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方法文章

一种基于芯片的比较基因组杂交平台用于高效检测快中子诱变的Medicago truncatula突变体中的拷贝数变异

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DOI：

10.3791/56470

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2017年11月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

本文内容

摘要

本方案为有兴趣开展基于全基因组芯片的比较基因组杂交（CGH）分析以研究植物中拷贝数变异的研究人员，提供了实验步骤以及有关试剂、仪器和分析工具的信息。

摘要

突变体是基因功能研究中不可或缺的遗传资源。为构建突变体库，可采用三类诱变剂：生物类（如T-DNA或转座子）、化学类（如甲基磺酸乙酯，EMS）以及物理类（如电离辐射）。不同诱变剂所引发的突变类型各异。由电离辐射诱导产生的突变包括缺失、重复或重排。基于T-DNA或转座子的诱变方法仅适用于可转化的物种，而化学或物理诱变则可广泛应用于多种物种。然而，传统上对化学或物理诱变所产生的突变体进行鉴定依赖于基于遗传图谱的克隆方法，该方法耗时且劳动强度大。本文表明，基于高密度基因组芯片的比较基因组杂交（aCGH）技术平台可有效用于检测和鉴定由快中子轰击（FNB）诱变产生的突变体中的拷贝数变异（CNVs） Medicago truncatula一种豆科植物。全基因组序列分析表明，其基因组中含有超过 50,000 个基因或基因模型 M. truncatula目前，由FNB诱导的突变体在 M. truncatula 源自超过 150,000 条 M1 代系，代表了基因组中基因功能研究不可或缺的遗传资源。本文所述的 aCGH 平台是鉴定 FNB 诱导突变体的有效工具 M. truncatula.

引言

豆科植物（豆科是第三大开花植物科，包含许多具有重要经济价值的物种，例如大豆（Glycine max) 和苜蓿（Medicago sativa）。豆科植物可与固氮土壤细菌相互作用，这类细菌通常被称为 根瘤菌 形成根瘤，将大气中的氮气还原为氨，供宿主植物利用。因此，豆科作物的种植对氮肥的需求较低，有助于可持续农业的发展。豆科作物的叶片和种子富含蛋白质，是优良的饲用和粮食作物。然而，栽培豆科物种的基因组结构通常较为复杂，使得对参与豆科特有过程的关键基因进行功能研究变得繁琐困难。 Medicago truncatula 已被广泛采纳为豆科植物研究的模式物种，主要原因包括：（1）其具有二倍体基因组，且单倍体基因组大小相对较小（约550 Mbp）；（2）可对植株进行稳定遗传转化，适用于基因功能研究；（3）与苜蓿（alfalfa）具有较近的亲缘关系M. sativa），被誉为牧草之王，以及许多其他具有重要经济价值的作物，用于转化研究。最近，其基因组序列已公布。 M. truncatula cv Jemalong A17 已发布1,2基因组注释显示，该基因组中包含超过50,000个预测基因或基因模型。为了确定其中大多数基因的功能 M. truncatula 基因组研究是一项具有挑战性的任务。为了促进基因功能研究，已构建了包含超过150,000个突变体的系统性突变体库1 利用快速中子轰击（FNB）诱变技术已产生突变株系 M. truncatula cv Jemalong A173,4快中子是一种高能电离诱变剂，已用于多种植物物种的突变体创制，包括 拟南芥5,6，水稻（Oryza sativa)7，番茄（Solanum lycopersicum）、大豆（Glycine soja; G. max)8,9，大麦（大麦），以及 Lotus japonicus10. FNB诱变产生的大部分突变源于DNA片段的缺失，缺失大小从几个碱基对到兆碱基对不等9,11许多与表型相关的基因已被成功鉴定和表征4,12,13,14,15,16,17,18,19过去，从FNB突变体中进行潜在基因的分子克隆依赖于基于图谱的方法，该方法耗时较长，且限制了可在分子水平上进行表征的突变体数量。近年来，已采用多种互补性方法以促进在包括动物和植物在内的多种生物中对缺失突变体的鉴定，这些方法包括基于转录本的分析、基于基因组平铺阵列的比较基因组杂交（CGH）用于检测DNA拷贝数变异，以及全基因组测序20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31.

