Method Article

一种基于阵列的比较基因组杂交平台, 有效检测快中子诱导的苜蓿蒺藜突变体的拷贝数变化

DOI:

10.3791/56470

⸱

November 8th, 2017

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1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

In This Article

Summary

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该协议提供了实验步骤和有关试剂、设备和分析工具的信息, 这些研究人员有兴趣执行整个基因组阵列的比较基因组杂交 (计算全息) 对拷贝数变化的分析植物.

Abstract

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突变体是基因功能研究的宝贵的遗传资源。为了产生突变体集合, 可利用三种诱变, 包括生物如 T-脱氧核糖核酸或转, 化学物质如甲基磺酸乙酯 (EMS), 或物理如电离辐射。所观察到的突变类型因所使用的诱变而异。对于电离辐射诱发突变体, 突变包括删除, 重复, 或重排。虽然 T-DNA 或 transposon-based 诱变仅限于易受转化的物种, 但化学或物理诱变可应用于种类繁多的物种。然而, 从化学或物理诱变衍生的突变的定性传统上依赖于地图的克隆方法, 这是劳动密集型和耗时。在这里, 我们表明, 一个高密度基因组阵列的比较基因组杂交 (aCGH) 平台可用于有效地检测和表征拷贝数变异 (cnv) 的突变从快中子轰击 (FNB) 突变中获得的苜蓿蒺藜, 豆科植物。整个基因组序列分析显示, 在m 蒺藜中有超过5万基因或基因模型。目前, FNB 诱发突变体的m. 蒺藜是从超过 15万 M1 线, 代表了宝贵的基因资源的功能研究的基因组。这里描述的 aCGH 平台是一个有效的工具, 用于表征 FNB 诱导突变体在m 蒺藜。

Introduction

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豆类 (豆科) 是第三大家族的开花植物, 与许多经济上重要的物种, 如大豆 (甘氨酸 max) 和苜蓿 (苜蓿)。豆科植物可以与固氮土壤细菌相互作用, 通常称为根瘤菌来发展根结节, 将大气氮减少到氨供寄主植物使用。因此, 种植豆类作物需要很少的氮肥投入, 从而有助于可持续农业。豆类作物生产的叶子和种子的高蛋白含量, 作为优良的饲料和谷物作物。然而, 种植豆科植物通常有复杂的基因组结构, 使功能研究的基因发挥关键作用在豆类特定的过程繁琐。苜蓿蒺藜已被广泛采用为豆科植物的模型, 主要是因为 (1) 它有一个相对较小的单倍体基因组大小 (~ 550) 的二倍体基因组;(2) 植物可稳定转化为基因功能研究;和 (3) 它与紫花苜蓿 (m), 牧草皇后, 和许多其他经济重要的农作物的转化研究密切相关。最近, m 蒺藜cv Jemalong A17 的基因组序列已被释放12。对基因组的诠释显示, 基因组中有超过5万预测基因或基因模型。要确定m 蒺藜基因组中大多数基因的功能是一项具有挑战性的任务。为了促进基因的功能研究, 在 15万 M1线范围内, 利用快中子轰击 (FNB) 诱变, 在m. 蒺藜cv Jemalong A17

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Protocol

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注意: 图 1 显示了数组计算全息协议的五步骤。它们是: 1) 制备植物材料;2) 分离高质量的 DNA 样本;3) DNA 样品的标记和纯化;4) 对整个基因组阵列进行杂交、冲洗和扫描;和 5) 计算全息数据分析。 m 蒺藜 整个基因组平铺阵列包含总共971041种独特的低聚体探针, 其目标是基因组中超过5万基因或基因模型 (参见 材料表 )。独特的探针间隔约每150基对 (bp) 在 exonic 地区和 261 bp 在子地区的 m 蒺藜 基因组.

1. 植物材料的制备

  1. 划破野生类型 (重量; m 蒺藜 cv Jemalong A17) 和 FN6191 突变种子, 浓缩硫酸为8分钟 (参见 材料表 )。将硫酸移至废液容器中.
  2. 用蒸压去离子水冲洗种子三次.
  3. 表面消毒20% 漂液的种子10分钟
  4. 用蒸压去离子水冲洗种子三次.
  5. 将种子储存在4和 #176; C 为3天。在春后, 在土壤中将种子在 16 h/8 h 光/暗循环和150和 #181 的生长腔中迁移和发芽一周; 电子/m 2 /秒的光照强度.
  6. 将幼....

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Results

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图 2显示了在整个基因组中, 突变体与重量信号的归一化对数2比值的分布。对计算全息数据的分析显示, 4 号染色体上大约有 22 kb 的删除, 它包含了整个SUNN基因33和 FN6191 突变体中的其他一些注释基因 (图 2,图 3)。候选删除区域被73连续探针覆盖, 该阵列的平均正常化日志2比小于-2.5 (补充表 1)。对删除边界的检查表明, 该突变体中的假定删除是由位于坐标22313168和22334934号染色体 4 (图 3) 之间的探针所左右。为了确认删除边界, PCR 引物被设计为大约 1500 bp 除预测的删除边界之外 (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCT.......

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Discussion

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我们已经开发了一个基于阵列的计算全息平台, 用于检测和表征快中子轰击 (FNB) 诱发突变体的m 蒺藜cv Jemalong A17。为了证明阵列全息计算方法在检测基因突变中的应用, 我们对突变 FN6191 进行了 aCGH 分析, 并与野生型植物形成了高结瘤表型, 并与S. 根瘤菌 Sm1021进行了接种。对于分段分析, 如果段中的探测器的日志2比率的平均值高于上限阈值或低于该给定数组比较的下限阈值, 则认为该段是很重要的。每个比较的上限阈值都被确定为所有数据点第九十五百分点的日志2比值。每个比较的较低阈值被确定为所有数据点的第五百分点的日志2比值值24。

我们的分析表明, 可以通过检索具有平均规范化日志2比平均值大于 2.5 sd (重复) 或小于平均 2.5 sd (删除) 的段来确定显著的拷贝数变化。基于计算全息分析, 我们检测到一个在4号染色体上估计大小为 22 kb 的删除区域, 包含SUN.......

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Disclosures

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作者声明没有竞争的金融利益。

Acknowledgements

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这项工作的经费部分是由 NSF 植物基因组研究 (IOS-1127155) 的赠款提供的。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
苜蓿基因组阵列，1 x 1 MAgilentG4123A
苜蓿苜蓿FN6191（突变体）内部FN6191
苜蓿Jemalong A17（参考）内部A17
Sigma-Aldrich320501
DNeasy植物迷你试剂盒Qiagen69104
Nanodrop 分光光度计Thermo Scientific1000D
SureTag DNA 标记试剂盒Agilent5190-3400
随机引物Agilent5190-3399
乙腈Sigma-Aldrich271004-1L
热循环仪MJ 研究型 PTC-200
离心机Labnet international IncSpectrafuge 24D
稳定和干燥溶液Agilent5185-5979
寡核苷酸 aCGH/ChIP-on-chip 杂交试剂盒Agilent5188-5380
杂交室垫圈载玻片AgilentG2505
人 Cot-1 DNAAgilent5190-3393
寡核苷酸 aCGH/ChIP-on-chip 洗涤缓冲液 1 和 2Agilent5188-5221
杂交室，不锈钢AgilentG2534A
杂交箱AgilentG2545A
纯化柱Agilent5190-3391
激光扫描仪RocheMS200
NimbleScan 2.6RocheNimblegen5225035001
Signal Map 1.9罗氏 NimblegenSignalmap1.9
硫酸

References

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  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312(2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. ....

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