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方法文章

外泌体的透射电子显微镜样品制备与成像

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DOI：

10.3791/56482

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2018年1月4日

 , 
1Department of Convergence Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 2Synaptic Circuit Plasticity Laboratory, Department of Structure and Function of Neural Network, Korea Brain Research Institute

本文内容

摘要

本方案描述了进行透射电子显微镜观察所需的多种技术，包括负染色法、用于观察精细结构的超薄切片法，以及免疫金标记法以确定外泌体中特定蛋白质的位置。

摘要

外泌体是由体液分泌的纳米级细胞外囊泡，能够反映分泌细胞的特性。这些分泌囊泡的内容物和形态可体现细胞的行为或生理状态，例如细胞生长、迁移、分裂和死亡。外泌体的功能可能与其大小密切相关，其尺寸通常在30至300 nm之间。目前最常用的外泌体成像方法是负染色法，其他研究结果则基于冷冻透射电子显微镜、扫描电子显微镜和原子力显微镜获得。通过负染色法观察到的典型外泌体形态呈杯状，但更详细的结构特征尚不明确。在医学和药学领域，尤其需要通过结构研究对外泌体进行充分表征。因此，应利用电子显微镜技术（如对外泌体精细结构中的特定蛋白进行标记）来验证其功能相关的形态特征。为了观察其精细结构，本文比较了超薄切片图像与负染色图像。在本实验方案中，我们推荐使用透射电子显微镜对外泌体进行成像，包括负染色、整体免疫染色、包埋块制备、超薄切片以及免疫金标记等方法。

引言

细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌的脂质双层囊泡，其大小在30至300 nm之间。1978年首次报道了细胞外囊泡的存在，相关证据来自霍奇金病患者的囊泡1，这些囊泡的直径为40至120纳米。1980年有研究报道，EVs参与癌症患者体内血液凝固系统及血栓形成，即在血管内形成血凝块的过程2。30年后，EVs被证实是促进肿瘤侵袭、免疫逃逸和血管生成的重要因素3。此外，EVs在炎症、免疫紊乱、神经系统疾病和癌症等领域的细胞相互作用调节功能也已被广泛研究4。由于EVs含有特定的生物分子，如蛋白质、mRNA和microRNA5，其在诊断和治疗中的潜在应用价值已得到分析6,7。EVs是一类包含多个亚群的囊泡，根据其细胞来源和生物学功能，可分为外泌体（exosomes）、前列腺体（prostasomes）、肿瘤体（oncosomes）、dexosomes、微颗粒（microparticles）、promininosomes、argosomes以及类外泌体囊泡（exosome-like vesicles）等3。此外，根据其生物发生途径，这些EVs还可分为微囊泡（shed microvesicles，100–1000 nm）和外泌体（30–300 nm）8,9。其中，外泌体已被报道在免疫应答10、癌症11,12以及感染性疾病13中作为细胞间通讯的重要媒介。

外泌体作为早期诊断生物标志物的研究兴趣正在迅速增长，而外泌体的纯化与表征必须结合分子成像技术。由于外泌体的大小和形态随其来源和功能不同而有所差异14，可通过高分辨率显微技术（如电子显微镜）加以区分。大多数外泌体通过负染透射电子显微镜（TEM）进行观察15,16,17，并通过整体囊泡的特异性蛋白免疫标记加以验证18。多个研究团队已报道通过扫描电子显微镜、原子力显微镜19,20以及冷冻电镜（Cryo-TEM）21,22获得的外泌体结构。然而，尽管这些技术适用于研究外泌体结构，却不足以观察位于外泌体内部的特定蛋白的位置。因此，我们提出了一种针对特定蛋白标记的外泌体成像方案。通过包埋块制备、超薄切片和免疫染色技术，确定目标蛋白在外泌体中的精确定位，并将其与传统的负染色法和整体免疫染色法进行比较，后者常用于外泌体的表征。