为了促进对M. truncatula中FNB突变体的表征，已开发并验证了一种基于全基因组芯片的比较基因组杂交（CGH）平台。如在动物系统中所报道的，基于芯片的CGH平台能够在全基因组水平上检测M. truncatula FNB突变体中的拷贝数变异（CNVs）。此外，可通过PCR确认突变位点，并通过测序确定缺失边界的精确位置。总体而言，芯片CGH平台是鉴定M. truncatula FNB突变体中遗传损伤的一种高效且可靠的工具。本文以一个M. truncatula FNB突变体为例，展示了芯片CGH实验流程以及缺失边界区域的PCR鉴定方法。

以下实验方案为希望开展基于全基因组芯片的比较基因组杂交（CGH）分析以研究植物拷贝数变异的研究人员提供了详细的实验步骤以及有关试剂、仪器和分析工具的信息。以蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）FN6191突变体为例，用于鉴定与突变表型相关的缺失区域及候选基因。M. truncatula FN6191突变体最初来源于快速中子轰击诱导的缺失突变体库32（见材料表），在接种土壤细菌Sinorhizobium meliloti Sm1021后表现出超结瘤表型，而野生型植物则无此表型。

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方案

注意：图1展示了阵列CGH实验方案的五个步骤，分别为：1）植物材料的准备；2）高质量DNA样本的提取；3）DNA样本的标记与纯化；4）全基因组芯片的杂交、洗涤与扫描；以及5）CGH数据分析。M. truncatula 全基因组平铺芯片共包含971,041个独特的寡核苷酸探针，覆盖基因组中超过50,000个基因或基因模型（见材料表）。这些独特探针在M. truncatula基因组的外显子区域平均每150个碱基对（bp）分布一个，内含子区域则平均每261个碱基对分布一个。

1. 植物材料的准备

  1. 用浓硫酸对野生型（WT；M. truncatula cv Jemalong A17）和FN6191突变体种子进行破皮处理，持续8分钟（参见材料表）。将硫酸移除并弃入液体废液容器中。
  2. 用高压灭菌的去离子水冲洗种子三次。
  3. 用20%次氯酸钠溶液对种子进行表面灭菌，持续10分钟。
  4. 用高压灭菌的去离子水冲洗种子三次。
  5. 将种子在4 °C下保存3天。春化处理后，将种子转移至土壤中，在培养室中萌发一周，培养条件为16小时光照/8小时黑暗循环，光照强度为150 µE/m2/s。
  6. 将幼苗移栽至1加仑的花盆中，在温室中继续培养3至4周，光照条件为16小时光照/8小时黑暗循环，光照强度为150 µE/m2/s。从植株上采集幼嫩叶片样品用于DNA提取。

2. 高质量DNA样本的提取

  1. 取单株植物的1 g幼嫩叶片组织，立即放入液氮中冷冻。
  2. 在液氮中用研钵和研杵将冷冻的叶片组织研磨成细粉。
  3. 使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA（参见 材料表).
  4. 将纯化的DNA样品重悬于50 µL经高压灭菌的双蒸去离子H₂O中2O (ddH₂O)2O）或1× TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.0）。
  5. 使用分光光度计测定DNA浓度（参见 材料表).
  6. 评估DNA样本的260 nm/280 nm和260 nm/230 nm比值。
    注意：高质量的DNA样品其260 nm/280 nm吸光度比值应≥1.8，260 nm/230 nm吸光度比值应≥2.0。
  7. 通过1%琼脂糖凝胶电泳进一步评估DNA样本。
    注意：高质量的DNA样品应具有高分子量，且不应被RNA污染。理想情况下，DNA样品的最终浓度应约为150 ng/µL。

