方法文章

替代体外测定病毒衣壳结构完整性的方法

DOI：

10.3791/56444

⸱

2017年11月16日

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

本文内容

摘要

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利用病毒基因组扩增的常规检测方法由于不能区分传染性的非传染性微粒而受到限制。本文的目的是提供的其他方法, 以帮助区分传染性病毒颗粒使用适结合, 动态光散射和透射电子显微镜详细的协议。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类病毒在全世界造成了相当大的公共卫生和经济损失。新兴的体外培养的进展尚不适用于常规的病毒检测。目前的检测和量化技术, 主要依靠核酸扩增, 不区分传染性的非传染性病毒颗粒。这篇文章的目的是介绍最近在一起使用的技术进展的具体细节, 以便获得关于病毒微粒传染性状况的进一步信息。一种方法是评估病毒 ssDNA 适与衣的结合。适具有易合成、改性、价格低廉、稳定等优点。另一种技术, 动态光散射 (dl), 具有观察衣壳行为在溶液中的优势。电子显微镜允许可视化的结构完整性的病毒衣。尽管前景看好, 但每种技术都存在一些缺陷, 如对样品基质中的正电荷分子的非特异性适结合, 对 dl 的纯化衣壳的要求, 电子显微镜的灵敏度较差。然而, 当这些技术结合使用时, 所产生的数据提供了关于病毒衣壳完整性的更全面的信息, 可以用来推断传染性, 这些信息对于准确评估灭活方法或病毒检测的解释。本文提供了使用这些方法来区分传染性的人病毒粒子的协议。

引言

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人类病毒负责全球相当大的公共卫生负担, 每年造成大约6亿8500万疾病和21.2万人死亡1, 耗资数十亿美元的2,3。今天, 病毒检测和量化涉及基因组放大和/或 ligand-based 平台。前者通常是首选, 因为它比较敏感, 提供了定量信息, 并且通常具有较低的误报结果的风险4。最常见的病毒检测和定量的基因组扩增技术是逆转录酶定量聚合链式反应 (RT-qPCR)。因为它的目标和放大人类病毒基因组的一小部分, RT qPCR 单独是不能区分传染性和非传染性的粒子, 作为自由基因组 RNA, 受损衣含有基因组, 和衣致命突变/截断的基因组仍可通过 RT qPCR 放大。虽然最近已经报告了两个新的体外培养技术为人类病毒56 , 但它们仍然依靠 RT qPCR 进行病毒定量化, 而且还不是常规临床/环境的可行方法。测试人类的病毒。因此, RT-qPCR 仍然是临床/环境测试的黄金标准。

其他的体外方法是为了更好地估计病毒颗粒的传染性状态而开发的。这些方法一般可以归类为那些处理病毒衣壳完整性和评估基因组完整性的人。前者的....

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方案

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1. Plate-based 结合法评价高阶病毒衣壳结构的损失

注意: 在这里提出的一个非常类似的 ELASA 协议已被发布 29 ,和类似的 ELASA 化验报告以前曾作为研究文章的一部分在别处 17 , 18 , 22 。

  1. 对人类病毒的热处理 gii 4 悉尼衣
    1. 获得纯化的人类病毒主要衣壳蛋白 (VP1) 的 gii. 4 悉尼 (加入: JX459908) 组装在衣.
      注: 衣在研究中获得了 Atmar (休斯敦, 德克萨斯州贝勒医学院) 的礼遇.
    2. 稀释衣至50和 #181; 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.2) 中, 最大容积为15和 #181; L 在单个上限 PCR 管。确保该管含有至少 600 ng 的衣壳。确保每个治疗配体组合有 600 ng 的衣壳.
    3. 预热热循环到所需的热处理.
      注: 为本议定书的目的, 治疗68和 #176; C 为不同的时间 (0-25 min) 被选择了.
    4. 预热一个额外的热循环到4和 #1....

