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方法文章

一种利用小鼠模型进行精子发生细胞学分析的生精小管压片技术

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DOI：

10.3791/56453

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2018年2月6日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

这种曲细精管压片技术的目的是在保持细胞完整性的前提下，快速评估发育中鼠类精母细胞的细胞学特征。该方法可用于研究精子发生的各个阶段，并可方便地与其他生物化学和分子生物学方法结合，用于小鼠减数分裂的研究。

摘要

雄性减数分裂的进程依赖于一系列高度调控的细胞事件协同作用。减数分裂过程中发生的错误可能导致不育、妊娠丢失或遗传缺陷。从青春期开始并持续至成年期，精原细胞以连续且半同步的波浪式模式进行精子发生，最终形成单倍体精子。小鼠中第一波启动减数分裂的初级精母细胞出现在出生后第10天（10 dpp），并在35 dpp时作为成熟精子释放至生精小管腔内。因此，在这一发育时间窗口内使用小鼠有助于获得高度富集的目标细胞群体。由于后续多轮精子发生波的叠加，老龄小鼠生精小管内的细胞群体更加复杂，使得稀有细胞阶段的分析更为困难。本文所述方法是一种简便易行的技术，可用于对小鼠生精小管内的细胞（包括精原细胞、精母细胞和精子细胞）进行细胞学评估。生精小管压片技术能够保持分离的雄性生殖细胞结构完整性，使其他技术难以观察到的细胞结构得以清晰呈现。为展示该压片技术的潜在应用，本研究监测了精母细胞在减数第一次分裂前期至中期（G2/MI期转换）过渡过程中的纺锤体组装。此外，中心体复制、减数分裂性染色体失活（MSCI）以及染色体花束结构的形成也被评估，作为利用此压片方法可观察到的典型细胞学结构示例。该技术可用于精确定位由基因突变或外界干扰引起的精子发生过程中的特定缺陷，从而促进我们对精子发生分子机制的理解。

引言

减数分裂是一种复杂的细胞事件，其中一次DNA复制后紧接着连续进行两次细胞分裂。为了确保染色体准确分离，减数分裂初期必须协调多个减数分裂特异性的事件。这些事件包括同源重组的完成、第一次减数分裂过程中姐妹动粒的共取向，以及黏连蛋白复合物的逐步解离，以解除同源染色体之间的交叉结构。对这些过程的精确调控对于维持生育能力至关重要，并可防止染色体错误分离，从而避免导致遗传性发育障碍和自发性流产1。

尽管减数分裂的关键事件在雄性和雌性中均会发生，但精子发生与卵子发生之间存在显著的时间和机制差异2。例如，在雌性减数分裂过程中，减数分裂前期I发生在胚胎发育阶段，并在网状期（dictyate stage）停滞，直至青春期才恢复。相比之下，精子发生在青春期开始后启动，并在成年期以波浪式持续进行，期间无停滞阶段。雄性和雌性减数分裂之间的差异凸显了开发专门用于评估精母细胞和卵母细胞中这些过程的方法的重要性。目前，评估减数分裂进程主要依赖染色质铺展技术3,4,5。虽然染色质铺展技术对研究减数分裂染色体非常有用，但其无法保持细胞完整性，因而难以评估纺锤体微管、中心体、核膜以及端粒附着等细胞结构。活细胞成像和长期培养技术极大地促进了我们对雌性减数分裂的理解；然而，类似的技术在完整细胞水平上用于研究精子发生的情况却较少见6,7。为了可视化雄性减数分裂全过程中的动态事件，我们改进了已有的曲细精管压片技术，以快速评估发育中鼠类精母细胞的细胞学特征8,9。本文所述方法可维持细胞完整性，从而能够在精子发生的各个阶段研究多种细胞结构。