3. DNA标记与纯化

  1. 在500 µL离心管中，将1 µg基因组DNA样品用ddH2O稀释至终体积20 µL。
  2. 向管中加入5 µL随机引物（见材料表）。
  3. 短暂涡旋混匀管内液体，并将其放入热循环仪中，在98 °C下孵育并变性DNA 10分钟。
  4. 从热循环仪中取出管子，立即置于冰水中冷却5分钟。
  5. 按照表1所示配制两种标记混合液。
  6. 分别向参考DNA管和样品DNA管中加入25 µL标记混合液1和标记混合液2。
  7. 通过移液吹打三次混匀标记混合液与DNA，并短暂离心管子。
  8. 将管子放入热循环仪中，在37 °C孵育2小时，随后在65 °C孵育20分钟以灭活exo-Klenow酶（见材料表）。
  9. 向每根管中加入430 µL 1x TE缓冲液。
  10. 混匀管内成分，并短暂离心。
  11. 将管中的溶液转移至带有2 mL收集管的纯化柱中（见材料表）。
  12. 在14,000 x g下离心纯化柱10分钟。
  13. 弃去穿流液。
  14. 向每个纯化柱中加入480 µL 1x TE缓冲液。
  15. 再次在14,000 x g下离心柱子10分钟。
  16. 弃去穿流液。
  17. 将仍留在纯化柱底部的标记DNA样品转移至新的离心管中。
  18. 使用移液器测量标记DNA样品的体积，并用1x TE缓冲液补足至终体积80 µL。
  19. 使用分光光度计测量标记DNA样品的浓度（见材料表）。
  20. 取等量的标记样品DNA和参考DNA混合，并用 1x TE缓冲液补足至终体积160 µL。
  21. 加入256 µL 2x杂交缓冲液、50 µL人Cot-1 DNA和50 µL 10× aCGH封闭剂（见材料表），并通过移液吹打三次充分混匀。
  22. 短暂离心管子，然后将其放入热循环仪中，在98 °C孵育10分钟。
  23. 在37 °C下继续孵育管子20分钟。

4. 基因组芯片的杂交、洗涤与扫描

  1. 在杂交开始前至少4小时，将杂交炉预热至67 °C。
  2. 将密封垫片放置于杂交室底部的基座上。
  3. 从步骤3.23中取490 µL杂交溶液，加入到密封垫片上。
  4. 用Medicago truncatula基因组微阵列芯片覆盖密封垫片，形成杂交室。
  5. 盖上杂交室盖板，并用夹具牢固固定。
  6. 将组装好的杂交室放入杂交炉中，在67 °C下孵育40–48小时。
  7. 准备三个载玻片清洗皿：其中两个各加入250 mL室温的洗涤缓冲液I，另一个加入37 °C预热的洗涤缓冲液II。
  8. 准备两个载玻片清洗瓶：一个加入70 mL乙腈，另一个加入70 mL稳定与干燥溶液；两者均置于通风橱中室温保存（参见材料表）。
  9. 从杂交炉中取出杂交室，拆下夹具并打开盖板。
  10. 将微阵列芯片连同密封垫片转移至盛有洗涤缓冲液I的清洗皿中，分离芯片与盖玻片。
  11. 将微阵列芯片转移至第二个盛有洗涤缓冲液I的清洗皿中，在室温下使用磁力搅拌器轻轻搅拌5分钟。
  12. 将微阵列芯片转移至第三个盛有预热洗涤缓冲液II的清洗皿中，在37 °C下使用磁力搅拌器轻轻搅拌1分钟。
  13. 将微阵列芯片转移至通风橱中盛有乙腈的清洗瓶中，清洗30秒。
  14. 将微阵列芯片转移至盛有稳定与干燥溶液的清洗瓶中，清洗30秒。
  15. 缓慢取出芯片，干燥1分钟。
  16. 使用扫描仪（参见材料表）在2 µm分辨率下扫描微阵列芯片。设置参数以保存多幅图像和全片扫描图像。将通道1和通道2的增益设为100%，并关闭自动增益功能。

