Method Article

一种基于阵列的比较基因组杂交平台, 有效检测快中子诱导的苜蓿蒺藜突变体的拷贝数变化

DOI:

10.3791/56470

⸱

November 8th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议提供了实验步骤和有关试剂、设备和分析工具的信息, 这些研究人员有兴趣执行整个基因组阵列的比较基因组杂交 (计算全息) 对拷贝数变化的分析植物.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

突变体是基因功能研究的宝贵的遗传资源。为了产生突变体集合, 可利用三种诱变, 包括生物如 T-脱氧核糖核酸或转, 化学物质如甲基磺酸乙酯 (EMS), 或物理如电离辐射。所观察到的突变类型因所使用的诱变而异。对于电离辐射诱发突变体, 突变包括删除, 重复, 或重排。虽然 T-DNA 或 transposon-based 诱变仅限于易受转化的物种, 但化学或物理诱变可应用于种类繁多的物种。然而, 从化学或物理诱变衍生的突变的定性传统上依赖于地图的克隆方法, 这是劳动密集型和耗时。在这里, 我们表明, 一个高密度基因组阵列的比较基因组杂交 (aCGH) 平台可用于有效地检测和表征拷贝数变异 (cnv) 的突变从快中子轰击 (FNB) 突变中获得的苜蓿蒺藜, 豆科植物。整个基因组序列分析显示, 在m 蒺藜中有超过5万基因或基因模型。目前, FNB 诱发突变体的m. 蒺藜是从超过 15万 M1 线, 代表了宝贵的基因资源的功能研究的基因组。这里描述的 aCGH 平台是一个有效的工具, 用于表征 FNB 诱导突变体在m 蒺藜。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

豆类 (豆科) 是第三大家族的开花植物, 与许多经济上重要的物种, 如大豆 (甘氨酸 max) 和苜蓿 (苜蓿)。豆科植物可以与固氮土壤细菌相互作用, 通常称为根瘤菌来发展根结节, 将大气氮减少到氨供寄主植物使用。因此, 种植豆类作物需要很少的氮肥投入, 从而有助于可持续农业。豆类作物生产的叶子和种子的高蛋白含量, 作为优良的饲料和谷物作物。然而, 种植豆科植物通常有复杂的基因组结构, 使功能研究的基因发挥关键作用在豆类特定的过程繁琐。苜蓿蒺藜已被广泛采用为豆科植物的模型, 主要是因为 (1) 它有一个相对较小的单倍体基因组大小 (~ 550) 的二倍体基因组;(2) 植物可稳定转化为基因功能研究;和 (3) 它与紫花苜蓿 (m), 牧草皇后, 和许多其他经济重要的农作物的转化研究密切相关。最近, m 蒺藜cv Jemalong A17 的基因组序列已被释放12。对基因组的诠释显示, 基因组中有超过5万预测基因或基因模型。要确定m 蒺藜基因组中大多数基因的功能是一项具有挑战性的任务。为了促进基因的功能研究, 在 15万 M1线范围内, 利用快中子轰击 (FNB) 诱变, 在m. 蒺藜cv Jemalong A173中生成了一组突变体的综合集合.,4。快中子, 高能电离诱变, 已被用于在许多植物物种中生成突变体, 包括拟南芥5,6, 大米 (水稻品种)7, 西红柿 (茄汁番茄), 黄豆 (甘氨酸大豆;G. max)8,9, 大麦 (大麦大麦), 和莲花日本人10。从 FNB 诱变衍生出的很大一部分突变是由于 DNA 的缺失, 其范围从几个碱基对到巨型碱基对9,11。许多表型相关基因已被成功识别并具有特征4、12、13、14、15、16、17,18,19. 以前, FNB 突变体的潜在基因的分子克隆依赖于地图的方法, 这是时间消耗和限制分子水平的突变体数量。最近, 一些免费的方法, 包括 transcript-based 方法, 基因组平铺阵列的比较基因组杂交 (计算全息) 的 DNA 拷贝数变异检测, 和整个基因组测序, 已被用来促进不同生物体 (包括动植物) 中缺失突变体的特征20,21,22,2324,25 26,27,28,29,30,31。