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方案

1. 外泌体的包埋、切片、染色与成像

  1. 通过在 100,000 × g 条件下离心 1.5 小时，从 HCT116 细胞的培养上清液中沉淀外泌体23。弃去培养上清液，用 1 mL 含 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠溶液（pH 7.0）在 4 °C 下固定纯化的外泌体沉淀物 1 小时。配制 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液：将 4.28 g 二甲胂酸溶解于 160 mL 蒸馏水中，用 0.1 M HCl 调节 pH 至 7.4，再用蒸馏水定容至 200 mL。
  2. 去除固定液，用 1 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液在室温下冲洗沉淀物。每次更换缓冲液，重复冲洗三次，每次持续 10 分钟。
  3. 用 1 mL 2% 四氧化锇在 4 °C 下对样品进行后固定 1 小时。
  4. 去除固定液，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次，每次 10 分钟。
  5. 在摇床上依次用梯度丙酮溶液（分别为 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）孵育 10 分钟。
  6. 去除丙酮，加入 3:1 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。外泌体沉淀物位于离心管中。
  7. 去除介质，加入 1:1 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。
  8. 去除介质，加入 1:3 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。
  9. 去除介质，加入 100% 低黏度包埋介质，室温下孵育过夜。
  10. 使用包埋模具将样品包埋于纯低黏度包埋介质中，并在 65 °C 下烘烤 24 小时。
  11. 使用超薄切片机切出厚度为 60 nm 的切片。
  12. 先用 2% 醋酸铀染色 20 分钟，再用柠檬酸铅染色 10 分钟。
    配制 Reynolds 铅染液：将 1.33 g 硝酸铅和 1.76 g 柠檬酸钠溶于总共 50 mL 蒸馏水中。
  13. 在 80 kV 下通过透射电子显微镜观察载网。
  14. 在 80 kV 下的电子显微镜 CCD 相机系统中，点击“采集”，然后点击“文件”和“另存为”。按照自动设置调整曝光时间。

2. 切片免疫染色与成像（图1）

  1. 使用超薄切片机切取60 nm的超薄切片，并收集于镍网上。
  2. 孵育载网于 50 µL 加入0.02 M甘氨酸溶液，孵育10分钟，以淬灭游离醛基。
  3. 冲洗 100 μL 用去离子水洗涤三次，每次10分钟。在含1% BSA的PBS中室温孵育1小时。
  4. 将载网置于 50 - 100 µL 抗KRS抗体滴液24 （在含有0.1% BSA的PBS中按1:100稀释）孵育1小时（如有必要，此步骤应在 4 °C 过夜。
  5. 用五滴不同的溶液分别清洗载网（50 µL) 含有0.1% BSA的PBS缓冲液中，每次10分钟。
  6. 将载网转移至2滴nd 抗体孵育1小时（使用与10 nm金颗粒偶联的抗兔IgG抗体（1:100稀释），溶于含0.1% BSA的PBS中）。
  7. 用五个独立的液滴冲洗载网（50 µL) 含0.1% BSA的PBS，每次10分钟。
  8. 在避光条件下，分别用2%醋酸铀染色20分钟，再用Reynold铅柠檬酸盐染色10分钟。
  9. 在透射电镜（80 kV）下，于CCD相机系统中点击“采集”，然后点击“文件”并选择“另存为”。曝光时间采用自动设置。

使用免疫测定法进行病毒检测的顺序过程：样品、芯片、分析、结果显示。
图1：样品制备与免疫染色过程。 (A) 双固定外泌体经脱水后，用低粘度包埋介质树脂进行渗透处理。(B) 树脂包埋。(C) 使用金刚石刀进行超薄切片。(D) 免疫金标记实验装置。将带有超薄切片的载网置于Parafilm表面的液滴上，并用湿润的纸巾保持湿度。每个切片与50–100 µL抗体液滴孵育，随后用缓冲液洗涤。(E) 使用醋酸铀和柠檬酸铅进行双重染色。染色过程中用铝箔覆盖盖子，以进行重金属染色。(F) 用滤纸去除染色液。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 负染色法

  1. 使用电晕放电仪对覆有薄层火棉胶/碳膜的200目铜质电镜载网进行1分钟的电晕放电处理。
  2. 用1 mL的2%多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体，作用5分钟。
    注意：多聚甲醛蒸气有毒，所有操作应在通风良好的通风橱中进行。
  3. 将5–7 µL外泌体悬液滴加到载网上，孵育1分钟。若外泌体浓度过高，可将其稀释至原浓度的1/2–1/5。
  4. 用注射器将约20滴过滤后的1%醋酸铀酰（UA）染色液滴加至电镜载网表面，立即进行染色。
  5. 用滤纸接触载网边缘，吸除载网上的多余UA溶液。
  6. 用一滴水快速冲洗载网，以去除残留的染色液。
  7. 用镊子夹持载网放置于桌面上，并用培养皿部分覆盖，于室温下干燥10分钟。
  8. 将载网存放在电镜载网盒中，以备后续在80 kV透射电镜下观察使用。

