方法文章

用小鼠模型对精子发生细胞学分析的精管壁球技术

DOI：

10.3791/56453

⸱

2018年2月6日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这个小管壁技术的目的是快速评估发育中鼠精的细胞学特征, 同时保持细胞完整性。这种方法允许研究精子发生的所有阶段, 并可以很容易地实现与其他生物化学和分子生物学方法的研究小鼠减数分裂。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

雄性的减数分裂是一个过程, 需要一些高度调控的细胞事件的协同作用。减数分裂过程中发生的错误会导致不孕、流产或遗传缺陷。从青春期开始到成年, 持续的半同步波精经历精子发生, 最终形成单倍体精子。第一波的小鼠精进行减数分裂开始出现在10天产后 (10 民进党), 并被释放到管腔的精管作为成熟精子35民进党。因此, 利用小鼠在这个发展的时间窗口, 以获得高度丰富的利益群体是有利的。在老年小鼠中, 由于连续生精波的作用, 对稀有细胞阶段的分析比较困难, 从而增加了微管内细胞数量的多样性。本文所描述的方法是一种易于实现的技术, 用于细胞学评价小鼠的精管中发现的细胞, 包括精, 精, 和精子。小管壁技术保持了孤立的雄性生殖细胞的完整性, 并允许检查不容易与其他技术可视化的细胞结构。为了证明这种小管壁技术的可能应用, 在精过程中, 通过前期到中期 I 过渡 (G2/MI 过渡), 对主轴总成进行了监测。此外, 中心复制, 减数分裂性染色体失活 (MSCI) 和染色体花束形成被评估为例子的细胞学结构, 可以观察使用这种小管壁法。这种技术可以用来精确地确定精子发生过程中的特定缺陷, 这是由突变或外源性扰动引起的, 从而有助于我们对精子生成的分子理解。

引言

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减数分裂是一个复杂的细胞事件, 其中一个单一的一轮 DNA 复制后, 连续两轮细胞分裂。在减数分裂的初始阶段, 必须协调几个减数分裂的特定事件, 以确保准确的染色体分离。这些事件包括完成同源重组, 在第一次减数分裂的姐妹 kinetochores 的共同取向, 和逐步失去内聚力配合, 以解决交叉之间的同系物。对这些过程进行精确的调控是保持生育力和防止染色体 missegregation 事件的必要条件, 这可能导致遗传发育障碍和自发性流产1。

虽然减数分裂的关键事件发生在男性和女性, 重要的时间和机械差异之间存在精子生成和卵子2。例如, 在女性减数分裂期间, 我发生在胚胎发育和 dictyate 阶段的逮捕, 直到青春期。相比之下, 精子发生在青春期就开始了, 在成年生活中也没有被逮捕。男性和女性减数分裂的区别强调需要制定方法, 专门用于评估这些过程在精和卵母细胞。目前, 评估减数分裂的进展主要依赖于使用染色质传播3,4,5。虽然染色质传播是有用的研究减数分裂染色体, 他们不能保持细胞完整性, 防止评估细胞结构, 如纺锤微管, 体, 核包络, 和端粒附着。活体成像和长期培养技术大大提高了我们对女性减数分裂的认识;然而, 类似的方法来可视化整个完整的细胞, 不太经常实施的研究的精子发生6,7。为了在整个雄性减数分裂中可视化动态事件, 我们已经适应了已建立的小管壁技术, 以快速评估开发鼠标精8,9的细胞学特征。这里描述的方法保持细胞的完整性, 使研究多细胞结构在不同阶段的精子发生。

这种小管壁技术是一种完整的细胞方法, 可以通过免疫荧光显微镜对细胞结构进行评估。常见的组织学方法, 以可视化的雄性小鼠减数分裂进展, 如苏木和曙红染色石蜡嵌入睾丸, 和荧光标记 cryosections 允许广泛的概述减数分裂进展。但是, 这些技术无法将单个单元格解析为对整个减数分裂1011中发生的事件进行详细分析所必需的程度。可视化减数分裂过程的替代技术依赖于对精的重大 chemiosmotic 中断来隔离和修复核材料3,4,5。这些化学处理阻碍了除原精以外的细胞类型的观察。Namekawa 最近描述的一种方法使研究界能够保护孤立精的核结构, 但需要使用一些实验室4可能不容易获得的 cytospin 和附件。相比之下, 小管壁技术只需要在大多数细胞生物学实验室中通常是标准的设备。