为了便于在m. 蒺藜中对 FNB 突变体的定性, 开发并验证了基于基因组的整体比较基因组杂交 (计算全息) 平台。正如在动物系统中报告的那样, 基于阵列的全息计算平台允许在m. 蒺藜FNB 突变体的整个基因组水平检测拷贝数变体 (cnv)。此外, 病变可以通过 PCR 确认和删除边界可以确定的排序。总的来说, 阵列全息计算平台是一个有效的工具, 以识别病变的m 蒺藜FNB 突变体。本文对m 蒺藜FNB 突变体的阵列全息程序和删除边界的 PCR 特征进行了说明。

以下协议提供了实验步骤和有关试剂、设备和分析工具的信息, 这些研究人员有兴趣执行整个基因组阵列的比较基因组杂交 (计算全息) 拷贝数分析植物的变异。例如,苜蓿蒺藜FN6191 突变体用于识别与突变表型相关的缺失区域和候选基因。m 蒺藜FN6191 突变体, 最初是从快中子轰击引发的删除突变的集合中分离出来的32 (参见材料表), 在接种后用土壤展示了一个超级结瘤表型细菌, Sihorhizobium 根瘤菌Sm1021, 与野生型植物形成对比。

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Protocol

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注意: 图 1 显示了数组计算全息协议的五步骤。它们是: 1) 制备植物材料;2) 分离高质量的 DNA 样本;3) DNA 样品的标记和纯化;4) 对整个基因组阵列进行杂交、冲洗和扫描;和 5) 计算全息数据分析。 m 蒺藜 整个基因组平铺阵列包含总共971041种独特的低聚体探针, 其目标是基因组中超过5万基因或基因模型 (参见 材料表 )。独特的探针间隔约每150基对 (bp) 在 exonic 地区和 261 bp 在子地区的 m 蒺藜 基因组.

1. 植物材料的制备

  1. 划破野生类型 (重量; m 蒺藜 cv Jemalong A17) 和 FN6191 突变种子, 浓缩硫酸为8分钟 (参见 材料表 )。将硫酸移至废液容器中.
  2. 用蒸压去离子水冲洗种子三次.
  3. 表面消毒20% 漂液的种子10分钟
  4. 用蒸压去离子水冲洗种子三次.
  5. 将种子储存在4和 #176; C 为3天。在春后, 在土壤中将种子在 16 h/8 h 光/暗循环和150和 #181 的生长腔中迁移和发芽一周; 电子/m 2 /秒的光照强度.
  6. 将幼苗移植到1加仑的花盆中, 在一个温室中生长 16 h/8 h 光/暗循环, 150 和 #181; 电子/m 2 /s 光强度为三周至四星期。收集来自植物的幼叶样本进行 DNA 分离.

2。高质量 DNA 样品的分离

  1. 从一株植物中提取1克幼叶组织, 并立即将其冷冻在液氮中.
  2. 在液氮中用砂浆和杵将冷冻叶组织研磨成细粉.
  3. 使用 dna 隔离套件分离基因组 dna (请参阅 材料表 ).
  4. 重50和 #181 纯化的 DNA 样品; 高压蒸双去离子 H 2 O (ddH 2 o) 或 1x TE 缓冲器 (10 毫米三盐酸, 1 毫米 EDTA, pH 7.0).
  5. 用分光光度计测量 DNA 浓度 (请参阅 材料表 ).
  6. 评估 260 nm/280 nm 和 260 nm/230 纳米 DNA 样本的比值.
    注: 高质量的 DNA 样品应具有 260 nm/280 纳米比和 #8805; 1.8 和 260 nm/230 nm 比值和 #8805; 2.0.
  7. 通过在1% 琼脂糖凝胶中运行, 进一步评估 DNA 样本.
    注: 高质量的 DNA 样品应具有较高的分子量, 不应被 RNA 污染。理想的情况下, DNA 样本的最终浓度应该是 150 ng/和 #181; L.

