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方法文章

利用划痕试验评估牛皮质骨的脆性

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DOI：

10.3791/56488

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2017年11月30日

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of Illinois at Urbana Champaign, 2Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana Champaign

本文内容

摘要

本研究通过显微划痕试验评估牛皮质骨在亚介观尺度下的断裂韧性。该方法是一种原创、客观、严谨且可重复的技术，旨在探究宏观尺度以下的断裂韧性。其潜在应用包括研究骨质疏松等疾病导致的骨脆性变化。

摘要

骨是一种具有五个不同层级结构的复杂分层材料。衰老和骨质疏松等疾病会增加骨的脆性，使其易于发生骨折。由于骨折在社会中具有重大的社会经济影响，因此亟需开发新的方法来评估骨各层级结构的力学性能。尽管刚度和强度可以在纳米、微观、介观和宏观等所有尺度上进行探测，但目前对骨折的评估仍局限于宏观测试。这一限制阻碍了我们对骨骨折机制的理解，并制约了实验室和临床研究的范围。在本研究中，我们结合非线性断裂力学的微划痕测试方法，从微观到介观尺度研究骨的抗断裂能力。实验在牛皮质骨样本的短纵向方向上进行。我们建立了一套严谨的实验方案，并开展了大量（102次）测试，在考虑骨微结构异质性的前提下，系统评估皮质骨样本的断裂韧性。

引言

本研究采用一种新型的微划痕技术，在介观尺度（骨单位）到微观尺度（层板水平）上测量牛密质骨的断裂韧性1,2,3,4,5。由于骨在不同层级上具有不同的结构组分和组织方式，裂纹萌生和裂纹扩展等断裂过程直接受到尺度效应的影响。因此，在更小的长度尺度上评估骨断裂行为，对于深入理解骨脆性具有重要意义。一方面，通常在牛股骨和胫骨上进行三点弯曲、紧凑拉伸和挠曲等常规测试，以实现宏观尺度上的断裂表征6,7,8。另一方面，为测量微观尺度下的断裂韧性，已有研究提出采用维氏压痕断裂法9，即使用维氏压头进行显微压痕以产生径向裂纹。此外，还采用锐利的立方角压头实施Oliver-Pharr纳米压痕断裂韧性测试方法10。

在上述基于纳米压痕的断裂韧性研究中，所产生的裂纹长度由观察者进行测量，并采用半经验模型计算断裂韧性。然而，这些方法缺乏可重复性，具有主观性，且结果高度依赖于观察者的技能，因为需要借助光学显微镜或扫描电子显微镜来测量裂纹长度。此外，尽管划痕试验在纳米尺度上进行，但其背后的数学模型并非基于物理机制，因为它未考虑裂纹和缺陷导致的强度降低11。因此，目前存在知识空白：即缺乏一种基于物理机制模型的微观断裂评估方法。这一知识空白促使研究者将微划痕试验应用于致密骨，并首先以猪骨样本为研究对象5。目前，该研究已进一步拓展至牛皮质骨的研究。

样本有两种不同的取向：横向纵向和短纵向。横向纵向对应于股骨纵向轴垂直方向的断裂特性，而短纵向则对应于沿股骨纵向轴方向的断裂特性5。在本研究中，我们对牛皮质骨进行划痕测试，以表征其在短纵向方向上的抗断裂性能。

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方案

注意：此处描述的实验方案遵循伊利诺伊州机构动物护理和使用委员会的动物护理指南。

1. 标本获取

  1. 从美国农业部（USDA）认证的屠宰场收集新鲜收获的牛股骨，并用塑料密封袋装好后置于冷藏箱中运输。
    注意：本研究中使用的股骨来自年龄为24至30个月、以玉米喂养、体重约为1,000至1,100磅的动物。
  2. 将股骨在-20 °C下冷冻，直至开始试样制备程序。该温度可保持股骨的新鲜状态12,13,14。

