本方案描述了进行透射电子显微镜观察所需的多种技术，包括负染色法、用于观察精细结构的超薄切片法，以及免疫金标记法以确定外泌体中特定蛋白质的位置。
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本文内容
摘要
摘要
外泌体是由体液分泌的纳米级细胞外囊泡，能够反映分泌细胞的特性。这些分泌囊泡的内容物和形态可体现细胞的行为或生理状态，例如细胞生长、迁移、分裂和死亡。外泌体的功能可能与其大小密切相关，其尺寸通常在30至300 nm之间。目前最常用的外泌体成像方法是负染色法，其他研究结果则基于冷冻透射电子显微镜、扫描电子显微镜和原子力显微镜获得。通过负染色法观察到的典型外泌体形态呈杯状，但更详细的结构特征尚不明确。在医学和药学领域，尤其需要通过结构研究对外泌体进行充分表征。因此，应利用电子显微镜技术（如对外泌体精细结构中的特定蛋白进行标记）来验证其功能相关的形态特征。为了观察其精细结构，本文比较了超薄切片图像与负染色图像。在本实验方案中，我们推荐使用透射电子显微镜对外泌体进行成像，包括负染色、整体免疫染色、包埋块制备、超薄切片以及免疫金标记等方法。
引言
细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌的脂质双层囊泡，其大小在30至300 nm之间。1978年首次报道了细胞外囊泡的存在，相关证据来自霍奇金病患者的囊泡1，这些囊泡的直径为40至120纳米。1980年有研究报道，EVs参与癌症患者体内血液凝固系统及血栓形成，即在血管内形成血凝块的过程2。30年后，EVs被证实是促进肿瘤侵袭、免疫逃逸和血管生成的重要因素3。此外，EVs在炎症、免疫紊乱、神经系统疾病和癌症等领域的细胞相互作用调节功能也已被广泛研究4。由于EVs含有特定的生物分子，如蛋白质、mRNA和microRNA5，其在诊断和治疗中的潜在应用价值已得到分析6,7。EVs是一类包含多个亚群的囊泡，根据其细胞来源和生物学功能，可分为外泌体（exosomes）、前列腺体（prostasomes）、肿瘤体（oncosomes）、dexosomes、微颗粒（microparticles）、promininosomes、argosomes以及类外泌体囊泡（exosome-like vesicles）等3。此外，根据其生物发生途径，这些EVs还可分为....
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方案
1. 外泌体的包埋、切片、染色与成像
- 通过在 100,000 × g 条件下离心 1.5 小时，从 HCT116 细胞的培养上清液中沉淀外泌体23。弃去培养上清液，用 1 mL 含 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠溶液（pH 7.0）在 4 °C 下固定纯化的外泌体沉淀物 1 小时。配制 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液：将 4.28 g 二甲胂酸溶解于 160 mL 蒸馏水中，用 0.1 M HCl 调节 pH 至 7.4，再用蒸馏水定容至 200 mL。
- 去除固定液，用 1 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液在室温下冲洗沉淀物。每次更换缓冲液，重复冲洗三次，每次持续 10 分钟。
- 用 1 mL 2% 四氧化锇在 4 °C 下对样品进行后固定 1 小时。
- 去除固定液，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次，每次 10 分钟。
- 在摇床上依次用梯度丙酮溶液（分别为 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）孵育 10 分钟。
- 去除丙酮，加入 3:1 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。外泌体沉淀物位于离心管中。
- 去除介质，加入 1:1 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。
- 去除介质，加入 1:3 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。
- 去除介质，加....
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结果
目前，外泌体主要通过透射电子显微镜根据其大小和形态进行分类。图2展示了整体封片状态下经负染色的外泌体以及免疫标记的外泌体。图3展示了经超薄切片后染色的外泌体以及免疫标记的外泌体。利用针对特定蛋白的抗体进行免疫金标染色，可用于明确鉴定外泌体，并对外泌体中的蛋白类型进行分类。本文所采用的实验方案包括对外泌体进行整体封片免疫染色以及对塑料切片外泌体进行免疫染色。
图2：负染色法与整体免疫染色法。
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讨论
本文介绍了一种用于观察外泌体精细结构并标记其特异性蛋白质的实验方案。负染色法被认为是外泌体成像的最佳方法17。该传统技术显示外泌体呈杯状结构。然而，这种杯状形态是由于干燥过程所导致的人工假象。冷冻透射电镜（cryo-TEM）结果显示，外泌体在水溶液中具有完全球形的结构25,26。冷冻透射电镜是一种研究外泌体天然结构的强有力方法，但难以应用于免疫金标记技术。Raso 及其同事指出，传统方法（整体负染法）中的干燥步骤导致了杯状形态的产生。本研究采用了常规的细胞制备方法（常规电镜技术；包括固定、脱水、包埋和切片），以减少外泌体的干燥效应。使用塑料包埋的常规电镜技术可避免或减少因变性引起的假象（体积和形状的变化）。化学固定中采用戊二醛（GA）进行交联（氨基之间的共价相互作用）。通常还使用四氧化锇（OsO4）固定脂质，并提高样品的对比度。
本研究中，负染色法有助于确认外泌体典型的形态特征，该特征已在先前的文.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由 Bio 资助 & 国家研究基金会（NRF）医疗技术开发计划 & 由韩国政府（MSIP）资助&MOHW)（编号 2016M3A9B6904244）。我们还感谢医药生物融合研究中心成员在外泌体纯化方面的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊二醛 | EMS | 16200 | |
| 二甲胂酸钠 | EMS | 12300 | |
| 四氧化锇 1 g 晶体 | EMS | 19100 | 仅可在通风橱中使用 |
| 丙酮 | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr 包埋介质 | TED PELLA | 18108 | |
| 超薄切片机 | Leica | UCT | |
| 醋酸铀酰 | EMS | 22400 | 危险化学品 |
| 柠檬酸铅 | EMS | 17900 | |
| 透射电子显微镜 | Hitachi | H7600 | |
| 镍网 | EMS | G200-Ni | |
| 铜网 | EMS | G200-Cu | |
| 甘氨酸 | SIGMA | 022K5404 | |
| 磷酸盐缓冲液 | SIGMA | P4417 | |
| 牛血清白蛋白 | Aurion | 25557 | |
| 一抗 | 手动纯化 | ||
| 纯化的抗人 CD274（B7-H1，PD-L1）抗体 | BioLegend | 329710 | 整体免疫金标记 |
| 纯化的小鼠 IgG2b，κ 同型对照 | BioLegend | 401202 | 整体免疫金标记（对照） |
| 二抗：偶联 9-11 nm 金颗粒的抗小鼠 IgG 抗体 | sigma | G7652 | |
| 透射电子显微镜 | JEOL | JEM2200FS | |
| 电晕放电仪 | JEOL | JFC1100E | |
| 碳支持膜镍网 | EMS | 121119 | |
| 多聚甲醛 | EMS | 19210 | |
| Formvar 碳涂层铜网（200 目） | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar 碳涂层 镍网（200 目） | EMS | FCF200-NI |
参考文献
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield....
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重印与许可
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