3。DNA 标记和纯化

  1. 稀释1和 #181; g 基因组 DNA 样品与 ddH 2 O 到最后的容量20和 #181; l 在500和 #181; l 离心管。
  2. 添加5和 #181; L 随机入门 (请参阅 材料表 ) 到管道.
  3. 涡流管短暂, 并把它放入一个 thermocycler 孵化和变性 DNA 在98和 #176; C 为 10 min.
  4. 把管子从 thermocycler 中取出, 立即放在冰水上, 冷却5分钟.
  5. 准备两个标记混合, 如下所示 表 1 .
  6. 添加25和 #181; 标记混合1和 2, 分别引用 dna 和取样 dna 管.
  7. 将标签混合和 DNA 混合移三倍, 然后简单地旋转试管.
  8. 将管子放入 thermocycler, 在37和 #176 孵育; c 为2小时, 然后在65和 #176; c 为20分钟, 使外克莱诺酶钝化 (请参阅 材料表 ).
  9. 添加430和 #181; 1x 和 #160 的 L; 每根管子的缓冲器.
  10. 混合内容并简单地旋转管子.
  11. 将管道中的溶液转换为2毫升收集管的净化柱 (请参阅 材料表 ).
  12. 离心纯化柱在 1.4万 x g 为10分钟.
  13. 放弃传递解决方案.
  14. 在每列中添加480和 #181; L 1x 和 #160; TE 缓冲区.
  15. 在 1.4万 x g 上再次离心该列10分钟.
  16. 丢弃 pass-through 解决方案.
  17. 将残留在柱底部的标记 DNA 样本转移到新的离心管上.
  18. 使用吸管测量标记的 DNA 样本的体积, 并将最后的体积带到80和 #181; L 带有 1x TE 缓冲区.
  19. 使用分光光度计测量标记的 DNA 样本的浓度 (请参见 材料表 ).
  20. 混合等量的标记样本 dna 和参考 dna, 并将最终的体积带到160和 #181; L 与 #160; 1x TE 缓冲区.
  21. 添加256和 #181; l 2x 杂交缓冲, 50 和 #181; 人类 Cot-1 DNA 和50和 #181; l 10 和 #215; aCGH 阻塞代理 (请参阅 材料表 ), 并将它们移为三次.
  22. 旋转导管并将其放入 thermocycler, 在98和 #176 中孵育; C 为 10 min.
  23. 在37和 #176 孵育试管; C 为20分钟.

4。基因组阵列的杂交、洗涤和扫描

  1. 将杂交烤箱预热到67和 #176; 在杂交开始前至少4小时.
  2. 将垫片滑动到杂交室的底部.
  3. 从步骤3.23 中加载490和 #181; L 的杂交溶液到垫片滑动.
  4. 用一条 苜蓿蒺藜 基因芯片芯片来覆盖衬垫滑动, 形成杂交室.
  5. 投入杂交室盖子和紧固用夹子的房间.
  6. 将组装的杂交室放入杂交烤箱, 孵育67和 #176; C 为 40-48 h.
  7. 准备三滑动洗碗碟: 两个与250毫升洗涤缓冲区, 我保持在室温下, 一个与洗涤缓冲器 II 保持在37和 #176; C.
  8. 准备两个滑动洗涤罐: 一个带有70毫升乙腈, 一个带有70毫升稳定和干燥溶液; 在室温下保持通风罩 (请参阅 材料表 ).
  9. 将杂交室从烤箱中取出, 取出箱夹和盖子.
  10. 将微阵列芯片和垫片滑动到带洗涤缓冲器的滑动洗涤盘中, 并将芯片与盖板分开.
  11. 将微阵列芯片移动到第二个带洗涤缓冲的滑动洗涤盘中, 然后在室温下用搅拌板轻轻地将溶液循环到5分钟.
  12. 将微阵列芯片转移到第三个滑动洗涤盘上, 用5ml 洗涤缓冲器 II, 在37和 #176 的磁性搅拌板上轻轻地用搅拌棒冲洗; C 为 1 min.
  13. 将微阵列芯片转移到一个通风柜中, 并将其洗净三十年代.
  14. 将微阵列芯片转移到带有稳定和干燥溶液的滑动洗涤罐中, 并将其洗净三十年代.
  15. 慢慢取出芯片, 晾干1分钟.
  16. 使用扫描仪扫描微阵列芯片 (请参阅 2 和 #181; m 分辨率下的材料表 )。设置参数以保存多个图像和整个幻灯片扫描。将通道1和2的增益设置为 100%, 并取消自动增益.

