方法文章

一种原代人类滋养层细胞模型，用于研究母体肥胖相关炎症对胎盘自噬调控的影响

DOI：

10.3791/56484

⸱

2017年9月27日

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种人胎盘绒毛组织取样后分离细胞滋养层细胞用于原代细胞培养的实验方案。用TNFα处理滋养层细胞可模拟肥胖子宫内环境中的炎症状态，有助于发现母体肥胖胎盘中受炎症调控的分子靶点。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

母体肥胖与不良围产期结局风险增加相关，这种关联可能由胎盘功能受损介导，而胎盘功能受损部分归因于自噬失调。肥胖妊娠胎盘中自噬调控因子表达的异常变化可能受到与肥胖和妊娠均相关的炎症过程的调控。本文描述了一种从足月人胎盘取样绒毛组织并分离绒毛细胞滋养层细胞用于原代细胞培养的方案。随后，通过使用肿瘤坏死因子α（TNFα）处理来自瘦型妊娠的原代滋养层细胞，模拟肥胖宫内环境中的炎症微环境；TNFα是一种在肥胖和妊娠状态下均升高的促炎性细胞因子。通过实施本方案发现，外源性TNFα暴露可调控来自瘦型妊娠且胎儿为女性的滋养层细胞中Rubicon（自噬的负向调控因子）的表达。尽管肥胖宫内环境中多种生物学因素均有可能调节滋养层细胞中的关键通路，但这种ex vivo系统特别有助于确定在母体肥胖的人胎盘中in vivo观察到的表达模式是否直接由TNFα信号传导所致。最终，该方法为解析母体肥胖相关炎症对滋养层细胞中自噬及其他关键细胞通路的调控机制和分子影响提供了机会，这些影响可能进而损害胎盘功能。

引言

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肥胖是一种以慢性低度炎症为特征的炎性状态，源于过多的脂肪组织和营养物质的过剩。在肥胖状态下，促炎性细胞因子在代谢组织中以及全身循环中均升高。大量证据表明，TNFα在肥胖环境中显著升高，并与胰岛素抵抗和代谢功能障碍密切相关1。TNFα的激活还在癌症和自身免疫等疾病的发生发展中起重要作用，因此成为有前景的治疗靶点2。

肥胖相关的炎症会因妊娠而加剧，而妊娠本身也是一种促炎状态3,4。先前研究已表明，在女性胎儿的妊娠中，胎盘TNFα含量随母体脂肪量的增加而升高。此外，TNFα处理可抑制女性胎儿滋养层细胞的线粒体呼吸，但对男性胎儿细胞无此作用，提示TNFα以性别差异的方式参与调控胎盘代谢5。母体肥胖与妊娠期间多种并发症发生率升高相关，包括死产，而男性胎儿的易感性最高3,6,7,8。由于胎盘在母胎界面发挥关键作用，因此在肥胖的宫内环境中，胎盘功能能力的变化可能在介导肥胖妊娠结局....

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方案

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胎盘样本由俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学附属大学医院的产科与分娩科根据机构审查委员会批准的方案收集，并取得患者的知情同意。

1. 胎盘组织的采集

  1. 准备
    注意：所有接触组织的设备必须无菌。
    1. 将解剖器械在121 °C条件下高压灭菌60分钟。
    2. 使用个人防护装备（PPE）：实验服/防护服/刷手服、手套，以及带面罩或护目镜的口罩。
    3. 打开水浴锅并设定温度为 37 °C。
    4. 将两个50 mL离心管预热，每个离心管中加入25 mL完全培养基（Iscove改良的Dulbecco培养基，添加10% FBS和1%青霉素/链霉素）， 表3在37 °C水浴中。
    5. 在获得患者知情同意后，于剖宫产术后立即获取胎盘。
    6. 熟悉胎盘的结构。脐带附着于胎儿面（绒毛膜板），可见血管从脐带附着处呈放射状延伸。另一面为母体面，即底蜕膜板，包含蜕膜组织以及含有血管树的结构，称为叶状绒毛。
  2. 绒毛组织取样
    注意：胎盘绒毛组织应在分娩后尽快取样，最好在30分钟内完成。
    1. 将绒毛膜板朝上，使用镊子和剪刀，在距离胎盘边缘约2-3 cm处随机截取2-3块全层组织（大小约为2.5 c....