2. 样品的切割、清洗与包埋

  1. 在室温下，将冷冻的股骨放入盛有水的容器中解冻约 2 小时。
  2. 使用台式金刚石带锯从股骨骨干中段区域切割出多个厚度约为 10 - 15 mm 的圆盘，以获得具有均匀皮质骨横截面积的样品。
  3. 使用解剖工具去除附着在皮质骨上的任何软组织或肌肉。
  4. 在低速锯上使用金刚石切片刀片，在湿润条件下沿骨的纵向轴线切割第 2.2 步获得的股骨横截面，得到多个大致呈立方体状的样品。
    注：此处仅讨论短-纵向取向样品的制备以及在其上进行的划痕试验。然而，除切割方向外，横向取向样品的制备流程完全相同。
  5. 将样品置于由 1.5% 阴离子清洁剂和 5% 漂白剂配制的溶液中，在超声波清洗器中清洗 20 分钟。
  6. 将皮质骨样品包埋于丙烯酸树脂（本文中为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA））中，以便于操作和保持稳定。
    1. 进行包埋时，首先在模具内壁涂上脱模剂。然后按照 PMMA 生产商提供的说明，在烧杯中混合丙烯酸树脂和固化剂。
    2. 将切割好的皮质骨样品逐一放入模具中，使待划痕的表面朝下。将配好的丙烯酸树脂混合物倒入已放置样品的模具中。让样品固化 4 - 5 小时。
  7. 使用低速锯将包埋后的样品切割成厚度为 5 mm 的圆盘，暴露出待划痕的表面，并使用氰基丙烯酸酯胶将样品粘附于直径 34 mm、高度 5 mm 的金属（铝）圆盘上。
  8. 用浸有汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的纱布包裹样品，并在 4 °C 下冷藏保存，待后续使用15,16。

3. 研磨与抛光方案

注意：在微小尺度上进行高精度测试的前提是试样表面光滑且平整。以往的抛光方案13,17会导致较大的表面粗糙度，从而引起测量结果的显著误差。挑战在于如何在较大的面积（3 × 8 mm2）上实现低于100 nm的平均表面粗糙度。

  1. 在室温下，分别使用400目和600目碳化硅砂纸对牛皮质骨试样进行研磨，时间分别为1分钟和5分钟。研磨抛光机的底盘转速分别保持在100 rpm和150 rpm。
  2. 在室温下，使用800目和1,200目砂纸对牛皮质骨试样进行机械研磨，每步持续15分钟。保持研磨抛光机底盘转速为150 rpm，转头转速为60 rpm，工作载荷为1 lb。
  3. 在室温下，依次使用3 µm、1 µm和0.25 µm的金刚石悬浮液，在硬质、带孔、非织造布上对试样进行抛光，每步持续90分钟。每步操作载荷保持在1 lb，抛光机底盘转速和转头转速分别为300 rpm和60 rpm。
  4. 在室温下，使用0.05 µm的氧化铝悬浮液，在柔软的合成纤维布上对试样进行抛光，持续90分钟，载荷为1 lb，底盘转速和转头转速分别为100 rpm和60 rpm。
  5. 在每次连续的研磨和抛光步骤之间，将试样放入盛有去离子水的烧杯中，并将烧杯置于超声波清洗仪中清洗2分钟，以清除残留物并避免交叉污染。
  6. 使用光学显微镜和扫描电镜（SEM）成像观察表面形貌。
    注：如图1所示，在牛皮质骨试样上可观察到骨单位、哈弗斯管、黏合线、间质区以及骨陷窝。这些成像方法揭示了皮质骨试样的多孔性、异质性和各向异性特征。此外，还对试样进行了高级表面检测，以评估抛光表面的质量。代表性抛光表面如图2所示。

4. 微划痕试验

注意：使用微划痕测试仪对抛光的牛皮质骨试样进行微划痕试验（图3）。研究中采用金刚石洛氏压头，其尖端半径为200 µm，锥角为120°。该仪器可施加最高达30 N的线性递增载荷。此外，仪器配备高精度传感器，用于测量划痕过程中产生的水平载荷、压入深度和声发射信号。仪器能够捕捉划痕沟槽的全景图像。

  1. 在测试皮质骨试样之前，使用聚碳酸酯作为参考材料校准洛氏压头尖端3。
  2. 将皮质骨试样放置在载物台上，并利用集成在微划痕测试模块中的光学显微镜选择划痕测试的位置。
  3. 施加线性递增载荷，起始载荷为 30 mN，终止载荷为 30 N。加载速率应设置为 60 N/min，划痕长度为 3 mm。
  4. 按照图3所示，在短纵向（图3b）牛皮质骨试样上进行一系列划痕测试。
  5. 每完成三到四次划痕测试后，用HBSS润湿试样表面，以保持其水合状态。
  6. 基于非线性断裂力学模型分析划痕测试数据2。

