方法文章

透射电镜下体的样品制备与成像

DOI：

10.3791/56482

⸱

2018年1月4日

 , 
1Department of Convergence Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 2Synaptic Circuit Plasticity Laboratory, Department of Structure and Function of Neural Network, Korea Brain Research Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议描述了传输电子显微镜所需的各种技术, 包括阴性染色, 超薄切片的详细结构, 和免疫金标签, 以确定特定的蛋白质在体的位置。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体是一种由体液分泌的纳米细胞胞外囊, 它能代表分泌它们的细胞的特征。分泌囊泡的含量和形态反映细胞的行为或生理状态, 例如细胞生长、迁移、分裂和死亡。体的角色可能高度依赖于大小, 体的大小从30到 300 nm 不等。最广泛使用的方法外切成像是阴性染色, 而其他结果是基于低温透射电镜, 扫描电镜, 和原子力显微镜。典型的外切的形态通过阴性染色评估是一个杯子形状, 但进一步细节还不清楚。通过结构研究的外切良好在医学和药学领域是必要的。因此, 功能相关的形态学应该通过电子显微镜技术来验证, 例如在外切的详细结构中标注特定的蛋白质。对体的结构、超薄切片图像和负染色图像进行了对比观察。在本协议中, 我们建议传输电子显微镜的成像体包括阴性染色, 全贴剂免疫染色, 块准备, 薄切片, 免疫金标签。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胞外囊泡 (EVs) 是由细胞分泌的脂质双层囊泡, 其大小范围介于30和 300 nm 之间。EVs 是第一次报告在 1978年, 与证据从囊性霍奇金病患者的水泡1。据报道, 这些小泡的大小是40到120纳米。据报道, 在 1980年, EVs 参与了凝血系统和血栓形成, 在癌症患者的血管内产生了血块2。30年后, EVs 被报道是促进肿瘤侵袭、免疫逃逸和血管生成的重要因素3。此外, 在炎症、免疫紊乱、神经系统疾病和癌症等领域的细胞相互作用中, EVs 的功能已被研究为调节因子4。由于 EVs 包含特定的生物分子, 如蛋白质, mRNA, 和 rna5, 它们在诊断和治疗方面的潜在应用已被分析6,7。EVs 是一个由子群组成的类别, 包括体、prostasomes、oncosomes、dexosomes、微粒、promininosomes、argosomes 和外切样泡, 这取决于它们的细胞来源和生物学功能3。此外, 根据它们的生物, 这些 EVs 可分为微 (棚微、100-1000 nm) 和体 (30-300 nm)8,9。其中, 外切被报告为免疫应答的细胞通信器10、癌症11、12和传染性疾病13。

对体作为早期诊断的生物标记物的兴趣正在迅速增加, 体的纯化和鉴定必须伴有分子成像技术。不同的大小和形态的体, 根据它们的起源和功能14, 可以区分高分辨率的显微镜技术, 如电子显微镜。大多数体是由负染色透射电镜 (TEM)15,16,17, 这些结果是通过 immunolabeling 的一个特定的蛋白在整个芒泡的确认18. 有几个研究小组通过扫描电子显微镜、原子力显微镜、19、20、低温-TEM21、22来报告该结构。然而, 虽然这些技术是有用的研究外切结构, 他们是不足够的观察位置的特定蛋白质位于外切。因此, 我们介绍了一个协议的成像体与特定的蛋白质的标签。我们采用了块制备, 超薄切片和免疫, 以确定蛋白质的详细位置在外切。这是与阴性染色和整个芒免疫, 这是传统用于表征的外切。

