流感中和抗体与预防流感感染的保护作用相关。微量中和试验用于检测人血清中的中和抗体，常用于流感的人体血清学研究。本文描述了一种使用MDCK-SIAT1细胞的微量中和试验，用于检测流感疫苗接种或感染后针对当前流行的3C.2a和3C.3a A(H3N2)病毒的中和抗体滴度。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
针对流感病毒血凝素（HA）的中和抗体被认为是与预防流感感染相关的最主要免疫机制。微量中和（MN）试验常用于检测流感疫苗接种或感染后人血清中的中和抗体反应。Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞是MN试验中常用的细胞基质。然而，目前流行的3C.2a和3C.3a亚型A(H3N2)流感病毒已获得改变的受体结合特异性。表面具有更多α-2,6唾液酸半乳糖基团的MDCK-SIAT1细胞系已被证明可为这些当代A(H3N2)病毒提供更高的感染效率和更真实的复制效果，优于传统的MDCK细胞。本文介绍了一种使用MDCK-SIAT1细胞的MN试验方法，已优化用于定量检测针对这些当代A(H3N2)病毒的中和抗体滴度。在本方案中，首先将含有中和抗体的热灭活血清进行系列稀释，然后与每孔100 TCID50的A(H3N2)流感病毒孵育，使血清中的抗体与病毒结合。随后将MDCK-SIAT1细胞加入病毒-抗体混合物中，在37 °C、5% CO2条件下孵育18–20小时，使A(H3N2)病毒感染MDCK-SIAT1细胞。过夜孵育后，对培养板进行固定，并使用抗流感A核蛋白（NP）单克隆抗体通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量各孔中的病毒量。中和抗体滴度定义为能够提供≥50%病毒感染抑制率的最高血清稀释倍数的倒数。
引言
流感病毒每年仍在人类中引起发病和死亡。血凝素（HA）是流感病毒的主要表面糖蛋白。靶向HA的中和抗体是与预防流感感染相关的最主要免疫机制1,2。血凝抑制（HI）试验和中和试验（MN试验）是两种广泛用于检测流感感染或疫苗接种后人血清中抗体反应的方法3。HI试验通过检测抗体对病毒凝集红细胞能力的抑制作用进行评估，被视为一种替代性检测方法。与HI试验不同，MN试验可直接测定人血清中在细胞培养中中和流感病毒感染的抗体水平。MDCK细胞常用于流感病毒的分离及MN试验4。
流感病毒持续发生抗原漂移和抗原转变，其血凝素（HA）蛋白上获得的突变可能改变病毒的受体结合特异性。自2014年以来，新型A(H3N2)病毒簇出现并持续流行至今。根据HA蛋白的系统发育分析，这些病毒大多属于基因型3C.2a和3C.3a。许多流行的3C.2a病毒株对红细胞的血凝能力降低，因此无法通过血凝抑制（HI）试验进行表征。5中和试验必须用于检测针对这些不具有血凝活性病毒的抗体反应6此外，研究表明，与早期的A(H3N2)病毒相比，这些当代A(H3N2)病毒的受体结合特性发生了改变，并且在传代过程中倾向于积累适应培养的....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有流感病毒的操作均应根据《微生物和生物医学实验室生物安全手册》（BMBL）中规定的相应生物安全等级要求（BSL-2 或更高）进行12.