这里描述的小管壁方法可以用来可视化在精曲管内发现的各种细胞类型, 包括支持细胞, 精, 初级和次级精, 和精子。通过将这一技术与幼鼠精子发生的近同步第一波结合起来, 在通过减数分裂12的过程中, 可以获得生精细胞的富集种群。这一过程允许详细分析整个精子发生过程, 如早期前期事件, G2/MI 和中期到后期过渡, 和精子。此外, 小管壁的准备可用于可视化的细胞学特征的染色体 (如 interchromatid 域 (服务) 和 kinetochores) 和体 (中心和 pericentriolar 材料/矩阵)。壁球法可以很容易地与其他实验方法, 如染色质传播和蛋白质提取并行执行。此外, 该技术已成功地修改, 以存放活体生精细胞的幻灯片直接可视化13。

本文所述方法涉及一种全细胞精管壁球技术, 用于分析野生型 C57BL/6J 小鼠的 G2/MI 转变。用免疫荧光显微镜观察了初级精进入第一减数分裂的细胞学特征, 以观测减数分裂纺锤体。这种多才多艺的技术可以很容易地修改, 以可视化其他减数分裂阶段和不同的细胞类型。该技术还可用于替代的可视化策略, 如 DNA 和 RNA 鱼的方法。

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方案

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约翰·霍普金斯大学机构动物保育和使用委员会批准了对老鼠的使用。利用半同步第一波精子发生的方法, 对小鼠 (20-26 天产后、民进党) C57BL/6J 进行了实验。然而, 这种技术也可以使用成年小鼠进行。

1. 小鼠输精管解剖和分离

  1. 准备表 1和表 2中描述的修复/溶解解决方案和抗体稀释缓冲 (ADB)。
  2. 准备一个35毫米的培养皿, 3 毫升的1x 磷酸缓冲盐水 (1x PBS, pH 7.4), 和另一个35毫米的菜, 每只老鼠2毫升的固定/溶解溶液。
  3. 通过颈部脱位或 CO2窒息, 用70% 乙醇喷洒腹腹部。用无菌剪刀打开盆腔, 形成 V 形开口。然后用镊子拔出附睾脂肪垫, 避免扰乱白。将睾丸放在含有 1x PBS 的35毫米培养皿中。
    注意:利用第一波的精子发生, 以观察丰富的细胞人口的利益14。在不同的小鼠年龄 (表 3) 丰富了精子发生的特定阶段。
  4. 用锋利的尖刺钳刺穿组织, 取出睾丸的白, 并收集松散的精小管。将小管转移到新的35毫米培养皿中, 其中含有2毫升的固定/溶解液。
  5. 在室温下孵育5分钟的固定/溶解液中的小管。

2. 生精小管的制备

  1. 通过用液体阻挡笔勾勒出幻灯片的边缘, 准备一张多聚 l-赖氨酸涂层玻璃玻片。
  2. 将100µL 的固定/溶解液应用于玻璃滑板的中心。
  3. 用无菌钳和剪刀轻轻地把生精小管分开。切割长的单个小管段约20毫米的长度。
    注意:为了可视化对长时间固定暴露敏感的结构, 如体, 在 1x PBS 中先分离小管, 然后直接将在100µL 的聚赖氨酸片表面上的小管剁碎。
  4. 将五 20 mm 长的生精小管段转移到含有固定/溶解溶液的制备的多聚 l-赖氨酸涂层玻璃玻片上。
  5. 用无菌剪刀把生精小管分成1.5 到3.0 毫米的部分。
  6. 用无菌钳将小管段排列在玻片上, 使无组织重叠, 小管分布均匀。
    注意:在玻片上的小管段的最佳数目是在20和40之间。