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结果

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来自瘦型孕妇（孕前体重指数（BMI） <25名未发生并发症妊娠且孕育女性胎儿的母亲在剖宫产（无产程）后15分钟内收集并取样。胎盘经检查确认无钙化且发育正常：去除脐带和胎膜后重量介于300–600 g，形状圆形，直径介于15–25 cm，脐带插入胎盘中央部位。从胎盘不同区域获取2–3个样本，将绒毛组织从底板和绒毛膜板上分离。图1)，获得约100克绒毛组织，作为原代滋养层细胞分离的起始材料。在取样绒毛组织后20分钟内，按照本文所述方法开始原代滋养层细胞的分离操作，可获得0.8–1 × 10⁶8 活细胞。将细胞以每平方厘米3 x 10的密度接种于6孔培养板中。6 (3.3 × 105 每平方厘米细胞数2）。培养24小时后，在显微镜下观察细胞贴壁情况，并确认滋养层细胞形态正常（单个圆形细胞）。将培养基更换为含125-10浓度梯度TNFα的完全培养基4 pg/mL，使得每个浓度和阴性对照（仅完全培养基）至少包.......

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讨论

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胎盘负责调控胎儿的生长发育，在母体肥胖环境中其功能会受到损害6。尽管滋养层细胞具有较高的代谢需求，但在母体肥胖情况下，胎盘表现出线粒体呼吸功能障碍6,19。胎盘代谢的改变可能与肥胖妊娠中并发症发生率升高以及不良胎儿结局有关3,6,7。母体肥胖还会影响胎盘中的自噬功能。来自伴有男性胎儿的肥胖妊娠的胎盘显示出自噬流功能障碍，表现为自噬体的积聚13。维持最佳的自噬流对细胞稳态至关重要，而母体肥胖胎盘中自噬功能的缺陷可能在介导肥胖妊娠相关不良结局中发挥重要作用。

母体肥胖所表现出的胎盘功能受损的精确病因尚不明确，其可能起源于炎症信号通路。肥胖和妊娠均属于促炎状态，其特征是循环中TNFα水平升高<.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢捐赠胎盘用于本研究的女性。我们还感谢俄勒冈健康与科学大学（OHSU）的产科与分娩科以及母胎研究团队在胎盘收集协调方面提供的支持。我们衷心感谢Eric Wang博士和Kelly Kuo医学博士在实验方法及优化过程中给予的支持与帮助。

本工作由美国国立卫生研究院（NIH HD076259A，AM）和美国心脏协会（AHA GRNT29960007，AM）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2（无水）Sigma-AldrichC1016-100G
MgSO4（无水）Sigma-AldrichM7506-500G
HepesFisher ScientificBP310-500
胰蛋白酶Gibco15090-046
DNA酶沃辛顿生化公司LS002139
蛋白酶/磷酸酶抑制剂赛默飞世尔科技88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTAInvitrogen15576-028
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
SDSFisher ScientificBP166-600
脱氧胆酸钠Fisher ScientificAAJ6228822
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
艾斯科夫’s 改良杜尔贝科培养基’s Medium（IMDM）Gibco12440-046
胎牛血清（FBS）康宁35-010-CV
新生牛血清（NCS）Gibco26010-074
青霉素/链霉素（Pen/Strep）Gibco15140-122
10% 甲醛Fisher Scientific23-427-098
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
TNFαSigma-AldrichSRP3177-50UG
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco70013-032
K2EDTA 真空采血管BD366450
Percoll（密度梯度介质，DGM）GE Healthcare17-0891-01
6孔板康宁353046
细胞筛Fisher Scientific22363549
Eppendorf Safe-Lock 管 2.0 mL，自然色Fisher Scientific22363352
台盼蓝康宁25-900-Cl
伯乐Mini-PROTEAN Tetra系统伯乐（Bio-Rad）1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot 转印槽伯乐（Bio-Rad）1658033
TGX FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12%Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 多用制胶室Bio-Rad1654112
4X Laemmli 上样缓冲液伯乐（Bio-Rad）1610747
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148-100ML
甘氨酸Bio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
速溶脱脂奶粉康乃馨
Rubicon (D9F7) 兔单克隆抗体Cell Signalling Technology8465S
单克隆抗-β-小鼠产生的肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA2228-100UL
抗兔 IgG，HRP 标记抗体Cell Signalling Technology7074S
抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体细胞信号技术公司7076S
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物赛默飞世尔科技34578

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M.

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重印与许可

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标签

TNF Rubicon

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