1. 试剂与起始材料的准备
- 准备MDCK-SIAT1细胞 无菌细胞培养基
- 制备 MDCK-SIAT1 细胞培养基 使用500 mL含高糖的杜贝科改良伊格尔培养基（DMEM），10% v/v 热灭活胎牛血清（FBS），2 mM L-谷氨酰胺，1 mM 丙酮酸钠，1 mg/mL G418硫酸盐（例如，遗传霉素）以及100 U/ml青霉素与 100 µg/mL 链霉素（可选）。通过滤膜过滤除菌 0.2 µM 孔径膜。添加G418硫酸盐以确保质粒在MDCK-SIAT1细胞中的稳定性。
- 制备 MDCK-SIAT1 细胞系。在162 cm²培养瓶中2- 含有30 mL无菌细胞培养基的组织培养瓶，以每瓶2 - 2.5 × 10⁶个细胞的密度接种培养瓶6 MDCK-SIAT1 细胞并在 37 °C 在5% CO₂中2 2天；该样本将用于组织培养感染剂量（TCID）测定和中和试验（MN....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
测定病毒储备液的感染性是中和试验（MN试验）的第一步。图2展示了用于确定病毒储备液TCID50的板式布局。对于感染性未知的病毒储备液，可从多个预稀释度（例如10-2和10-3）开始进行滴定，以获得最佳滴定曲线来计算病毒的感染性。MN试验中使用的病毒量应标准化为每孔100 TCID50（50 µL）。为达到每孔100 TCID50，病毒储备液的最低稀释度为1:100。
图3 描述了使用MDCK-SIAT1细胞进行微中和试验的关键步骤。将热灭活血清在96孔板中进行系列稀释，如图所示。 图4. 100 TCID50/50 µL .......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
微量中和（MN）试验是用于流感血清学的主要试验之一，用于检测流感感染或疫苗接种后的抗体反应。许多流感血清流行病学研究常将MN试验测得的滴度作为主要结局指标。MN试验还广泛用于血清学诊断以及疫苗免疫原性的评估。已有国际多中心实验室研究对在不同实验室中进行的MN试验进行了比较14。
与血凝抑制试验（HI）不同，微量中和试验（MN）旨在直接测定能够在细胞培养中中和病毒感染的功能性抗体。目前全球各地的实验室使用多种形式的微量中和试验。该试验的读出结果（即，中和抗体存在时病毒感染性的降低可通过ELISA定量病毒NP抗体、HA定量病毒，或在抗体存在下感染病毒并在细胞培养中孵育后，对每个孔中的病毒蚀斑进行免疫染色来评估14,15基于荧光的各种形式蚀斑减少中和试验（例如，焦点减少试验和ViroSpot试验常用于大量流感病毒野外分离株的抗原特性分析，部分原因是这些试验所需的病毒量较少
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。本文的调查结果和结论仅代表作者观点，不一定代表疾病控制与预防中心和资助机构的立场。
致谢
我们感谢美国疾病控制与预防中心流感部门的卢秀华博士、刘峰博士以及阿什利·伯勒斯女士对本文准备工作的审阅与帮助 本手稿。我们感谢流感部门的Adrian Reber博士 美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的协助，感谢其在准备图示方面给予的支持 图3最后，我们感谢德国马尔堡的 M. Matrosovich 博士提供 MDCK-SIAT1 细胞。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科’含高糖的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM） | 生命科学 | 11965 | 无菌细胞培养、病毒扩增与病毒稀释培养基的关键组分 |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.03 | |
| 牛血清白蛋白（BSA）第五组分，无蛋白酶 | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-谷氨酰胺 | 生命科学 | 25030-081 | |
| 丙酮酸钠 | 生命科学 | 11360-070 | |
| 遗传霉素G-418二硫酸盐 | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | 生命科学 | 15630-080 | |
| 青霉素/链霉素 | 生命科学 | 15140-122 | |
| 丙酮 | VWR | 67-64-1 | 以80%的浓度使用 |
| 含过硼酸钠的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| 邻苯二胺二盐酸盐片 | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 每100 ml细胞培养级水中加入1片 |
| 硫酸 | Fisher Scientific | A510-P500 | 使用终浓度为 0.5 M |
| 变性乙醇，4L | VWR | EM-AX0422-3 | 使用浓度为70% |
| 胰蛋白酶-EDTA | 生命科学 | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| 抗NP小鼠单克隆抗体 | Millipore 混合液 | MAB 8257 MAB 8258 | |
| 抗小鼠 IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96孔平底板 | 赛默飞世尔科技 | 3455 | |
| 酶标仪 | 分子装置 | Spectromax 384 plus | |
| 细胞培养瓶 162 cm²/带通气盖 | Corning/VWR | 3151 |
参考文献
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