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方案

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1. 外切块的制备、切片、染色和成像

  1. 将 HCT116 细胞培养上清液中的体, 在 10万 x g 为 1.5 h23进行离心。去除培养上清液, 在1° c 的 0.1 M 钠甲溶液 (pH 7.0) 中, 用1毫升2.5% 戊二醛仔细修复纯化的外切颗粒, 4 小时。对0.1 米甲钠, 溶解4.28 克胂酸在160毫升蒸馏水 (DW)。将 pH 值调整到7.4 与0.1 米 HCl, 然后用蒸馏水构成200毫升。
  2. 在室温下用1毫升的0.1 米甲缓冲液去除固定剂并冲洗颗粒。重复三次, 每次变化持续10分钟。
  3. 在4° c 的情况下, 用1毫升2% 锇氧化在1小时后修复样品。
  4. 取下定影液, 冲洗三次, 每10分钟用0.1 米甲缓冲。
  5. 用分级丙酮系列 (50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、分别) 在振动筛上孵育10分钟。
  6. 除去丙酮, 孵育3:1 丙酮的溶液: 低粘度嵌入混合物30分钟。外切颗粒在试管里。
  7. 去除培养基, 加入1:1 丙酮: 低粘度的嵌入混合物培养基, 然后孵育30分钟。
  8. 去除培养基, 加入1:3 丙酮: 低粘度的嵌入混合物培养基, 然后孵育30分钟。
  9. 去除培养基, 加入100% 低粘度的嵌入混合物, 在室温下过夜。
  10. 将样品嵌入纯低粘度的嵌入混合物中, 并在65° c 下烘烤24小时。
  11. 通过 ultra-microtome 准备 60 nm 厚度的剖面。
  12. 双色染色, 2% 铀醋酸20分钟, 柠檬酸铅10分钟。
    对于雷诺铅溶液, 添加1.33 克硝酸铅和1.76 克柠檬酸钠, 总共50毫升蒸馏水。
  13. 在 80 kV 的透射电镜下观察网格。
  14. 单击 "获取", 然后在 80 kV 的电子显微镜下, 在 CCD 摄像系统中单击 "文件" 和 "另存为"。按照曝光时间的自动设置进行。

2. 切片和成像的免疫染色 (图 1)

  1. 使用 ultra-microtome 切割60纳米超薄切片, 并在镍网格上收集。
  2. 孵育网格在50µL 滴0.02 米甘氨酸为10分钟到淬火游离醛组。
  3. 在100μ l 的 DW 中冲洗三次, 每次10分钟, 在室温下孵育 1 h 在含有 1% BSA 的 PBS 中。
  4. 孵育网格在 50-100 µL 滴抗 KRS 抗体24 (1:100 在 PBS 中含有 0.1% BSA) 为 1 h (如有必要, 此步骤应在夜间在4° c 进行。
  5. 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 为10分钟每个。
  6. 传输网格到下落 2nd抗体为 1 h (兔 IgG 共轭到10毫微米金微粒 (1:100) 在 PBS 包含 0.1% BSA)。
  7. 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 每 10 min。
  8. 双染色2% 铀醋酸20分钟在黑暗条件下, 并与雷诺的铅柠檬酸10分钟, 分别。
  9. 单击 "获取", 然后在 80 kV 的 TEM 下, 在 CCD 摄像系统中点击 "文件" 和 "另存为"。曝光时间遵循自动设置。

管子和工具中的顺序色谱过程;蛋白质纯化实验。
图 1: 样品制备和免疫的过程.(A)双固定外切的脱水和渗透低粘度嵌入混合树脂。(B)树脂嵌入。(C)超薄截面带金刚石刀。(D)设置免疫金标签。与超薄部分的网格放在液滴上的膜, 这是放置在湿纸巾。每节都用 50-100 µL 抗体的飞沫孵育, 然后用缓冲液冲洗。(E)双染色, 醋酸铀和柠檬酸铅。盖子上覆盖着铝箔, 用于重金属染色。(F)染色液由滤纸移除。请单击此处查看此图的较大版本.

3. 阴性染色

  1. 辉光放电的薄 formvar/碳膜覆盖200网状铜 EM 栅1分钟的辉光料器。
  2. 1毫升2% 甲醛 (粉煤灰) 固定纯化体5分钟。
    警告: 甲醛的烟雾是有毒的。所有工作应在通风油烟罩。
  3. 在网格上加载 5-7 µL 外切悬浮液, 孵育1分钟。如果外切浓度过高, 稀释浓度为 1/2-1/5。
  4. 立即染色与〜20滴过滤1% 铀醋酸盐 (UA) 解决方案在表面的 EM 网格的注射器。
  5. 通过与过滤纸接触网格边缘, 删除网格上多余的 UA 解决方案。
  6. 用一滴水迅速冲洗网格。此步骤将删除多余的染色液。
  7. 用镊子把网格放在桌上, 用一个培养皿把网格部分盖住, 在室温下晾干10分钟。
  8. 将网格存储在 EM 网格框中, 以便在80伏的 TEM 上进行观察。