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结果

采用原子力显微镜测量抛光表面的粗糙度。通常情况下，若表面粗糙度比所关注的表面特征小一个数量级，则可认为该样品达到了良好的抛光标准。本例中，在 40 µm × 40 µm 区域内测得的表面粗糙度为 60 nm，明显符合该标准。

图4展示了在短纵向牛皮质骨试样上进行的代表性划痕试验中，力随穿透深度变化的曲线图。其中，垂直方向的力为设定的增量载荷，水平方向的力为探针所受到的实测阻力。图5展示了断裂的短纵向牛皮质骨表面的扫描电子显微镜图像。该图像显示了表面出现的碎裂和剥落现象，以及内在增韧机制的发生，如微裂纹、裂纹偏转和裂纹桥接。微划痕试验数据采用基于非线性断裂力学建模的MATLAB脚本进行分析2。在断裂过程发生之前，存在塑性耗散18。随着穿透深度...

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讨论

微划痕试验会引发混合模式断裂3。此外，在短纵向牛皮质骨试样中，随着探针切入更深，断裂过程被激活。对于长度为3 mm的划痕，所探测的棱柱形体积约为3,600 µm长、600 µm宽、480 µm深。这一较大的探测体积有助于预测均质化的力学响应。通过非线性断裂力学模型，我们能够基于J积分计算提取出断裂抗力1,2,4。

与先前研究中使用的猪皮质骨样本相比，牛皮质骨样本提供了更大的测试面积5。然而，从猪到牛的皮质骨样本，其微观结构特征的尺寸也存在相应差异。这促使我们为牛皮质骨样本开发了一种新的抛光方案。此外，在方法开发过程中发现，制备好的牛皮质骨样本需在制备后一周内完成测试，以避免因生理盐水溶液在样本表面形成残留物，从而显著影响测试结果。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校土木与环境工程系以及工程学院的支持。我们感谢Ravindra Kinra和Kavita Kinra奖学金对Kavya Mendu研究生学习的资助。扫描电子显微镜分析在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Frederick Seitz材料研究实验室和贝克曼研究所的设施中完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
台式金刚石带锯McMaster Carr, Elmhurst, IL型号  C-40锯带速度为 40 英里/小时；锯带尺寸：直径 37 英寸，宽 0.02 英寸，深 0.14 英寸
Buehler Isomet 5000 精密切割机Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044112780刀片转速范围为 200–5000 rpm，以 50 rpm 为增量调节；配备 8 英寸金刚石切片刀片
Branson 5800 超声波清洗器（通过）Grainger, Peoria, Illinois39J365Bransonic CPXH 超声波清洗槽容量为 2.5 加仑
Buehler Ecomet 250 研磨抛光机Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 600444972508 英寸底板，转速范围为 10–500 rpm
Anton Paar, CSM Instruments 微划痕测试仪Anton Paar Switzerland AG163251紧凑型平台，配备声发射传感器
JEOL 6060LV 通用型扫描电子显微镜JEOL USA, Inc., Peabody, MA环境扫描电子显微镜，可在低真空条件下成像
Philips XL30 ESEM FEG FEI Company仪器的湿模式工作状态可实现对非导电样品的成像，且无需对样品进行处理 
名称公司目录编号备注
耗材
牛股骨L&M 屠宰场，Georgetown, IL玉米喂养，24–30 月龄的成年牛样本
Alconox 粉末精密清洗剂Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 106031104-1可生物降解、非腐蚀性、无干扰残留物
丙烯酸塑料包埋材料Electron Microscopy Sciences24210-02聚甲基丙烯酸甲酯
CarbiMet 碳化硅研磨纸，400 目，8 英寸，带压敏背胶Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 6004436080400研磨用研磨纸
CarbiMet 碳化硅研磨纸，600 目，8 英寸，带压敏背胶Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 6004436080600研磨用研磨纸
MicroCut 研磨盘，800 目，8 英寸，带压敏背胶Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 6004436080800研磨用研磨纸
MicroCut 研磨盘，800 目，8 英寸，带压敏背胶Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 6004416081200研磨用研磨纸
Texmet P 8 英寸抛光布，带压敏背胶Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044407638抛光布
8 英寸 Microcloth 抛光布，带压敏背胶Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044407518抛光布
Meta Di Supreme 多晶金刚石抛光悬浮液，3 µmBuehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044406631抛光悬浮液
Meta Di Supreme 多晶金刚石抛光悬浮液，1 µmBuehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044406630抛光悬浮液
Meta Di Supreme 多晶金刚石抛光悬浮液，0.25 µmBuehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044406629抛光悬浮液
MasterPrep 抛光悬浮液，0.05µmBuehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 6004440-6377-032抛光悬浮液
HBSS，含钙、含镁，不含酚红Thermo Fisher Scientific14025126缓冲液

