本方案为有兴趣开展基于全基因组芯片的比较基因组杂交（CGH）分析以研究植物中拷贝数变异的研究人员，提供了实验步骤以及有关试剂、仪器和分析工具的信息。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
突变体是基因功能研究中不可或缺的遗传资源。为构建突变体库，可采用三类诱变剂：生物类（如T-DNA或转座子）、化学类（如甲基磺酸乙酯，EMS）以及物理类（如电离辐射）。不同诱变剂所引发的突变类型各异。由电离辐射诱导产生的突变包括缺失、重复或重排。基于T-DNA或转座子的诱变方法仅适用于可转化的物种，而化学或物理诱变则可广泛应用于多种物种。然而，传统上对化学或物理诱变所产生的突变体进行鉴定依赖于基于遗传图谱的克隆方法，该方法耗时且劳动强度大。本文表明，基于高密度基因组芯片的比较基因组杂交（aCGH）技术平台可有效用于检测和鉴定由快中子轰击（FNB）诱变产生的突变体中的拷贝数变异（CNVs） Medicago truncatula一种豆科植物。全基因组序列分析表明，其基因组中含有超过 50,000 个基因或基因模型 M. truncatula目前，由FNB诱导的突变体在 M. truncatula 源自超过 150,000 条 M1 代系，代表了基因组中基因功能研究不可或缺的遗传资源。本文所述的 aCGH 平台是鉴定 FNB 诱导突变体的有效工具 M. truncatula.
引言
豆科植物（豆科是第三大开花植物科，包含许多具有重要经济价值的物种，例如大豆（Glycine max) 和苜蓿（Medicago sativa）。豆科植物可与固氮土壤细菌相互作用，这类细菌通常被称为 根瘤菌 形成根瘤，将大气中的氮气还原为氨，供宿主植物利用。因此，豆科作物的种植对氮肥的需求较低，有助于可持续农业的发展。豆科作物的叶片和种子富含蛋白质，是优良的饲用和粮食作物。然而，栽培豆科物种的基因组结构通常较为复杂，使得对参与豆科特有过程的关键基因进行功能研究变得繁琐困难。 Medicago truncatula 已被广泛采纳为豆科植物研究的模式物种，主要原因包括：（1）其具有二倍体基因组，且单倍体基因组大小相对较小（约550 Mbp）；（2）可对植株进行稳定遗传转化，适用于基因功能研究；（3）与苜蓿（alfalfa）具有较近的亲缘关系M. sativa），被誉为牧草之王，以及许多其他具有重要经济价值的作物，用于转化研究。最近，其基因组序列已公布。 M. truncatula cv Jemalong A17 已发布1,2基因组注释显示，该基因组中包含超过50,000个预测基因或基因模型。为了确定其中大多数基因的功能 M. truncatula 基因组研究是一项具有挑战性的任务....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：图1展示了阵列CGH实验方案的五个步骤，分别为：1）植物材料的准备；2）高质量DNA样本的提取；3）DNA样本的标记与纯化；4）全基因组芯片的杂交、洗涤与扫描；以及5）CGH数据分析。M. truncatula 全基因组平铺芯片共包含971,041个独特的寡核苷酸探针，覆盖基因组中超过50,000个基因或基因模型（见材料表）。这些独特探针在M. truncatula基因组的外显子区域平均每150个碱基对（bp）分布一个，内含子区域则平均每261个碱基对分布一个。
1. 植物材料的准备
- 用浓硫酸对野生型（WT；M. truncatula cv Jemalong A17）和FN6191突变体种子进行破皮处理，持续8分钟（参见材料表）。将硫酸移除并弃入液体废液容器中。
- 用高压灭菌的去离子水冲洗种子三次。
- 用20%次氯酸钠溶液对种子进行表面灭菌，持续10分钟。
- 用高压灭菌的去离子水冲洗种子三次。
- 将种子在4 °C下保存3天。春化处理后，将种子转移至土壤中，在培养室中萌发一周，培养条件为16小时光照/8小时黑暗循环，光照强度为150 µE/m2/s。
- 将幼苗....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图2展示了全基因组范围内突变体与野生型（WT）信号的标准化log2比值分布。CGH数据分析揭示，在FN6191突变体中，4号染色体上存在一个约22 kb的缺失，该缺失区域包含完整的SUNN基因33以及多个其他已注释的基因（图2，图3）。该候选缺失区域在芯片上由73个连续探针覆盖，其平均标准化log2比值低于-2.5（补充表1）。对缺失边界进行分析后推测，该突变体中的假定缺失区域两侧分别为位于4号染色体坐标22,313,168和22,334,934之间的探针所界定（图3）。为验证缺失边界，设计了距离预测缺失边界约1,500 bp的PCR引物（FN6191-DB-F：GCTAGCAAGGGTCTGC.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们开发了一种基于芯片的比较基因组杂交（CGH）平台，用于检测和鉴定快中子轰击（FNB）诱导的M. truncatula cv. Jemalong A17突变体。为了展示芯片CGH方法在基因突变检测中的应用，我们对突变体FN6191进行了aCGH分析，该突变体在接种S. meliloti Sm1021后表现出相较于野生型植株过度结瘤的表型。在分割分析中，若某片段内探针的log2比值均值高于该次芯片比较的上限阈值或低于下限阈值，则该片段被视为显著。每次比较的上限阈值设定为所有数据点log2比值第95百分位数的数值，下限阈值设定为所有数据点log2比值第5百分位数的数值24。
我们的分析表明，通过检索平均标准化 log2 比值高于或低于总体平均值 2.5 个标准差（SD）的片段，可确定显著的拷贝数变化（高于为重复，低于为缺失）。根据比较基因组杂交（CGH）分析，我们在 4 号染色体上检测到一个估计大小为 22 kb .......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作的部分经费由美国国家科学基金会植物基因组研究项目（IOS-1127155）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Medicago truncatula 基因组芯片，1 x 1 M | 安捷伦 | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191（突变体） | 内部 | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17（参考） | 内部 | A17 | |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy植物微型试剂盒 | Qiagen | 69104 | |
| NanoDrop 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 1000D | |
| SureTag DNA标记试剂盒 | 安捷伦 | 5190-3400 | |
| 随机引物 | 安捷伦 | 5190-3399 | |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| PCR仪 | MJ 研究 | PTC-200 | |
| 离心 | Labnet International Inc | Spectrafuge 24D | |
| 稳定与干燥溶液 | 安捷伦 | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交试剂盒 | 安捷伦 | 5188-5380 | |
| 杂交室密封垫片载玻片 | 安捷伦 | G2505 | |
| 人类Cot-1 DNA | 安捷伦 | 5190-3393 | |
| 寡核苷酸aCGH/ChIP-芯片洗涤缓冲液1和2 | 安捷伦 | 5188-5221 | |
| 杂交室，不锈钢材质 | 安捷伦 | G2534A | |
| 杂交炉 | 安捷伦 | G2545A | |
| 纯化柱 | 安捷伦 | 5190-3391 | |
| 激光扫描仪 | 罗氏 | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | 罗氏NimbleGen | 5225035001 | |
| 信号图 1.9 | 罗氏NimbleGen | Signalmap1.9 |
参考文献
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312(2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
