本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis elegans作为一种多功能的宿主模型，用于研究微生物相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
我们展示了一种利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式宿主研究微生物相互作用的方法。微生物通过饮食摄入，使肠道成为疾病发生的主要部位。线虫肠道在结构和功能上均模拟了哺乳动物肠道，且具有透明性，便于通过显微镜观察其定植过程。本文中我们证明，病原体可导致宿主患病甚至死亡。我们能够鉴定出毒力发生改变的微生物突变体。由于其对生物胁迫具有保守的先天免疫反应，C. elegans 是研究宿主先天免疫相互作用机制的优良体系。我们展示，双氧化酶基因发生突变的宿主无法产生活性氧物质，因而不能抵抗微生物侵袭。我们进一步通过实验证明该生存分析方法的多功能性：它可用于研究抑制微生物生长的抑制剂的作用效果。该检测方法还可用于发现真菌毒力因子，作为开发新型抗真菌药物的靶点，同时也为深入揭示宿主-微生物相互作用提供了机会。本实验设计适用于高通量全基因组筛选，而线虫可冷冻保存以供后续使用的特性，使其成为一种经济高效且极具吸引力的完整动物模型。
引言
C. elegans 作为强大的模式生物已被使用了五十多年。20世纪60年代，南非生物学家悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）率先利用 C. elegans 研究神经元发育，为后续众多科学家在线虫中研究细胞和动物生物学的各个方面奠定了基础。这一研究谱系包括因RNA干扰（RNAi）研究而获得诺贝尔奖的克雷格·梅洛（Craig Mello）和安德鲁·法尔（Andrew Fire）1，因器官发育与细胞凋亡研究而获奖的罗伯特·霍维茨（Robert Horvitz）和约翰·苏尔斯顿（John Sulston）2,3,4，以及因绿色荧光蛋白研究而获奖的马丁·查尔菲（Martin Chalfie）5。尽管该模式生物传统上被用于分子和发育生物学研究，但在过去15年中，研究人员已开始利用 C. elegans 探讨多种人类病原体的生物学特性，包括 Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Salmonella enterica 和 Serratia marcescens
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方案
1. 线虫生长培养基（NGM）的制备
- 配制 1 L 培养基时，将 20 g 琼脂、2.5 g 有机氮源（例如，胰蛋白胨）和 3 g 氯化钠加入 2 L 三角瓶中。加入 975 mL 无菌水。
- 加入无菌搅拌子。若使用自动培养基分装仪，将管路和培养基一起高压灭菌 15 分钟；若配制体积更大，则需延长灭菌时间。
- 将培养基置于磁力搅拌器上，使其冷却。
- 当培养基冷却至手感温热（约 60 °C）时，在无菌条件下加入 1 mL 1 M MgSO4● H2O、1 mL 1 M CaCl2、25 mL KPO4 和 1 mL 0.5% 乙醇胆固醇溶液。
- 在超净工作台中，通过手动或自动泵将培养基倒入无菌的 35 mm × 10 mm 培养皿中。使用前在通风橱内干燥 1–2 天。
注意：培养皿应保存在 4 °C 以防止污染。
2. 制作线虫挑针
- 剪取一段1.5 cm的铝丝。小心地将其中约0.5 cm插入巴斯德吸管的尖端。
- 使用本生灯或酒精灯，将玻璃吸....
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结果
致病性检测实验（图1）使用 C. albicans 和 秀丽隐杆线虫 此前已被我们实验室报道17,18 及其他实验室19,20我们展示了使用该方法的可行性 秀丽隐杆线虫 用于研究 C. albicans 毒力表明 C. albicans 细胞被线虫迅速摄取并在肠腔内积聚，导致运动减缓、肛门区域畸形（Dar）图2A），外阴肿胀（图 2B），肠管扩张（图3A），以及致死率（图3<.......
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讨论
我们所描述的用于检测 C. elegans 在整个生命周期暴露于 C. albicans 时感染情况和存活率的方法，可经修改后用于测试其他病原体。其他细菌或真菌的液体培养物可采用类似方式制备，并饲喂给 C. elegans。此外，可通过连续感染的方式进行检测：首先按照所述方法使幼虫暴露于一种病原体，待其发育至成虫后，再将线虫转移至含有另一种病原体的新培养板上。
进行该实验时，需特别注意时间控制。首先，在制备卵以收获实验用卵的过程中，必须严格限制卵暴露于次氯酸钠溶液的时间。次氯酸钠溶液溶解成虫以释放卵所需的时间因情况而异。加入次氯酸钠溶液后，必须立即在解剖显微镜下密切观察线虫混合液。当约70%的成虫已解体时，应立即进行离心。若卵的制备未能获得可存活的卵，可降低次氯酸钠的浓度或缩短暴露时间。完成该实验时，还需注意根据需要及时将成虫转移至新的培养板，以避免实验对象与其子代混淆。实验开始时，将接种卵的数量控制在25至30个，也有助于防止此类情况发生。此外，频繁地将成虫转移至新培养板，还可降低线虫爬至培养皿边缘而死亡的风险。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作在伍斯特理工学院完成，并由该机构提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂（颗粒状，细菌学级） | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| 铝丝（95% 铂，32 号规格） | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss 倒置显微镜 | Axiovision Zeiss | ||
| 蛋白胨（Bacto-Peptone） | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| 秀丽隐杆线虫 Bli-3 品系 | 秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center） | Bli-3(e767) CB767 | |
| 氯化钙 | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| 胆固醇，Sigma 级，纯度不低于 99% | Sigma | C8667-25G | |
| 一次性培养管（20 x 150 mm） | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| 解剖显微镜（NI-150 高强度照明器） | Nikon Instrument Inc. | ||
| 大肠杆菌（E. coli） | 秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center） | OP50 | |
| GraphPad Prism（生存曲线分析软件） | GraphPad Software | ||
| LB 肉汤（Miller's 配方） | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| 硫酸镁 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| 中等规格培养皿（35 × 10 mm） | Falcon | 353001 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | P0662-500G | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| 磷酸钠 | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| 白色念珠菌野生型 SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| 野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans） | 秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center） | N2 |
参考文献
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell.
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