参考文献

  1. Akono, A., Reis, P., Ulm, F. Scratching as a fracture process: From butter to steel. Phys Rev Lett. 106 (20), 204302-204304 (2011).
  2. Akono, A. T., Randall, N. X., Ulm, F. J. Experimental determination of the fracture toughness via microscratch tests: application to polymers, ceramics, and metals. J of Mat Res. 27 (02), 485-493 (2012).
  3. Akono, A. T., Ulm, F. J. An improved technique for characterizing the fracture toughness via scratch test experiments. Wear. 313 (1-2), (2014).
  4. Akono, A. T. Energetic size effect law at the microscopic scale: Application to progressive-load scratch testing. J of Nanomech and Micromech. 6 (2), (2016).
  5. Kataruka, A., Mendu, K., Okeoghene, O., Puthuvelil, J., Akono, A. -T. Microscopic assessment of bone toughness using scratch tests. Bone Reports. 6, 17-25 (2017).
  6. Melvin, J. W., Evans, F. G. Crack propagation in bone. ASME Biomech Symp. , New York. (1973).
  7. Norman, T. L., Vashishth, D., Burr, D. B. Effect of groove on bone fracture toughness. J of Biomech. 25 (12), 1489-1492 (1992).
  8. Behiri, J. C., Bonfield, W. Crack velocity dependence of longitudinal fracture in bone. J of Mat Sc. 15 (7), 1841-1849 (1980).
  9. Mullins, L. P., Bruzzi, M. S., McHugh, P. E. Measurement of the microstructural fracture toughness of cortical bone using indentation fracture. J of Biomech. 40 (14), 3285-3288 (2007).
  10. Harding, D. S., Oliver, W. C., Pharr, G. M. Cracking during nanoindentation and its use in the measurement of fracture toughness. MRS Proceedings. 356, Cambridge University Press. 663-668 (1994).
  11. Islam, A., Dong, X. N., Wang, X. Mechanistic modeling of a nanoscratch test for determination of in situ toughness of bone. J of the Mech Bhvr of Biomed Mat. 5 (1), 156-164 (2012).
  12. McAlden, R. W., McGeogh, J. A., Barker, M. B., Court-Brown, C. M. Age-related changes in the tensile properties of cortical bone: the relative importance of changes in porosity, mineralization and microstructure. J. Bone Joint Surg. 75, 1193-1205 (1993).
  13. Zioupos, P., Gresle, M., Winwood, K. Fatigue strength of human cortical bone: age, physical, and material heterogeneity effects. J of Biomed Mat Res Part A. 86 (3), 627-636 (2008).
  14. Linde, F., Sørensen, H. C. F. The effect of different storage methods on the mechanical properties of trabecular bone. J of Biomech. 26 (10), 1249-1252 (1993).
  15. Zioupos, P. Accumulation of in-vivo fatigue microdamage and its relation to biomechanical properties in ageing human cortical bone. J of Microscopy. 201 (2), 270-278 (2001).
  16. Yan, J., Clifton, K. B., Mecholsky, J. J., Reep, R. L. Fracture toughness of manatee rib and bovine femur using a chevron-notched beam test. J of Biomech. 39 (6), 1066-1074 (2006).
  17. Xu, J., Rho, J. Y., Mishra, S. R., Fan, Z. Atomic force microscopy and nanoindentation characterization of human lamellar bone prepared by microtome sectioning and mechanical polishing technique. J of Biomed Mat ResPart A. 67 (3), 719-726 (2003).
  18. Yan, J., Mecholsky, J. J., Clifton, K. B. How tough is bone? Application of elastic–plastic fracture mechanics to bone. Bone. 40 (2), 479-484 (2007).
  19. Ritchie, R. O. The conflicts between strength and toughness. Nat Mater. 10 (11), 817-822 (2011).
  20. Kim, K. T., Bažant, Z. P., Yu, Q. Non-uniqueness of cohesive-crack stress-separation law of human and bovine bones and remedy by size effect tests. Intrnl J of Frac. 181 (1), 67-81 (2013).
  21. Bazant, Z. P., Planas, J. Fracture and size effect in concrete and other quasibrittle materials. 16, CRC press. (1997).

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