Method Article

用 MDCK-SIAT1 细胞 Microneutralization 法测定人血清中中和 (H3N2) 病毒的流感中和抗体反应

DOI:

10.3791/56448

⸱

November 22nd, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

流感中和抗体与流感感染的保护相关。Microneutralization 测定检测人血清中和抗体, 通常用于流感人血清学。我们描述了一个 microneutralization 的方法, 使用 MDCK-SIAT1 细胞测量中和抗体滴的当代 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 病毒在流感疫苗接种或感染后。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对流感病毒血 (HA) 的中和抗体被认为是与保护流感感染相关的主要免疫机制。Microneutralization (MN) 检测通常用于测量流感疫苗接种或感染后人血清中和抗体的反应。机达比犬肾脏 (MDCK) 细胞是常用的细胞基质的锰测定方法。然而, 目前循环 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 流感病毒已获得改变受体结合特异性。MDCK-SIAT1 细胞系增加α-26 唾液半乳糖基在表面上已证明提供改善感染和更忠实的复制比传统的 MDCK 细胞为这些当代 A (H3N2) 病毒。在这里, 我们描述了使用 MDCK-SIAT1 细胞的锰测定方法, 它已经被优化, 以量化中和抗体滴到这些当代 a (H3N2) 病毒。在本协议中, 含有中和抗体的热灭活血清首先依次稀释, 然后用 100 TCID50/流感病毒 A (H3N2) 细菌孵育, 使血清中的抗体与病毒结合。然后将 MDCK-SIAT1 细胞添加到病毒抗体混合物中, 在37° c 下孵育 18-20 h, 5% CO2 , 允许 (H3N2) 病毒感染 MDCK-SIAT1 细胞。在夜间孵化后, 用流感 A 核 (NP) 单克隆抗体的酶联免疫吸附试验 (ELISA) 对每一个井中的病毒数量进行固定和定量。中和抗体滴度被定义为最高的血清稀释的相互作用, 提供50% 抑制病毒传染性。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

流感病毒每年继续造成人类人口的发病率和死亡率。HA 是流感病毒的主要表面糖蛋白。中和抗体靶向 HA 是主要的免疫机制, 与流感感染的保护相关的1,2。血凝抑制 (HI) 和锰测定法是广泛用于检测流感病毒感染或疫苗接种后的人血清中抗体应答的两种方法3。高含量的检测方法可抑制红细胞的病毒血凝, 并被认为是一种替代性试验。与 HI 不同, 锰测定法可以直接测定人血清中的抗体水平, 从而消除细胞培养中的流感感染。MDCK 细胞常用于流感病毒分离和锰含量测定4。

流感病毒经常进行抗原漂移和转移, 获取 HA 蛋白的突变, 从而改变病毒的受体结合特异性。自2014年以来, 新的一组 (H3N2) 病毒出现并继续流传到本赛季。这些病毒大多数属于基因组 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a 基于 HA 蛋白质的系统进化分析。许多循环 3 c. 2 的病毒已经降低了 hemagglutinate 红细胞的能力, 因此不能用 hi 化验5来表征。中和测定必须用于测量这些病毒的抗体应答, 而不 hemagglutinate6。此外, 研究表明, 这些当代 a (H3N2) 病毒改变受体结合性....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有流感病毒都应按照微生物和生物医学实验室生物安全 (BMBL)12所界定的适当的生物安全水平要求 (BSL-2 或更高) 来处理。

1. 试剂和起动材料的制备

  1. 制备 MDCK-SIAT1 细胞和无菌细胞培养基
    1. 使用500毫升 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 制备具有高葡萄糖、10% v/v 热灭活胎牛血清 (FBS)、2毫米 l-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1毫克/毫升 G418 硫酸盐 (例如) 的MDCK-SIAT1 细胞培养基g-418), 100 U/毫升青霉素与100µg/毫升链霉素 (可选)。通过0.2 µM 孔径膜进行过滤消毒。添加 G418 硫酸盐, 以确保 MDCK-SIAT1 细胞的质粒稳定性。
    2. 准备MDCK-SIAT1单元格行。在162厘米2-组织培养瓶 (s) 含有30毫升的无菌细胞培养基, 种子烧瓶与 2-2.5 x 106 MDCK-SIAT1 细胞和孵化在37° c 5% CO2为2天;这将用于组织培养的传染性剂量 (TCID) 的测定和锰的化验。
      注: MDCK-SIAT1 细胞由德国马尔堡 Dr. m Mat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