5. CGH 数据分析

  1. 使用扫描软件（参见材料表）提取芯片上每个探针的Cy3和Cy5荧光强度。
  2. 利用软件的分割分析功能检测样本DNA与参考DNA之间的拷贝数变异（CNVs）。以片段平均log2 样本/参考比值 ± 2.5个标准差为阈值来确定CNVs。
  3. 使用信号作图软件检查log2 样本/参考比值在整个基因组中的分布情况（参见材料表）。

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结果

图2展示了全基因组范围内突变体与野生型（WT）信号的标准化log2比值分布。CGH数据分析揭示，在FN6191突变体中，4号染色体上存在一个约22 kb的缺失，该区域包含完整的SUNN基因33以及多个其他已注释的基因（图2，图3）。该候选缺失区域被芯片上的73个连续探针覆盖，其平均标准化log2比值小于-2.5（补充表1）。对缺失边界区域的分析表明，该突变体中的推测缺失区域两侧分别为位于4号染色体坐标22,313,168和22,334,934之间的探针所界定（图3）。为验证缺失边界，设计了距离预测缺失边界约1,500 bp的PCR引物（FN6191-DB-F：GCTAGCAAGGGTCTGCGC...

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讨论

我们开发了一种基于芯片的比较基因组杂交（CGH）平台，用于检测和鉴定快中子轰击（FNB）诱导的M. truncatula cv. Jemalong A17突变体。为了展示芯片CGH方法在基因突变检测中的应用，我们对突变体FN6191进行了aCGH分析，该突变体在接种S. meliloti Sm1021后表现出相较于野生型植株过度结瘤的表型。在分割分析中，若某片段内探针的log2比值均值高于该次芯片比较的上限阈值或低于下限阈值，则该片段被视为显著。每次比较的上限阈值设定为所有数据点log2比值第95百分位数的数值，下限阈值设定为所有数据点log2比值第5百分位数的数值24。

我们的分析表明，通过检索平均标准化 log2 比值高于或低于总体平均值 2.5 个标准差（SD）的片段，可确定显著的拷贝数变化（高于为重复，低于为缺失）。根据比较基因组杂交（CGH）分析，我们在 4 号染色体上检测到一个估计大小为 22 kb ...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作的部分经费由美国国家科学基金会植物基因组研究项目（IOS-1127155）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Medicago truncatula 基因组芯片，1 x 1 M安捷伦G4123A
Medicago truncatula FN6191（突变体）内部FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17（参考）内部A17
硫酸Sigma-Aldrich320501
DNeasy植物微型试剂盒Qiagen69104
NanoDrop 分光光度计赛默飞世尔科技1000D
SureTag DNA标记试剂盒安捷伦5190-3400
随机引物安捷伦5190-3399
乙腈Sigma-Aldrich271004-1L
PCR仪MJ 研究PTC-200
离心Labnet International IncSpectrafuge 24D
稳定与干燥溶液安捷伦5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交试剂盒安捷伦5188-5380
杂交室密封垫片载玻片安捷伦G2505
人类Cot-1 DNA安捷伦5190-3393
寡核苷酸aCGH/ChIP-芯片洗涤缓冲液1和2安捷伦5188-5221
杂交室，不锈钢材质安捷伦G2534A
杂交炉安捷伦G2545A
纯化柱安捷伦5190-3391
激光扫描仪罗氏MS200
NimbleScan 2.6罗氏NimbleGen5225035001
信号图 1.9罗氏NimbleGenSignalmap1.9

参考文献

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312(2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402(2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381(2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203(2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

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