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秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

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DOI：

10.3791/56487

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2017年10月18日

 ,  , 
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

本文内容

摘要

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis elegans作为一种多功能的宿主模型，用于研究微生物相互作用。

摘要

我们展示了一种利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式宿主研究微生物相互作用的方法。微生物通过饮食摄入，使肠道成为疾病发生的主要部位。线虫肠道在结构和功能上均模拟了哺乳动物肠道，且具有透明性，便于通过显微镜观察其定植过程。本文中我们证明，病原体可导致宿主患病甚至死亡。我们能够鉴定出毒力发生改变的微生物突变体。由于其对生物胁迫具有保守的先天免疫反应，C. elegans 是研究宿主先天免疫相互作用机制的优良体系。我们展示，双氧化酶基因发生突变的宿主无法产生活性氧物质，因而不能抵抗微生物侵袭。我们进一步通过实验证明该生存分析方法的多功能性：它可用于研究抑制微生物生长的抑制剂的作用效果。该检测方法还可用于发现真菌毒力因子，作为开发新型抗真菌药物的靶点，同时也为深入揭示宿主-微生物相互作用提供了机会。本实验设计适用于高通量全基因组筛选，而线虫可冷冻保存以供后续使用的特性，使其成为一种经济高效且极具吸引力的完整动物模型。

引言

C. elegans 作为强大的模式生物已被使用了五十多年。20世纪60年代，南非生物学家悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）率先利用 C. elegans 研究神经元发育，为后续众多科学家在线虫中研究细胞和动物生物学的各个方面奠定了基础。这一研究谱系包括因RNA干扰（RNAi）研究而获得诺贝尔奖的克雷格·梅洛（Craig Mello）和安德鲁·法尔（Andrew Fire）1，因器官发育与细胞凋亡研究而获奖的罗伯特·霍维茨（Robert Horvitz）和约翰·苏尔斯顿（John Sulston）2,3,4，以及因绿色荧光蛋白研究而获奖的马丁·查尔菲（Martin Chalfie）5。尽管该模式生物传统上被用于分子和发育生物学研究，但在过去15年中，研究人员已开始利用 C. elegans 探讨多种人类病原体的生物学特性，包括 Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Salmonella enterica 和 Serratia marcescens6,7,8,9,10。这些研究表明，许多参与人类与病原体相互作用的机制在线虫中是保守的，但也存在一些仅在此模式生物中特有的免疫机制11,12。在自然环境中，C. elegans 会遭遇土壤中摄入性病原体的多种威胁，这促使它在肠道腔内进化并维持了一套复杂的先天免疫系统。参与肠道腔保护的许多基因和机制由高度保守的元件调控，而这些元件在高等哺乳动物中同样存在11,13。因此，C. elegans 是研究如 Salmonella enterica14、Shigella boydii15 或 Vibrio cholerae16 等胃肠道病原体的优良模型。

本文强调了秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为研究感染性病原体（如白色念珠菌 C. albicans）的模式宿主所具备的显著多功能性。C. elegans作为模式宿主可用于高通量筛选毒力因子，相较于常用于研究念珠菌病的小鼠模型，该方法成本更低且耗时更短42。

本研究显示，该模型及相关生存分析可可靠地用于研究宿主先天免疫效应因子（对抵抗感染至关重要）、驱动毒力的病原体决定因子以及可干预发病过程的药理学化合物。与先前报道的检测方法不同，该方法能够研究动物从幼虫阶段到成虫阶段整个生命周期内对病原体的暴露情况，而不仅限于从成年到死亡阶段43,44。总之，我们的 C. elegans - C. albicans 模型是一种多功能且强大的工具，不仅可用于研究驱动感染与免疫的遗传基础，还可用于发现可用于治疗干预的新化合物。