测定病毒种群的传染性是锰测定的第一步。图 2说明了用于确定病毒储存的 TCID50的版面布局。对于未知传染性的病毒种群, 病毒可以从多个 pre-dilutions 滴定, 例如 10-2和 10-3, 以便捕获最佳的滴定曲线来计算病毒的传染性。在锰测定中使用的病毒数量应标准化到 100 TCID50/井 (50 µL)。病毒储存的最小稀释量达到 100 TCID50/井是1:100。


图 3描述使用 MDCK-SIAT1 单元进行锰测定的关键步骤。热灭活血清是连续稀释 96-井板中所示, 在图 4。100 TCID50/50 µL 病毒.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

锰测定法是流感血清学中用于检测流感感染或疫苗接种后抗体应答的主要方法之一。由锰测定产生的滴常被用作许多流感血清研究的主要结果。锰测定法也广泛用于血清诊断和疫苗免疫原性评价。国际 inter-lab 的研究已经进行比较, 在多个实验室的锰化验结果14。

与 HI 相比, 锰测定法的目的是直接测量细胞培养中能中和病毒感染的功能性抗体。世界各地的野外实验室都有各种形式的锰测定方法。出的分析 (即, 减少在中和抗体存在下的病毒感染) 可以基于 ELISA 定量的病毒 NP 抗体, HA 定量的病毒, 或免疫染色的病毒斑块在每个井在细胞培养中存在抗体和潜伏期后感染病毒14,15。各种形式的 fluorescent-based 斑块还原中和试验 (例如, 聚焦还原法和 ViroSpot 测定) 通常用于大量流感病毒场分离株的抗原鉴定, 部分原因是低病毒这些化验所需的金额

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者报告没有利益冲突。这份出版物的调查结果和结论是作者的, 不一定代表疾病控制和预防中心和资助机构的观点。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Dr. 绣花卢, Dr., 和 Ms. 从疾病预防控制中心的流感部门的阿什利。我们感谢 CDC 流感部门的 Dr. 利伯, 帮助他准备图 3的图形。最后, 我们感谢 Dr. m Matrosovich, 马尔堡, 德国提供 MDCK-SIAT1 细胞。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
杜尔贝科s 高葡萄糖改良 Eagle 培养基 （DMEM）生命科学11965无菌细胞培养、病毒增殖和病毒稀释剂培养基的关键组分
胎牛血清 （FBS）HycloneSH30070.03
牛血清白蛋白 （BSA） 组分 V，不含蛋白蛋白酶Sigma-Aldrich3117332001
L-谷氨酰胺生命科学25030-081
丙酮酸钠生命科学11360-070
Geneticin G-418 二硫酸盐 Sigma-AldrichA1720-5G  
HEPES生命科学15630-080
青霉素/链霉素生命科学15140-122
丙酮VWR67-64-1以 80% 浓度使用
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液与过硼酸钠 Sigma-AldrichSLBF2806V
O-苯二胺二盐酸盐片Sigma-AldrichSLBQ1086V每 100ml 细胞培养级水 1 片
硫酸 Fisher ScientificA510-P500使用 0.5M 终浓度
乙醇，变性，4LVWREM-AX0422-3以 70% 浓度使用
胰蛋白酶-EDTA生命科学
RDE II "Seiken"Denka Seiken370013
Tween 20Sigma-AldrichP1379-500ml
抗NP小鼠单克隆抗体Millipore 池MAB 8257 MAB 8258
抗小鼠IgG HRP KPL074-1802
96 孔平底板Thermo Scientific3455
读板机，Molecular DeviceSpectromax 384 plus
细胞培养瓶，162 cm2/通气盖Corning/VWR3151
剂 剂 1748048，

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Influenza Neutralizing AntibodyMicroneutralization AssayMDCK SIAT1 CellsH3N2 VirusHuman SeraELISA DetectionTCID50 CalculationVirus PropagationSerum DilutionAntibody Titer

Related Articles