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利用点阵分析法研究细胞层的迁移

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DOI：

10.3791/56451

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2017年12月5日

1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

本文内容

摘要

细胞迁移对于发育、组织维持与修复以及肿瘤发生至关重要，其过程受到生长因子、趋化因子和细胞因子的调控。本实验方案描述了点迁移实验（dot assay），这是一种二维、无约束的迁移检测方法，用于评估贴壁的、具有完整性的细胞层在微环境信号刺激下的迁移表型。

摘要

尽管复杂的生物体看似静止，其组织却处于持续的更新过程中。随着细胞老化、死亡并被新细胞取代，细胞会在组织内以高度协调的方式移动。在肿瘤发生过程中，这种平衡被打破，肿瘤细胞离开原始上皮层，侵入局部微环境，迁移到远端部位，并最终在远处形成转移性肿瘤。点迁移实验（dot assay）是一种简单、二维且无约束的细胞迁移检测方法，用于评估细胞层向无细胞区域的净移动，并通过延时成像分析细胞迁移的相关参数。本文以一种具有侵袭性、可在肺部形成克隆的人类乳腺癌细胞系 MCF10CA1a 为例，演示点迁移实验的操作过程，用于分析细胞对表皮生长因子（EGF）的迁移反应。已知 EGF 可增强乳腺癌细胞的恶性潜能，并改变细胞的迁移表型。

引言

迁移实验被广泛用于在体外评估肿瘤细胞的侵袭性和转移潜能。in vitro。最常用的方法是划痕实验，用于评估上皮细胞层向无细胞区域的迁移能力1,2,3。进行划痕实验时，先将细胞接种形成单层，然后用移液器枪头制造一个"划痕"或无细胞区域。划痕实验操作简便，仅需常规的细胞培养耗材，可在多孔板中进行，便于同时处理多个样本。然而，在制造划痕的过程中，细胞会从单层中被物理性移除，并常伴随细胞死亡。此外，附着于培养板表面的细胞外基质也常在划痕过程中受到损伤。类似地，使用硅胶插件（如Ibidi小室4）或模板5,6,7也可能导致细胞的机械性破坏，并部分去除用于包被培养板的基质蛋白。另一类监测伤口或划痕闭合的实验的缺点是其时间进程有限，因为细胞迁移只能在划痕完全闭合前进行分析。

进行点状实验时，将细胞以圆形菌落的形式接种到有包被或无包被的培养板上8。这种接种策略的目的是获得具有明确边缘的细胞层，使其能够向周围无细胞区域迁移或侵袭，而无需通过去除细胞或插入物来干扰培养体系。点状实验的总体目标是通过边缘位移或菌落直径的变化来观察细胞层的迁移情况，同时进行延时成像，以更高时空分辨率分析细胞的迁移表型。

细胞迁移可受到多种微环境信号的影响，例如趋化因子、细胞因子以及表皮生长因子（EGF）等生长因子。 EGF 是一种生长因子，通过与其受体 EGF receptor 结合而发挥生物学效应9，并可增强肿瘤细胞的侵袭性和转移能力4,9,10。本实验采用点阵法（dot assay）研究 EGF 对一种具有侵袭性、可在肺部形成克隆的人乳腺癌细胞系（MCF10CA1a）的细胞迁移作用8,11,12。

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方案

1. 培养皿包被（第1天）

注意：操作时请确保不要在板的底部留下指纹或污渍。

  1. 将小鼠 IV 型胶原蛋白置于冰上解冻，并用 50 mM HCl（pH 1.3）稀释，配制 3 mL 浓度为 10 µg/mL 的 IV 型胶原蛋白溶液。
    注意：IV 型胶原蛋白在 37 °C 时会发生沉淀。因此，在解冻和操作过程中必须将胶原蛋白溶液保持在低温条件下。为避免反复冻融，建议分装成适当体积的 aliquot 并储存于 -80 °C。
  2. 向每个 12 孔玻璃底培养板的孔中加入 250 µL IV 型胶原蛋白溶液，并将其放入大小合适且可密封的塑料盒中。在培养板周围和上方放置湿润的纸巾以形成湿化腔，然后盖紧盒盖。于室温下孵育过夜。
    注意：由于仅需对生长区域进行包被，因此只需用胶原蛋白溶液覆盖附着于板底的盖玻片即可（参见 图 1A, B 中培养板的示意图）。
  3. 次日早晨，用去离子 H2O 洗涤培养板两次，以去除未吸附的胶原蛋白和缓冲液。将水流对准孔板边缘，避免直接冲向板底与盖玻片交界处（若将液体加入该区域，可能引起飞溅）。随后在超净台中将培养板风干。立即使用或于 4 °C 保存，最长可保存 5 天。
    注意：不同细胞系可能需要不同的包被条件，例如纤连蛋白或 I 型胶原蛋白。