4. 免疫染色用整体封片

  1. 对覆有薄层聚乙烯醇缩醛/碳膜的 200 目铜质透射电镜载网进行 30 秒的辉光放电处理。
  2. 用1 mL 2%多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体5 min。
    注意：聚甲醛蒸气有毒，所有操作均应在通风橱内进行。
  3. 加载 5 - 7 µL 将固定后的外泌体溶液滴加至载网上，孵育5分钟，用去离子水冲洗 100 µL 用 PBS 每次 10 分钟，共洗涤三次。
  4. 处理载网 50 µL 用 0.05 M 甘氨酸孵育 10 分钟，以淬灭游离醛基。
  5. 将载网转移至封闭缓冲液（含1% BSA的PBS）液滴中，孵育30分钟。
  6. 孵育载网与 50 - 100 µL 抗PD-L1抗体（1:100，溶于含0.1% BSA的PBS中）孵育1小时（如必要，此步骤应在 4 °C 过夜。
  7. 用五个独立的液滴分别清洗载网（50 µL) 含有0.1% BSA的PBS缓冲液中，每次10分钟。
  8. 将载网转移至一滴 2nd 抗体孵育1小时。将与9 - 11 nm金颗粒偶联的抗小鼠IgG以1:100比例溶于含0.1% BSA的PBS中。
  9. 用五滴不同的溶液分别清洗载网50 µL)含0.1% BSA的PBS溶液，每次10分钟。用两滴独立的溶液清洗网格（50 µL) 的去离子水。按照3.4至3.8步骤，使用2%醋酸铀进行负染。
  10. 将载网存放在透射电镜载网盒中，以备后续在80 kV下通过透射电镜观察。

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结果

目前，外泌体主要通过透射电子显微镜根据其大小和形态进行分类。图2展示了整体封片状态下经负染色的外泌体以及免疫标记的外泌体。图3展示了经超薄切片后染色的外泌体以及免疫标记的外泌体。利用针对特定蛋白的抗体进行免疫金标染色，可用于明确鉴定外泌体，并对外泌体中的蛋白类型进行分类。本文所采用的实验方案包括对外泌体进行整体封片免疫染色以及对塑料切片外泌体进行免疫染色。

病毒颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像；比例尺为100 nm，用于尺寸参考。
图2：负染色法与整体免疫染色法。

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讨论

本文介绍了一种用于观察外泌体精细结构并标记其特异性蛋白质的实验方案。负染色法被认为是外泌体成像的最佳方法17。该传统技术显示外泌体呈杯状结构。然而，这种杯状形态是由于干燥过程所导致的人工假象。冷冻透射电镜（cryo-TEM）结果显示，外泌体在水溶液中具有完全球形的结构25,26。冷冻透射电镜是一种研究外泌体天然结构的强有力方法，但难以应用于免疫金标记技术。Raso 及其同事指出，传统方法（整体负染法）中的干燥步骤导致了杯状形态的产生。本研究采用了常规的细胞制备方法（常规电镜技术；包括固定、脱水、包埋和切片），以减少外泌体的干燥效应。使用塑料包埋的常规电镜技术可避免或减少因变性引起的假象（体积和形状的变化）。化学固定中采用戊二醛（GA）进行交联（氨基之间的共价相互作用）。通常还使用四氧化锇（OsO4）固定脂质，并提高样品的对比度。

本研究中，负染色法有助于确认外泌体典型的形态特征，该特征已在先前的文...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由 Bio 资助 & 国家研究基金会（NRF）医疗技术开发计划 & 由韩国政府（MSIP）资助&MOHW)（编号 2016M3A9B6904244）。我们还感谢医药生物融合研究中心成员在外泌体纯化方面的工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
戊二醛EMS16200
二甲胂酸钠 EMS12300
四氧化锇 1 g 晶体EMS19100仅可在通风橱中使用
丙酮JUNSEI1B2031
Spurr 包埋介质TED PELLA18108
超薄切片机LeicaUCT
醋酸铀酰EMS22400危险化学品
柠檬酸铅EMS17900
透射电子显微镜HitachiH7600
镍网EMSG200-Ni
铜网EMSG200-Cu
甘氨酸SIGMA022K5404
磷酸盐缓冲液SIGMAP4417
牛血清白蛋白Aurion25557
一抗手动纯化 
纯化的抗人 CD274（B7-H1，PD-L1）抗体BioLegend329710整体免疫金标记
纯化的小鼠 IgG2b，κ 同型对照BioLegend401202整体免疫金标记（对照）
二抗：偶联 9-11 nm 金颗粒的抗小鼠 IgG 抗体sigmaG7652
透射电子显微镜JEOLJEM2200FS
电晕放电仪JEOLJFC1100E
碳支持膜镍网EMS121119
多聚甲醛EMS19210
Formvar 碳涂层铜网（200 目）EMSFCF200-CU
Formvar 碳涂层  镍网（200 目）EMSFCF200-NI

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