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方案

1. 线虫生长培养基（NGM）的制备

  1. 配制 1 L 培养基时，将 20 g 琼脂、2.5 g 有机氮源（例如，胰蛋白胨）和 3 g 氯化钠加入 2 L 三角瓶中。加入 975 mL 无菌水。
    1. 加入无菌搅拌子。若使用自动培养基分装仪，将管路和培养基一起高压灭菌 15 分钟；若配制体积更大，则需延长灭菌时间。
  2. 将培养基置于磁力搅拌器上，使其冷却。
    1. 当培养基冷却至手感温热（约 60 °C）时，在无菌条件下加入 1 mL 1 M MgSO4● H2O、1 mL 1 M CaCl2、25 mL KPO4 和 1 mL 0.5% 乙醇胆固醇溶液。
    2. 在超净工作台中，通过手动或自动泵将培养基倒入无菌的 35 mm × 10 mm 培养皿中。使用前在通风橱内干燥 1–2 天。
      注意：培养皿应保存在 4 °C 以防止污染。

2. 制作线虫挑针

  1. 剪取一段1.5 cm的铝丝。小心地将其中约0.5 cm插入巴斯德吸管的尖端。
    1. 使用本生灯或酒精灯，将玻璃吸管尖端在火焰中缓慢旋转加热，直至铝丝牢固地粘附在吸管上，同时确保吸管尖端的原始形状不受影响。

3. 制备 E. coli 培养

  1. 使用无菌接种环，挑取单个菌落 大肠杆菌 在200 mL LB液体培养基中接种OP50菌株，37 °C振荡培养过夜。
  2. 液体培养物在第二天即可使用，不使用时可保存于 4 °C。
    注意：该 E. coli 菌株OP50用作食物来源 秀丽隐杆线虫 该培养物在 4 °C 下保存时可使用长达数月。

4. C. elegans 培养的基本操作

  1. 用制备好的NGM琼脂平板播种 E. coli 通过将约50 - 100 µL制备好的OP50液体培养物点种于平板中央。
  2. 盖上培养皿，室温下静置干燥24小时。干燥后，如需快速生长，将培养皿置于37 °C过夜；若希望生长较慢，可保持在室温条件下。
  3. 通过以下任一方法将线虫添加到培养皿中 "分块处理，" （参见方案步骤 5） "分段与挑取线虫"），单独挑取线虫，或将线虫卵直接放置到培养板上（参见方案步骤6 "卵母细胞制备").

5. 线虫分段与挑取

注意："分块转移" 是 C. elegans 培养中常用的一种操作，指切割含有线虫的 NGM 琼脂平板部分，并将该片段转移至新平板，从而实现大量线虫的同步转移。此方法也可用于切除平板上的污染区域。在挑取线虫时，应保持琼脂表面完整，避免线虫落入琼脂上的孔洞中而丢失。此外，挑虫工具在接触平板前需充分冷却，以防止熔化琼脂或烫伤线虫。

  1. 为了快速将大量线虫转移到新培养皿上，使用刮铲切割含有目标线虫的一小块NGM琼脂。取下切下的琼脂块，将其有菌面朝下放置在新培养皿上OP50菌苔边缘。
  2. 使用线虫挑取工具单独转移线虫，具体操作如下文第8.2步"生存实验"所述。将线虫挑针的金属丝在火焰上灼烧至发红，然后从火焰中取出，静置数秒使其冷却。
  3. 用挑针上的金属丝轻轻刮取新培养皿上OP50菌苔，使金属丝表面沾满菌液。
  4. 金属丝尖端覆盖的黏稠菌液可使线虫附着于针尖，从而通过轻拂动作温和地挑起目标线虫。
  5. 收集到目标线虫后，通过在琼脂表面轻轻划动沾有菌液的金属丝，将线虫转移至新培养皿。随后将金属丝再次插入火焰中，以清除挑针上残留的菌液。

6. 卵母细胞准备

  1. 转移约20只成年动物（在20 °C培养条件下孵化后约2–3天），通过挑取或块状转移的方法，具体操作如方案步骤5所述。 "分块与挑取线虫，" 接种到含有50 µL大肠杆菌OP50菌株的培养板上。
  2. 1-2天后，向平板中加入10 mL M9缓冲液以收集卵。使用玻璃刻度移液管轻轻旋转并搅动琼脂平板上的内容物，使粘附在OP50或成虫上的卵释放出来。收集含有卵和成虫的全部液体。
  3. 将M9和OP50溶液转移至15 mL离心管中。在2,100 x g条件下离心15 mL离心管2分钟。
  4. 吸出约 9 mL 上清液，注意不要扰动 OP50 沉淀。
  5. 将沉淀重悬于2 mL无菌水、1 mL次氯酸钠溶液和1 mL 0.25 M NaOH中。
  6. 轻轻颠倒混匀，直至大部分（约70%）成虫裂解；由于卵壳的存在，卵通常在此短暂的漂白处理过程中保持完整。将锥形管在990 × g下离心2分钟。
  7. 吸弃上清液，勿扰动沉淀。用10 mL M9缓冲液重悬沉淀。
  8. 将锥形管在990 × g下离心2分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀。用200 µL M9缓冲液重悬沉淀。
    注意：卵的制备可能需要多次尝试。如果卵暴露于次氯酸钠溶液时间过长，可能导致卵死亡。若卵未能孵化，可降低溶液中次氯酸钠的浓度，或缩短卵与次氯酸钠的接触时间。