2. 点印迹实验的平板接种（第2天）

  1. 制备细胞悬液
    1. 制备细胞悬液时，使用在含5%马血清的DMEM/F12培养基中、于60 mm组织培养皿中生长至80%汇合度的细胞
    2. 用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次，加入500 µL胰蛋白酶-EDTA（室温），在37 °C、5% CO2、湿润气氛的培养箱中孵育3–5分钟
    3. 用4.5 mL培养基重悬脱落的细胞以终止胰蛋白酶活性，并用血细胞计数板对20 µL细胞悬液进行计数
    4. 将剩余细胞在15 mL锥形管中以200 × g离心3分钟，吸除上清液，然后用培养基重悬细胞至浓度为3 × 106 个细胞/mL。
      注意：对于其他包被基质和/或细胞系，需通过系列稀释确定最佳细胞密度。建议以3 × 106 个细胞/mL作为起始点
  2. 接种细胞
    1. 将10 µL细胞悬液滴加至IV型胶原包被的12孔玻璃底板每个盖玻片的中央，注意不要接触或刮伤包被层（图1A, B）。将培养板置于37 °C、湿润气氛中孵育30分钟，使细胞贴壁。在倒置显微镜下检查细胞是否已贴附。
      注意：在液滴边缘处最易观察，此处可观察到单层细胞的形成（图1C）。如有必要，可将孵育时间延长至3小时。确保培养箱内湿度足够高，以防液滴快速干燥。若在此过程中观察到液滴体积减少，可在孔之间的空隙中加入PBS以提高湿度
    2. 用1 mL培养基轻柔地洗涤各孔两次，以去除未贴壁细胞。每孔加入1 mL培养基。在倒置显微镜下检查是否仍有悬浮细胞，如有则需再次洗涤。将细胞在37 °C、5% CO2、湿润气氛中过夜培养，以获得界限清晰的细胞层。
      注意：悬浮细胞可能重新贴附于培养板并形成不期望的细胞克隆

3. 刺激细胞（第3天）

  1. 使用倒置显微镜检查所有孔，确保细胞克隆已正常生长。如有必要，标记不合适的孔，并避免使用。
  2. 根据所研究的每种条件，对培养板的每个孔进行适当标记。每种条件应设置重复或三重复。
  3. 在刺激细胞前3小时，更换为含0.1%马血清的DMEM/F12培养基（饥饿培养基），以对细胞进行饥饿处理。
  4. 通过添加EGF（终浓度5 ng/mL）或其他所需介质刺激细胞，并使用1 mL移液器轻轻混匀培养基，或通过轻柔旋转培养板实现混匀。
  5. 将培养板孵育1至4天，观察边缘位移和边缘轮廓（如第4.1节所述），或进行时间推移成像（如第4.2节所述）。

4. 细胞克隆和细胞迁移的可视化

  1. 苏木精-伊红（HE）染色法检测集落生长（第4–7天）
    1. 用70%乙醇（每孔1 mL）固定细胞，约2分钟。
    2. 用苏木精对细胞核进行染色（每孔1 mL），约2分钟。
    3. 用自来水洗涤细胞，每孔1 mL，直至细胞核呈蓝色，5 - 10 分钟。
    4. 用伊红对细胞质染色（每孔1 mL），约2分钟。
    5. 用去离子水冲洗（1 mL/孔）。
      注意：苏木精和伊红溶液可收集并重复使用多次，直至染色效果变浅为止。
    6. 风干平板。
    7. 将培养皿翻转，用尺子测量斑点的直径。或者，使用相机拍摄培养皿照片，然后在 ImageJ 中分析斑点直径。
  2. 延时显微成像（第3天）
    1. 打开培养箱显微镜并将温度调节至 37 °C。向加湿器中加入 dH₂O。2O. 调整CO2 至5%。确保培养箱内保持湿润，且电动载物台可自由移动。关闭培养箱，使显微镜适应37 °C环境。
      注意：此处使用的显微镜（见材料表）应在细胞成像前至少预热 3 h 至 37 °C，以避免焦距漂移。
    2. 将培养板放置于孵育显微镜的载物台上，并设置载物台列表。对每个细胞点的两条对边及中心位置进行成像（图1A).
    3. 每3分钟拍摄一次图像，持续15至24小时，使用10X物镜 目标。下载数据，并使用选定的程序进行图像分析， 例如，ImageJ 或 Matlab。