4. 全山免疫

  1. 辉光放电薄 formvar/碳膜涂层200网状铜 EM 网三十年代。
  2. 1毫升2% 甲醛 (粉煤灰) 固定纯化体5分钟。
    警告: 甲醛的烟雾是有毒的。所有工作应在通风油烟罩。
  3. 在网格上加载 5-7 µL 固定外切溶液, 孵育5分钟, 100 µL PBS 三次, 每10分钟冲洗一次。
  4. 治疗50µL 0.05 米甘氨酸10分钟, 以淬火游离醛组的网格。
  5. 将网格转移到一滴阻塞缓冲器 (PBS 含有 1% BSA), 用于30分钟。
  6. 孵育网格与 50-100 µL 抗 PD-L1 抗体 (1:100 在 PBS 包含 0.1% BSA) 为 1 h (如果需要, 这步应该执行在4° c 隔夜)。
  7. 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 为10分钟每个。
  8. 将网格传输到 1 h 的 2nd抗体的下落。
抗鼠 IgG 共轭 9-11 nm 的黄金粒子稀释在1:100 在 PBS 含有 0.1% BSA。
  • 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 为10分钟每个。用两个单独滴 (50 µL) 的 DW 洗涤网格。用2% 铀醋酸酯进行阴性染色, 描述从3.4 到3.8。
  • 将网格存储在 EM 网格框中, 以便在80伏的 TEM 上进行观察。

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    结果

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    目前, 体被分为大小和形状类别的透射电子显微镜。图 2显示了负染色外切和免疫标签外切在整个安装状态。图 3显示了切片后的分段外切和免疫标记体。免疫金染色使用特异蛋白抗体, 用于积极识别外切和分类的蛋白质类型的外切。本协议采用全贴免疫和免疫塑料分段外切。

    病毒颗粒的透射电镜;病毒形态和超微结构的详细研究。
    图 2: 阴性染色和全贴免疫染色.(A)外切形态学通过阴性染色观察。体显示他们的杯子形状的形态学。

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    讨论

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    本文提出了一个协议, 以观察详细的外切的结构和标签的具体蛋白质。阴性染色被认为是外切成像17的最佳方法。这种传统的技术已经显示体的杯状结构。然而, 这个杯子形状是一种形式的人造制品, 可能发生由于干燥过程。低温透射电镜结果表明, 体在水溶液中具有完美的球形结构25,26。低温透射电镜技术是检测天然结构的一种非常有效的方法, 但对免疫金法的应用却十分困难。Raso 和同事指出, 传统的干燥方法 (全贴装阴性染色法) 导致了杯状的形态学。本研究采用标准的细胞制备方法 (常规 EM、固定、脱水、埋植、切片) 来降低外切干燥效果。使用塑料嵌入的常规 EM 可以避免或减少因变性引起的制品 (体积和形状的变化)。对于化学固定, 戊二醛 (GA) 用于交联 (氨基之间的共价键相互作用)。通常, 锇氧化 (OsO4) 用于固定血脂以及改善对比度。

    在本研究中, 阴性染色有助于确认体的典型形态, 这在以前的论文中已...

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    披露

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    作者没有什么可透露的。

    致谢

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    这项研究得到了生物和 #38 的支持; 国家研究基金会 (NRF) 和 #38 的医疗技术发展方案; 由韩国政府资助 (MSIP 和 #38; 保健) (No. 2016M3A9B6904244)。我们还感谢医学 Bioconvergence 研究中心的成员外切纯化。

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    材料

    本文使用的材料清单
    姓名公司目录编号评论
    戊二醛EMS16200
    二甲胂酸钠 EMS12300
    四氧化锇 1 g 晶体EMS19100仅在通风橱中使用
    丙酮JUNSEI1B2031
    Spurr 培养基TED PELLA18108
    超薄切片机LeicaUCT
    乙酸铀酰EMS22400危险化学品
    柠檬酸铅EMS17900
    透射电子显微镜日立H7600
    镍栅EMSG200-Ni
    铜栅EMSG200-Cu
    甘氨酸SIGMA022K5404
    磷酸盐缓冲盐水SIGMAP4417
    牛血清白蛋白Aurion25557
    1st 抗体 
    纯化的抗人 CD274 （B7-H1， PD-L1） 抗体BioLegend329710全装 Immumogold
    纯化小鼠 IgG2b，κ同种型 CtrlBioLegend401202全装 Immumogold（对照）
    2nd 抗小鼠 igG 偶联 9-11 nm 金颗粒sigmaG7652
    透射电子显微镜JEOLJEM2200FS
    辉光放电器JEOLJFC1100E
    碳网格EMS121119
    多聚甲醛EMS19210
    Formvar 碳涂层铜网格 （200 meh）EMSFCF200-CU
    Formvar 碳涂层 镍板栅 （200 目）EMSFCF200-NI
    手动纯化

    参考文献

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