7. 感染板的设置

  1. 用无菌移液管向无菌试管中加入 3–5 mL YPD 培养基，并用无菌接种环接种一株白色念珠菌（Candida albicans）单菌落。
    1. 将试管置于旋转摇床中，在 30 °C 下培养约 16–18 小时。
  2. 标记两个 1.5 mL 微量离心管，分别用于盛装 C. albicans 和 OP50。记录每个空管的重量。
    1. 将 500 µL 过夜培养的 C. albicans 菌液加入标记为 C. albicans 的离心管中，将 1,500 µL 过夜培养的 OP50 菌液（来自步骤 3.1）加入标记为 OP50 的离心管中。
    2. 在 16,100 × g 条件下离心 10 分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
    3. 用 500 µL 无菌水重悬每个沉淀，在 16,100 × g 条件下离心 5 分钟。
    4. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。记录微量离心管的最终重量。
    5. 通过从最终重量中减去微量离心管的初始重量，计算每个沉淀的重量。
  3. 使用无菌水将 C. albicans 沉淀重悬至浓度为 10 mg/mL，将 OP50 沉淀重悬至浓度为 200 mg/mL。通过混合以下组分制备主感染混合液：10 µL 浓度为 50 mg/mL 的链霉素溶液、2.5 µL OP50 菌液、0.5 µL C. albicans 菌液以及 7 µL 无菌水。
    1. 对于对照组平板，用无菌水替代 C. albicans 菌液的体积，制备主对照混合液。使用微量移液器将 20 µL 感染混合液或 OP50 对照溶液接种至 NGM 平板中央。
      注：分析时需要约 100 条线虫以确保统计学显著性。该实验通常设置三个重复。因此，需制备 3.2 倍体积的感染混合液和对照溶液。制备略高于 3 倍体积的混合液是为了确保每块平板均能准确接种完整的 20 µL，预留操作误差空间。之所以采用此主混合液方案，是因为线虫在早期幼虫阶段（L1–L3）咽部过小，无法摄取 C. albicans。若需暴露于氟康唑等药理学试剂（图 3B），可将试剂加入感染混合液中。试剂浓度需通过实验确定。例如，在 图 3B 中展示了 50 µM 氟康唑的处理结果，但同样使用该方案测试了 0、12.5、25、50 和 100 µM 氟康唑的不同浓度。