这种曲细精管压片技术是一种全细胞方法，可通过免疫荧光显微镜评估细胞结构。目前常见的用于观察雄性小鼠减数分裂进程的组织学方法，如对石蜡包埋的睾丸进行苏木精和伊红染色，以及对冷冻切片进行免疫荧光标记，能够提供减数分裂进程的总体概览。然而，这些技术无法将单个细胞解析到足以详细分析整个减数分裂过程中所发生事件所需的程度10,11。其他用于观察减数分裂过程的技术依赖于对精母细胞施加显著的化学渗透压扰动，以分离和固定核物质3,4,5，但这些化学处理会阻碍除初级精母细胞以外其他细胞类型的观察。Namekawa近期描述的一种方法使研究界能够保存分离精母细胞的核结构，但该方法需要使用细胞离心涂片仪及其配件，而这些设备可能并非所有实验室都 readily available4。相比之下，曲细精管压片技术仅需大多数细胞生物学实验室中普遍配备的标准设备即可完成。

本文所述的曲细精管压片法可用于观察生精小管内存在的多种细胞类型，包括支持细胞、精原细胞、初级和次级精母细胞以及精子细胞。将该技术与幼鼠生精过程第一波的高度同步化特征相结合，可富集获得处于减数分裂不同阶段的生精细胞群体12。该方法使得对整个生精过程中的关键事件进行详细分析成为可能，例如前期早期事件、G2/MI期以及中期至后期的转换过程，以及精子形成过程。此外，曲细精管压片标本还可用于观察染色体的细胞学特征（如姐妹染色单体间结构域（ICDs）和动粒）以及中心体（中心粒和中心粒周围物质/基质）。压片法可方便地与其他实验方法平行开展，例如染色质铺展和蛋白质提取。此外，该技术已成功改进，可用于将活体生精细胞沉积于载玻片上，以实现直接观察13。

本文所述方法采用了一种完整的生精小管压片技术，用于分析野生型C57BL/6J小鼠中G2/MI期的转换过程。通过免疫荧光显微镜观察初级精母细胞进入第一次减数分裂时的细胞学特征，以可视化减数分裂纺锤体。该技术具有良好的通用性，可轻松改造用于观察其他减数分裂阶段及不同类型的细胞。此外，该技术也适用于其他可视化策略，例如DNA和RNA荧光原位杂交（FISH）方法。

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方案

小鼠的使用已获得约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。实验采用幼年期（产后20至26天，dpp）C57BL/6J小鼠，利用其生精过程的第一次半同步波进行操作。然而，该技术也可用于成年小鼠。

1. 小鼠曲细精管的分离与解剖

  1. 配制 表1 和 表2 中所述的固定/裂解液及抗体稀释缓冲液（ADB）。
  2. 为每只小鼠准备一个含有 3 mL 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH 7.4）的 35 mm 培养皿，另准备一个含有 2 mL 固定/裂解液的 35 mm 培养皿。
  3. 通过颈椎脱臼或 CO2 窒息法处死小鼠，并用 70% 乙醇喷洒腹部腹面。使用无菌剪刀呈 V 字形切开腹盆腔，然后用镊子夹住附睾脂肪垫将睾丸取出，注意避免破坏 tunica albuginea。将睾丸置于含有 1× PBS 的 35 mm 培养皿中。
    注意：为观察目标细胞群体的富集情况，建议利用第一次精子发生波14。不同年龄段的小鼠其精子发生各阶段的富集程度有所不同（表3）。
  4. 用尖头镊子刺破睾丸组织以去除 tunica albuginea，收集松散的曲细精管。将曲细精管转移至另一个含有 2 mL 固定/裂解液的 35 mm 培养皿中。
  5. 在室温下将曲细精管于固定/裂解液中孵育 5 分钟。

2. 生精小管的制备

  1. 用液体阻断笔在多聚-L-赖氨酸包被的玻片边缘划出轮廓，以制备玻片。
  2. 将 100 µL 固定/裂解液滴加至玻片中央。
  3. 使用无菌镊子和剪刀轻轻分离曲细精管，剪取长约 20 mm 的单个管段。
    注意：若需观察对固定剂长时间暴露敏感的结构（如中心体），应先在 1×PBS 中分离曲细精管，随后直接将组织剪碎并置于含 100 µL 固定-裂解液的多聚赖氨酸包被玻片表面。
  4. 将五段长约 20 mm 的曲细精管片段转移至已制备好的含固定/裂解液的多聚-L-赖氨酸包被玻片上。
  5. 使用无菌剪刀将曲细精管剪切成 1.5 至 3.0 mm 的小段。
  6. 使用无菌镊子将管段在玻片上排列均匀，确保组织无重叠且分布均匀。
    注意：每张玻片上最佳的管段数量为 20 至 40 段。

