学物质对光敏感，应避光保存，以尽量减少光诱导的降解。
注意：可选地，可制备不含化学物质的普通 NGM 平板用于产卵实验，该实验可按照下文所述的两种不同化学处理条件进行。 - 向每个 NGM 平板上添加 100 µL 热灭活的 E. coli OP50（如第 2 节所述），并均匀涂布。在 20 °C 的 C. elegans 培养箱中过夜干燥，用于化学处理实验。
4. C. elegans 生长的测量
- 转移年龄同步化的 秀丽隐杆线虫 将卵接种到添加了1% DMSO或750 µM依托泊苷的NGM平板上。
- 孵育 秀丽隐杆线虫 在20 °C培养箱中培养4天。使用体视显微镜观察线虫，每天拍摄显微图像。通常采用20倍放大倍数（1倍物镜、2倍变焦放大和10倍目镜）进行生长观察较为合适 秀丽隐杆线虫同时拍摄显微镜载物台上微米尺的显微图像，用于线虫大小的校准。
注意：饥饿会影响毒性测试结果。因此，需提供充足的细菌进行喂食，或进行相应调整 转移 秀丽隐杆线虫 开始时记录卵的数量。观察至第3天，以排除饥饿的可能性。 - 测量体长 秀丽隐杆线虫 使用 ImageJ 软件对每个时间点经 DMSO 或依托泊苷处理的样本进行分析。
注意：每个样本的测量，50条线虫足以满足统计分析要求。- 在 ImageJ 中打开显微镜载物台测微尺图像（“文件” → “打开”）。
注意：显微测量图像与线虫图像（步骤 4.2）必须使用相同的放大倍数。 - 使用“直线”工具在显微测微尺校准图像上绘制一条1,000 µm的线段。
- 点击“分析”→“设置比例”，在“已知距离”框中输入1,000，在“长度单位”框中输入µm。勾选“全局”，然后点击“确定”。
- 打开线虫图像（“文件” → “打开”）。使用“自由线”工具沿每条线虫的体形特征绘制线条。点击“分析” → “测量”，获取体长数据。
- 对50条蠕虫重复上述步骤。
- 在 ImageJ 中打开显微镜载物台测微尺图像（“文件” → “打开”）。
5. C. elegans 产卵实验
- 将年龄同步的卵在含有DMSO或依托泊苷的NGM平板上于20 °C培养64小时（首次产卵前），直至发育至年轻成虫阶段。
注意：可选择使用生长测定实验中的线虫。同时进行生长测定和产卵实验较为方便。 - 将5只成虫转移至不含化学物质的新NGM平板（条件1：特定时间段内化学处理，即从卵到年轻成虫阶段），或转移至含有相同化学物质的预处理新NGM平板（条件2：在整个实验期间持续暴露于化学物质），然后继续培养24小时。
注意：建议每种处理设置3–5个NGM平板作为重复；这些重复可用于统计分析。 - 按上述方法转移至新的NGM平板，并每天记录产卵数量。同时记录爬出平板、死亡以及体内孵化的线虫数量。
- 重复上述步骤，直至线虫不再产卵，通常持续5天。
- 计算每个平板上每只线虫的产卵数，并将连续5天的数值累加，以确定总产卵数。
注意：在计算时应排除爬出平板及体内孵化的线虫数量。
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结果
经依托泊苷处理（24–96 小时）后，C. elegans 的生长显著受到抑制。培养 96 小时后，依托泊苷处理的线虫体长达到 0.86 mm，而溶剂对照组处理的线虫体长达到 1.04 mm（图 1）。在体视显微镜下也可明显观察到生长迟缓现象（图 2）。在培养 72 小时时，溶剂对照组线虫开始产卵；而依托泊苷处理组则在处理 96 小时后才观察到卵。根据这些数据，我们推测依托泊苷处理延迟了 C. elegans 的首次产卵时间。
除了延迟产卵外，依托泊苷处理还显著降低了每条线虫产下的卵的总数（图3）。当幼年成虫在存在（图3B）或不存在（图 3...
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讨论
本文以土壤线虫 C. elegans 为模型，描述了利用依托泊苷作为毒性示例进行化学物质毒性评价的方法。为此，我们采用了两种实验条件。在第一组实验中，将 C. elegans 从卵阶段开始在含有依托泊苷的培养板上培养至年轻成虫阶段，随后将线虫转移至不含化学物质的正常 NGM 培养板上产卵。在第二组实验中，C. elegans 在整个实验期间持续暴露于依托泊苷处理。通过比较两种实验条件下产卵数量的差异，可以判断受试化合物引起的生殖毒性是否具有可逆性。依托泊苷在两种实验条件下均显著减少了产卵总数（图3）。这些数据表明，在早期生长阶段对依托泊苷的预处理已足以对生殖器官（包括性腺生殖细胞）造成损伤；据此可推测，依托泊苷处理在 C. elegans 中诱导的生殖毒性是不可逆的6。
除了本文所述的 C. elegans 实验外，还可采用其他毒性检测方法，如寿命测定...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国科学技术院院内研究基金（2E27513）以及由农业、食品和农村事务部资助的高附加值食品技术开发计划（IPET）（315067-03）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | 秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC） | 野生型 | |
| 胆固醇 | Sigma, USA | C3045 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | 秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC） | ||
| 依托泊苷 | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J 软件（版本 1.4） | 美国国立卫生研究院，美国 | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 显微镜相机 | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| 蛋白胨 | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm 培养皿 | SPL Life Sciences, 韩国 | 10035 | |
| 90 × 15 mm 培养皿 | SPL Life Sciences, 韩国 | 10090 | |
| 体视显微镜 | Nikon, 日本 | SMZ800N | |
| 酵母提取物 | Becton Dickinson, USA | 212750 |
参考文献
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