5。计算全息数据分析

  1. 提取 Cy3 和 Cy5 荧光使用扫描软件对阵列上每个探测器的强度 (请参见 材料表 ).
  2. 使用软件的分段分析来检测样本 dna 和参考 dna 之间的拷贝数变化 (cnv)。使用段的阈值意味着日志 2 采样/参考比和 #177; 2.5 标准偏差用于确定 cnv.
  3. 使用信号映射软件 (请参阅 材料表 ) 在整个基因组中检查日志的分布情况 2 样本/参考比率.

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Results

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图 2显示了在整个基因组中, 突变体与重量信号的归一化对数2比值的分布。对计算全息数据的分析显示, 4 号染色体上大约有 22 kb 的删除, 它包含了整个SUNN基因33和 FN6191 突变体中的其他一些注释基因 (图 2,图 3)。候选删除区域被73连续探针覆盖, 该阵列的平均正常化日志2比小于-2.5 (补充表 1)。对删除边界的检查表明, 该突变体中的假定删除是由位于坐标22313168和22334934号染色体 4 (图 3) 之间的探针所左右。为了确认删除边界, PCR 引物被设计为大约 1500 bp 除预测的删除边界之外 (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCT...

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Discussion

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我们已经开发了一个基于阵列的计算全息平台, 用于检测和表征快中子轰击 (FNB) 诱发突变体的m 蒺藜cv Jemalong A17。为了证明阵列全息计算方法在检测基因突变中的应用, 我们对突变 FN6191 进行了 aCGH 分析, 并与野生型植物形成了高结瘤表型, 并与S. 根瘤菌 Sm1021进行了接种。对于分段分析, 如果段中的探测器的日志2比率的平均值高于上限阈值或低于该给定数组比较的下限阈值, 则认为该段是很重要的。每个比较的上限阈值都被确定为所有数据点第九十五百分点的日志2比值。每个比较的较低阈值被确定为所有数据点的第五百分点的日志2比值值24。

我们的分析表明, 可以通过检索具有平均规范化日志2比平均值大于 2.5 sd (重复) 或小于平均 2.5 sd (删除) 的段来确定显著的拷贝数变化。基于计算全息分析, 我们检测到一个在4号染色体上估计大小为 22 kb 的删除区域, 包含SUN...

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Disclosures

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作者声明没有竞争的金融利益。

Acknowledgements

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这项工作的经费部分是由 NSF 植物基因组研究 (IOS-1127155) 的赠款提供的。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
苜蓿基因组阵列，1 x 1 MAgilentG4123A
苜蓿苜蓿FN6191（突变体）内部FN6191
苜蓿Jemalong A17（参考）内部A17
Sigma-Aldrich320501
DNeasy植物迷你试剂盒Qiagen69104
Nanodrop 分光光度计Thermo Scientific1000D
SureTag DNA 标记试剂盒Agilent5190-3400
随机引物Agilent5190-3399
乙腈Sigma-Aldrich271004-1L
热循环仪MJ 研究型 PTC-200
离心机Labnet international IncSpectrafuge 24D
稳定和干燥溶液Agilent5185-5979
寡核苷酸 aCGH/ChIP-on-chip 杂交试剂盒Agilent5188-5380
杂交室垫圈载玻片AgilentG2505
人 Cot-1 DNAAgilent5190-3393
寡核苷酸 aCGH/ChIP-on-chip 洗涤缓冲液 1 和 2Agilent5188-5221
杂交室，不锈钢AgilentG2534A
杂交箱AgilentG2545A
纯化柱Agilent5190-3391
激光扫描仪RocheMS200
NimbleScan 2.6RocheNimblegen5225035001
Signal Map 1.9罗氏 NimblegenSignalmap1.9
硫酸

References

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  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312(2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402(2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381(2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203(2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

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