3. 生精小管的压片处理

  1. 将含有分散的曲细精管节段的载玻片转移至实验台面。用实验室擦拭纸去除多余液体，以避免压片步骤中组织丢失。
  2. 在载玻片上放置盖玻片（22 × 60 - 1.5 mm），用掌根施压10 - 20秒。施加足够的压力以使精母细胞从曲细精管中分散开来至关重要。
    注意： 使用解剖显微镜观察小管，以优化压片步骤，确保所有小管片段均被充分分散。
  3. 使用载玻片镊子，立即将载玻片在盛有液氮的小杜瓦瓶中速冻2 15 秒，或直至液体停止冒泡。若立即进行免疫标记，使用直边剃刀刀片、精细镊子或 21 号针头取下盖玻片。
    注意： 为获得最佳结果，应立即对切片进行免疫标记（见步骤4）。然而，此时切片可在-80 °C条件下保存最多两周。为最大限度延长蛋白质和细胞结构的保存时间，应立即将切片置于干冰上或转移至-80 °C冰箱中，并保持盖玻片覆盖在切片上。对已保存的切片进行免疫标记时，通过将切片浸入液氮中去除盖玻片2 15秒，如步骤3.3所述。

4. 已固定曲细精管的免疫标记

  1. 将切片浸入1x PBS中，在含有1x PBS的50 mL Coplin染色缸中洗涤三次，每次5分钟。
    注意：免疫标记过程中切片切勿完全干燥。
  2. 在玻璃载玻片上加入1 mL抗体稀释缓冲液，在湿盒中封闭1–2小时。
  3. 去除抗体稀释缓冲液，加入100 µL用抗体稀释缓冲液稀释的一抗，在湿盒中孵育。
    注意：为获得最佳效果，建议在4 °C下过夜孵育一抗。可通过盖上盖玻片或封口膜减少抗体用量（例如 50 µL）。需验证并优化一抗条件15。
  4. 在含有1x PBS的50 mL Coplin染色缸中漂洗切片三次，每次5分钟。
    注意：为增强洗涤效果，可使用小型磁力搅拌子在磁力搅拌器上低速振荡Coplin染色缸，或将其置于台式混合器上低速振荡。
  5. 在湿盒中室温下加入100 µL用抗体稀释缓冲液稀释的二抗，孵育1至1.5小时。将切片置于避光盒中，避免荧光偶联抗体发生光漂白。
    注意：可通过盖上盖玻片或封口膜减少抗体用量（例如 50 µL）。
  6. 在含有1x PBS的50-mL Coplin染色缸中漂洗切片两次，每次5分钟。
  7. 用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1.5 µg/mL）的封片剂封片，并加盖盖玻片（22 x 60 - 1.5 mm）。
  8. 用透明指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上，以保存样本并防止盖玻片移动。

5. 肾小管压片的分析与成像

  1. 使用带有自动载物台的落射荧光显微镜，该载物台可实现精确的Z轴移动，并配备高分辨率相机用于图像采集。或者，可使用激光共聚焦显微镜。
    注意：本步骤可使用任何可用的硬件和软件。例如，图1 和 图2 中显示的图像是使用连接ORCA-Flash 4.0 CMOS相机的蔡司Cell Observer Z1显微镜，并通过蔡司ZEN 2012蓝色版图像软件进行分析获得的。
  2. 使用20X 物镜评估载玻片，以确定压片制备的质量。高质量的载玻片应具有均匀分布的单层细胞核。
    注意：载玻片的某些区域可能优于其他区域，建议记录最佳区域的坐标，以便后续使用更高倍率进行进一步分析。
  3. 使用更高倍率的物镜（例如 63X 或100X），采集具有连续单层细胞核的区域图像。选定区域后，设定上下Z轴层扫描范围，以确保捕获所有处于焦点内的光线。
    注意：上下限之间采集的Z轴层数量通常由图像采集软件自动确定，且因不同物镜而异。
  4. 使用图像处理软件生成扩展景深聚焦图像。该软件将来自每个Z轴层的聚焦光线进行整合，对于优化小管压片样本的成像至关重要。