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结果

本文展示的点状实验（图1）采用具有侵袭性、可在肺部形成克隆的乳腺癌细胞（MCF10CA1a）作为模型系统。该点状实验即使由初学者操作，也能获得高度可重复的细胞点，因此是一种简便且易于实施的实验方法（图1D）。将点状实验与苏木精-伊红（HE）染色、延时成像以及后续的粒子图像测速（PIV）技术相结合，可研究多种迁移参数，包括上皮边缘的位移、细胞迁移速度和方向性，即上皮细胞层边缘的细胞向无细胞区域迁移的过程。最初，通过相差显微镜观察细胞点发现，在表皮生长因子（EGF）刺激后，具有侵袭性的肺部克隆形成型乳腺癌细胞（MCF10CA1a）仍保持间充质表型。然而，在EGF刺激的细胞点中，更频繁地观察到单个细胞从细胞层脱离（图2，箭头所示）。为进一步评估MCF10CA1a细胞对EGF的反应，对经EGF刺激4天的细胞培养物进行了HE染色。结果表明，EGF刺激显著增加了克隆的直径（...

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讨论

在肿瘤进展过程中，细胞会从起源组织迁移出来，侵袭周围组织并转移到远端部位15。细胞从细胞集落迁移的现象可通过点迁移实验（dot assay）进行观察。本文通过分析人乳腺癌细胞对表皮生长因子（EGF）刺激的迁移表型，示例性地展示了点迁移实验的操作方法。

为了获得准确且可重复的结果，点阵实验设置中的多个步骤至关重要。首先，包被平板的方式决定了细胞能否以及以多强的程度黏附于平板表面，并发生迁移。应确保使用IV型胶原蛋白或其他细胞外基质对平板进行均匀包被，以尽量减少实验变异性。此外，必须确认所研究的细胞能够在包被后的平板上贴附并迁移，可能需要通过多种基质在不同浓度下的多次实验，以优化特定细胞系的包被条件。其次，细胞接种的准确性对可重复性极为关键。细胞液滴的分布范围决定了细胞点的大小及其形状。理想情况下，应将液滴放置到位而不让移液器枪头接触表面。此时液滴的形状主要由平板表面的表面张力决定，从而形成直径可重复的圆形区域。因此，可通过改变接种的细胞悬液体积来调节细胞点的直径。

因此，在进行点样...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Bhagawat Subramanian、Yi (Jason) Chang、Paul Randazzo和Carole Parent对稿件的审阅与评论。本研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的院内研究计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MCF10CA1a 细胞Karmanos 研究所N/A用于检测的细胞
小鼠 IV 型胶原蛋白BD Biosciences354233用于包被培养板
胰蛋白酶 / EDTAThermo Fisher25300054用于从组织培养板上消化细胞
DPBS Mediatech21-031-CV用于洗涤细胞
DMEM / F12Thermo Fisher11320082用作培养基
马血清Thermo Fisher26050088用于补充培养基
12 孔玻璃底培养板MatTekP12G-1.5-14-F用于培养用于成像的细胞
EGF（表皮生长因子，人重组）PeprotechAF-100-15用于刺激细胞
脂肪酸游离型 BSASigmaA8806-1G用于配制 EGF 缓冲液
苏木精SigmaHHS32用于染色细胞集落
伊红Electron Microscopy Sciences26051-10用于染色细胞集落
37 °C, 5% CO2 培养箱Sanyo型号 MCO-18AIC (UV)
配备培养箱腔室和电动载物台的蔡司 AxioObserver 显微镜蔡司型号 Axio Observer.Z1用于延时成像
ORCA Flash LT sCMOS 相机BioVisionC11440-42U-KIT与蔡司 AxioObserver 联用进行延时成像
MetamorphBioVisionMMACQMIC用于延时成像的软件
倒置显微镜Olympus型号 IX70用于细胞计数及组织培养中集落的观察
塑料盒Lock&LockN/A用作保湿室（任何可紧密封盖且能容纳培养板的塑料盒均可使用）

参考文献

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EGF IV MCF10CA1a

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