8. 变形肛门区（Dar）表型分析与存活率检测

  1. 观察Dar表型
    注意：Dar表型在L3阶段及之后最为明显。Dar表现为线虫肛门后区域的一个微小突起（图2A），且随时间推移逐渐变得更加显著。
    1. 通过轻敲解剖显微镜载物台上的培养板快速确认动物是否具有Dar表型；无Dar的个体将立即向后移动，而具有Dar的个体则需要多次敲击才能反转运动方向，或完全无法反转。
  2. 生存实验
    1. 按照先前步骤6“"卵的制备"中所述方法完成卵的制备。在解剖镜下计数卵的数量，并用M9缓冲液稀释卵悬液，直至浓度达到每µL约含5–6个健康卵。使用移液器将20 µL含约30个卵的样品滴加到已准备好的NGM平板上，位置位于细菌培养区与平板边缘之间（卵和线虫食物OP50应分别置于两个不同位置）。
    2. 将平板在20 °C下培养48小时。在解剖显微镜下统计每块平板上存活和死亡的成虫数量，以及具有Dar表型的线虫数量。记录具有Dar表型个体的百分比。
    3. 若线虫在头部被铝丝轻触或轻敲培养板后无任何反应，则视为已死亡。
    4. 每隔一天，按照步骤5“"分块与挑取线虫"所述方法，将剩余的成虫转移至新的感染组或对照组平板上。此时，可通过每日记录存活、死亡及丢失的线虫数量来进行生存分析。
      注意：该实验可持续两周，从卵的制备开始。此外，卵悬液不应直接滴加在细菌培养区域，因为溶液中可能残留微量次氯酸钠，会杀死OP50细菌。同时，滴加位置应距离平板边缘约0.5 cm，以避免卵卡在培养皿壁与琼脂之间。此外，由于线虫繁殖迅速，将成虫转移到新平板至关重要，以便将其与其后代分离。
  3. 分析生存数据
    1. 使用生存曲线分析软件分析结果（参见材料列表）。
    2. 采用Gehan-Breslow-Wilcoxon法（假设早期生存时间的数据比后期更准确，据此对数据加权）以及Logrank统计工具比较生存曲线45。
      注意：例如，在图4B-C中，经突变型C. albicans处理的线虫生存情况与同源野生型对照组或互补菌株处理组进行了比较。

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结果

致病性检测实验（图1）使用 C. albicans 和 秀丽隐杆线虫 此前已被我们实验室报道17,18 及其他实验室19,20我们展示了使用该方法的可行性 秀丽隐杆线虫 用于研究 C. albicans 毒力表明 C. albicans 细胞被线虫迅速摄取并在肠腔内积聚，导致运动减缓、肛门区域畸形（Dar）图2A），外阴肿胀（图 2B），肠管扩张（图3A），以及致死率（图3<...

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讨论

我们所描述的用于检测 C. elegans 在整个生命周期暴露于 C. albicans 时感染情况和存活率的方法，可经修改后用于测试其他病原体。其他细菌或真菌的液体培养物可采用类似方式制备，并饲喂给 C. elegans。此外，可通过连续感染的方式进行检测：首先按照所述方法使幼虫暴露于一种病原体，待其发育至成虫后，再将线虫转移至含有另一种病原体的新培养板上。

进行该实验时，需特别注意时间控制。首先，在制备卵以收获实验用卵的过程中，必须严格限制卵暴露于次氯酸钠溶液的时间。次氯酸钠溶液溶解成虫以释放卵所需的时间因情况而异。加入次氯酸钠溶液后，必须立即在解剖显微镜下密切观察线虫混合液。当约70%的成虫已解体时，应立即进行离心。若卵的制备未能获得可存活的卵，可降低次氯酸钠的浓度或缩短暴露时间。完成该实验时，还需注意根据需要及时将成虫转移至新的培养板，以避免实验对象与其子代混淆。实验开始时，将接种卵的数量控制在25至30个，也有助于防止此类情况发生。此外，频繁地将成虫转移至新培养板，还可降低线虫爬至培养皿边缘而死亡的风险。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作在伍斯特理工学院完成，并由该机构提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂（颗粒状，细菌学级）Apex BioResearch Products20-248
铝丝（95% 铂，32 号规格）Genesee Scientific59-1M32P
Axiovision Zeiss 倒置显微镜Axiovision Zeiss
蛋白胨（Bacto-Peptone）Fisher BioReagantsBP1420-500
秀丽隐杆线虫 Bli-3 品系秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）Bli-3(e767) CB767
氯化钙Fisher ScientificBP51-250
胆固醇，Sigma 级，纯度不低于 99%SigmaC8667-25G
一次性培养管（20 x 150 mm）FIsherBrand14-961-33
解剖显微镜（NI-150 高强度照明器）Nikon Instrument Inc.
大肠杆菌（E. coli）秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）OP50
GraphPad Prism（生存曲线分析软件）GraphPad Software
LB 肉汤（Miller's 配方）Apex BioResearch Products11-120
硫酸镁Fisher Scientific10034-99-8
中等规格培养皿（35 × 10 mm）Falcon353001
磷酸二氢钾SigmaP0662-500G
氯化钠Fisher ScientificBP358-1
磷酸钠Fisher ScientificBP332-500
白色念珠菌野生型 SC5314ATCCSC5314
野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans）秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）N2

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