3. 生精小管的挤压

  1. 将含有分散的生精小管段的玻璃玻片转移到台式上。使用实验室擦拭去除多余的液体, 避免在壁球过程中丢失组织。
  2. 将片 (22 x 60-1.5 mm) 涂抹在玻璃片的顶部, 用手掌的脚跟按压 10-20 秒。从生精小管中应用足够的力来分散精是很重要的。
    注意:用解剖显微镜观察小管, 以优化挤压步骤, 使所有的管节都受到破坏。
  3. 使用滑动钳, 立即闪光冻结玻璃在一个小杜瓦瓶的液体 N2 15 秒, 或直到液体停止起泡。如果 immunolabeling 立即, 删除片与直刃刀片, 罚款尖端钳或21口径针。
    注意:为了获得最佳结果, 请立即 immunolabel 幻灯片 (请参见步骤 4)。然而, 在这一点上, 幻灯片可以保存在-80 ° c 最多两周。为了最大限度地延长蛋白质和细胞结构的寿命, 立即将幻灯片存储在干冰上或转移到-80 ° c 的冰箱, 并将片放在幻灯片上。当 immunolabeling 存储幻灯片时, 如步骤3.3 所述, 将幻灯片浸泡在液态 N2中15秒, 以删除片。

4. Immunolabeling 的生精小管

  1. 在 1x pbs 中浸泡幻灯片, 并在包含 1x pbs 的50毫升 Coplin 罐中洗涤三次, 5 分钟。
    注意:不要让幻灯片完全干燥在 immunolabeling。
  2. 将1毫升的抗体稀释缓冲液涂抹在玻片上, 在湿化室中对 1-2 h 进行阻挡。
  3. 去除抗体稀释缓冲液, 在湿化室中应用抗体稀释缓冲液中稀释的原抗体100µL。
    注意:为取得最佳效果, 在4° c 的夜间孵育主抗体。使用较小数量的抗体 (例如50 µL), 用片或膜覆盖该幻灯片。验证和优化主抗体15。
  4. 冲洗幻灯片三次5分钟, 在50毫升 Coplin 罐含有 1x PBS。
    注意:为了增强洗涤, 使用小的磁性搅拌棒, 在低速的磁性搅拌板上搅拌 Coplin 罐, 或在低速时将 Coplin 罐放在台式搅拌机上。
  5. 在室温下, 在湿化室内应用100µL 抗体稀释缓冲液中的二次抗体稀释1至 1.5 h。在一个黑暗的盒子中孵育幻灯片, 以避免荧光共轭抗体的照片漂白。
    注意:使用较小数量的抗体 (例如50 µL), 用片或膜覆盖该幻灯片。
  6. 在含有 1x PBS 的50毫升 Coplin 罐中, 冲洗两次幻灯片5分钟。
  7. 将幻灯片装入包含 4 "、6-diamidino-2-吲 (DAPI、1.5 µg/mL) 的安装介质中, 并应用片 (22 x 60-1.5 mm)。
  8. 用清晰的指甲油将片密封在幻灯片上, 以保存幻灯片, 防止片移动。

5. 分析和成像小管壁球准备

  1. 使用荧光显微镜与自动化阶段, 使精确的 Z 轴运动和高分辨率相机的图像捕捉。或者, 使用激光共聚焦显微镜。
    注意:在此步骤中使用任何可用的硬件和软件。例如, 在图 1和图 2中显示的图像是使用蔡司单元观察器 Z1 链接到一个虎鲸-闪光 4.0 CMOS 相机, 并与蔡司禅宗2012蓝色版图像软件进行分析。
  2. 使用20X 目标评估幻灯片, 以确定壁球准备的质量。质量好的幻灯片具有均匀分布的单层原子核。
    注意:幻灯片的某些部分可能比其他章节更好, 因此可以在使用更高的放大倍数的情况下, 找到幻灯片的最佳区域的坐标, 以便进一步分析。
  3. 使用更高的放大率目标 (例如63X 或 100X), 捕获具有一致单层核的幻灯片区域。选定区域后, 设置上部和下部 Z 堆栈, 以确保捕获所有聚焦光。
    注意:在上限和下限之间捕获的 Z 栈的最优数通常由图像采集软件指定, 对每个目标都是不同的。
  4. 使用图像处理软件来编译一个扩展的深度聚焦图像。该软件结合了聚焦光从每个 Z 栈, 是必不可少的最佳成像小管壁的准备工作。