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结果

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人类病毒的结构完整性 GII. 4 悉尼衣 (vlp) 使用了摩尔et al.提出的几种新方法进行了评估17. 首先, 进行了一项实验, 将衣的完整性作为其绑定一个假定的受体/共同 (HBGA) 或 ssDNA 适 (M6-2) 的能力的功能进行了比较 (图 1)。显示的结果以前是由摩尔et al.提供的17, 并证明了适 M6-2-capsid 绑定行为与病毒 HBGA 结合, 在接触到68° c 热处理时对各种曝光时间的影响是相似的。虽然 HBGA 结合信号比适 M6-2 稍早丢失, 但 M6-2 显示了一个类似的信号损失率计算后 vlp 被暴露在65° c 和68° c 的各种时间点 (表 1)17。这表明, HBGA 和适 M6-2 的约束力都是以类似的方式废除的。

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讨论

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这里描述的协议和技术提供了一种评估人类病毒衣壳完整性/功能的方法。这些方法可用于获得对病毒灭活治疗效果的机械论洞察力, 并有可能补充更多传统的失活评估方法, 如 RT qPCR 或斑块检测。例如, 仅通过斑块法对化学或物理失活的评价, 就可以衡量病毒失活的程度, 而不是该失活的根本机制。此外, 病毒聚集可能导致低估的效价, 因此高估治疗效果30。这些方法可以通过提供有关治疗对病毒衣壳完整性的影响的信息来进一步告知这一研究。最近, 两个体外(细胞培养) 培养方法为人类病毒已报告5,6;这些仍然依赖于 PCR 的病毒计数, 虽然理论上的 enteroid 模型可用于 TCID50 使用抗体染色的相对还原测定。本文所提出的方法可用于了解多种不同类型治疗的病毒灭活的完全机制, 而不仅仅是热处理。例如, plate-based 配体结合和 TEM 作为辅助 qPCR 和斑块测定数据的工具, 在测定铜表面的病毒失活机理时,31

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了农业和食品研究倡议的支持, 2011-68003-30395 号来自美国农业部、国家粮食和农业研究所通过 NoroCORE 项目进行的竞争性赠款。美国农业部提供了开放获取费用的资金。我们要感谢罗伯特 Atmar (贝勒医学院, 休斯敦, 德克萨斯州) 好心提供我们纯化的衣和瓦莱丽拉帕姆为她的协助与 TEM 图像。我们还要感谢弗兰克 n. 巴里帮助我们开始了实验。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>基于板的结合测定法，用于评估高阶诺如病毒衣壳结构的损失
96 孔，中等结合聚苯乙烯 EIA 板Fisher （Costar）07-200-36
96 孔板的盖子Thermo Fisher3098
石蜡膜（Parafilm）ThermoFisherPM999
1x PBS（pH 值 7.2）Life Technologies20012-050
聚山梨酯 20Sigma-AldrichP9416
1x PBS （pH 7.2） + 0.05% 聚山梨酯 20N/AN/A
纯化、组装的人诺如病毒 GII.4 衣壳N/A N/A
单个 0.2 ml PCR 管Genesee Scientific22-154G
2 热循环仪Bio-Rad
台式微型离心机Fisher Scientific12-006-901
脱脂牛奶固体Thermo FisherLP0031B
合成组织血型 A 型二糖，生物素化Glycotech01-017
生物素化适配体 M6-2（原液浓度 100 &微量;M 在无核酸酶水中）：5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（ELISA 级），我们使用 Life Technologies SNN2004Life TechnologiesSNN2004
3,3'，5,5'-四甲基联苯胺 （TMB） 底物，室温赛默飞世尔50-76-00
1 M 磷酸N/AN/A
酶标仪能够读取 450 nmTecanInfinite m200 Pro
名称公司目录号评论
基于板的分析结果分析
Microsoft Excel 或类似程序N/AN/A
名称公司目录号评论
动态光散射实验
Zetasizer ZSP，或类似的粒度分析仪器Malvern InstrumentsN / A
VortexFisher Scientifc02-215-365
石英比色皿Hellma104-002-10-40
小容量一次性比色皿（以减少 VLP 的使用）马尔文仪器ZEN0040
名称Company目录号评论
<强>透射电子显微镜样品制备
带碳支撑膜的镍电子显微镜网格Ladd Research10880-100
自闭式反向电子显微镜镊子Ted Pella5372-NM
定性滤纸Sigma-Aldrich （Whatman）WHA1002055
玻璃培养皿Sigma-AldrichBR455743
100 mM HEPES 原液（pH 7.2）N/AN/A
2% 乙酸铀酰N/AN/A
1861096

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
  2. Scharff, R. L.

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Human NorovirusViral CapsidLigand BindingDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAptamer BindingCapsid IntegrityHeat TreatmentVirus InactivationCapsid Aggregation

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