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结果

此处，我们采用曲细精管压片法观察了处于粗线期至第一次减数分裂中期（G2/MI）过渡阶段的短暂存在细胞群体，这些细胞通过采集经历第一次精子发生波的幼年野生型小鼠（24日龄）睾丸而富集获得。 图1 展示了利用曲细精管压片法可观察到的各种细胞时期的代表性图像。使用抗α-微管蛋白抗体对处于减数第一次分裂中期的精母细胞富集群体进行了观察图1A）。我们利用减数第一次分裂早期和晚期的标志物来确定减数分裂的进程。通过免疫荧光标记联会复合体蛋白SYCP3的抗体，对曲细精管压片进行染色，以观察减数第一次分裂前期各阶段。图中展示了细线期/偶线期以及粗线期/双线期的精母细胞。 图1B正在进行第一次减数分裂的精母细胞可通过抗α-微管蛋白抗体清晰识别 (图1A 和 1C)为了研究减数分裂晚期事件，...

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讨论

小鼠已被证明是研究精子发生过程中调控减数分裂进程的细胞事件的有用模式生物。此外，由于许多事件（例如减数分裂前期 I 的退出）具有性别二态性，因此有必要开发专门用于精子发生研究的工具。本实验方案描述了一种用于观察和研究小鼠精子发生不同阶段的生精小管压片方法。该方法可保持细胞完整性，从而允许对细胞核和细胞质结构进行详细分析。本研究展示的代表性结果表明，该方案可用于评估正在进行减数分裂进程的初级精母细胞。此外，该方案还可用于研究精子发生过程中的其他细胞过程，包括精原细胞的增殖与分化以及精子形成的不同阶段27,28。文中所述方法改编自先前报道的生精小管压片技术8,9。然而，本方案是首个涵盖从获取生精小管到通过荧光显微镜观察单个细胞所需全部试剂与步骤的详细指南。此外，我们还展示了利用该技术可观察到的其他细胞特征图像，包括中心粒和端粒花束结构。

优化曲细精管压片...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）（R01GM11755）向 P.W.J. 提供的资助，以及美国国家癌症研究所（NIH）（CA009110）向 S.R.W. 和 J.H. 提供的培训项目博士后奖学金。
 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 甲醛水溶液Electron Microscopy Sciences (EMS)15710
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）Quality Biological119-069-161
Triton X-100SigmaT8787
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA1470
马血清SigmaH-1270
35 mm × 10 mm 培养皿，无菌，未处理CellTreatP886-229638
聚-L-赖氨酸包被玻片SigmaP0425-72EA
液体阻断笔Electron Microscopy Sciences (EMS)71310
湿盒Evergreen240-9020-Z10
Wheaton Coplin 玻璃染色缸（适用于 5 或 10 张载玻片）Fisher08-813E
含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂Vector LabsH-1200
显微镜盖玻片（22 mm × 60 mm）Fisher12-544-G
透明指甲油AmazonN/A
显微镜
名称公司目录编号备注
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000 
Observer Z1Zeiss4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 blue edition 图像软件Zeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS 相机Hamamatsu
一抗
名称公司目录编号备注
小鼠抗 SYCP3 抗体Santa Cruzsc-745691:50
兔抗 SYCP3 抗体Fisher (Novus)NB300-2311:1000
山羊抗 SCP3 抗体Santa Cruzsc-208451:50
人抗着丝粒蛋白抗体Antibodies Incorporated15-2351:100
小鼠抗 α-微管蛋白抗体SigmaT90261:1000
小鼠抗 AIM1 抗体BD Biosciences6110821:200
小鼠抗-γH2AX 抗体Thermo FisherMA1-20221:500
小鼠抗 CENT3 抗体AbnovaH00001070-M011:200
兔抗 pericentrin 抗体Abcamab44481:200
兔抗 REC8 抗体由  Dr. Karen Schindler 惠赠N/A1:1000

参考文献

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