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结果

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在这里, 我们使用小管壁的方法, 以可视化的过渡细胞人口经历前期到中期 I (G2/MI) 转变, 这是丰富的收获睾丸从幼鼠的第一波精子发生 (24民进党)。图 1描述了可以使用小管壁方法可视化的各种细胞阶段的代表性图像。中期 I 精的富集种群是使用抗α-蛋白 (图 1A) 的抗体可视化的。我们利用标记的早期和晚期减数分裂 I 阶段减数分裂的进展。小管壁的准备是 immunolabeled 与抗体的联会复合蛋白, SYCP3, 以可视化阶段前期 i. 期/偶和线/双精显示在图 1B。精进行第一次减数分裂可以清楚地识别使用抗体对α-蛋白(图 1A 和1C)。为了研究晚期减数分裂事件, 小管南瓜 immunolabeled 使用抗体对细胞周期激酶极光 B (AURKB), ...

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讨论

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小鼠已被证明是一个有用的模型有机体研究的细胞事件, 控制减数分裂进程的精子发生。此外, 有必要开发用于研究精子发生的工具, 因为许多事件, 如减数分裂前期 I 的退出, 都是性二。本协议描述了一种用于小鼠精子发生不同阶段可视化和研究的精曲管壁法。这种方法保留细胞完整性, 从而允许详细分析核和细胞质结构。本研究的代表性结果表明该协议在评估初级精减数分裂进程中的效用。此外, 该协议还可用于研究精子发生过程中的其他细胞过程, 包括精的增殖和分化以及精子27,28的各个阶段。所描述的方法是从以前描述的小管壁技术8,9中改编的。然而, 该协议是第一个详细的指南, 涵盖所有的试剂和步骤所需的, 从获得小管到可视化单细胞通过荧光显微镜。此外, 我们还提供了更多的细胞功能的图像, 包括中心和端粒花束, 可以用这种技术来可视化。

对于优化小管壁的制备, 有几个关键的技...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了研究院 (R01GM11755) 对 P.W.J. 的支持, 以及由国家癌症研究所 (NIH) (CA009110) 向 S.R.W. 和 j.h 提供的培训补助金奖学金。
 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 多聚甲醛 水性电子显微镜科学 （EMS）15710
10x PBS质量 生物119-069-161
Triton X-100SigmaT8787
BSASigmaA1470
马血清SigmaH-1270
35 mm x 10 mm 培养皿，无菌，未处理CellTreatP886-229638
聚-L-赖氨酸涂层载玻片SigmaP0425-72EA
液体封闭笔电子显微镜科学 （EMS）71310
加湿箱Evergreen240-9020-Z10
Wheaton Coplin 玻璃染色皿，用于 5 或 10 张载玻片Fisher08-813E
VECTASHIELD 抗淬灭安装含 DAPIVector LabsH-1200
显微镜盖玻片的培养基 （22mmx60mm）Fisher12-544-G
透明指甲油N/A
Microsopes
名称Company目录号评论
>SteREO Discovery.V8蔡司495015-0001-000 
观察者Z1蔡司4109431007994000
蔡司 ZEN 2012 蓝色版图像软件蔡司
ORCA-Flash 4.0 CMOS 相机滨松
<强>一抗
<强>名称公司目录号注释
小鼠抗 SYCP3Santa Cruzsc-745691 分 50
兔抗 SYCP3Fisher （Novus）NB300-2311 分 1000
只山羊抗 SCP3Santa Cruzsc-208451 分 50
人抗着丝点蛋白抗体掺入15-235分 100
小鼠抗 α 微管蛋白SigmaT90261 分之 1000
小鼠抗 AIM1BD Biosciences6110821/200
小鼠抗 γ;H2AXThermo FisherMA1-20221 分 500
小鼠抗 CENT3抗体 AbnovaH00001070-M011 分 200
兔抗中心粒Abcam ab44481 分 200
兔抗 REC8由  Karen Schindler 博士提供 N/A 1分之 1000
亚马逊 1

参考文献

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