本文描述了一种制备和表征Griffithsin修饰的聚乳酸-羟基乙酸电纺纤维的方法，该纤维对1型人类免疫缺陷病毒感染具有强效的黏附性和抗病毒活性 体外描述了用于合成、表面修饰以及表征经表面修饰纤维上Griffithsin的形态、偶联和解吸附的方法。
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方法文章
用于预防性传播感染的凝集素修饰纤维支架的制备与表征
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
静电纺丝纤维（EFs）已广泛应用于多种治疗领域，但将其用于预防和治疗性传播感染（STIs）的技术尚属新兴。此外，目前许多静电纺丝技术主要关注将活性成分包封于纤维内部，而非利用纤维表面赋予其生物功能特性。本文介绍一种制备并进行表面修饰聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）静电纺丝纤维的方法，使其表面负载强效抗病毒凝集素——Griffithsin（GRFT）。PLGA 是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的聚合物，因其优异的化学稳定性和生物相容性，已被广泛应用于药物递送系统。GRFT 是一种天然、高效且安全的凝集素，对包括1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）在内的多种病毒具有广谱抑制活性。研究表明，经 GRFT 修饰的纤维可有效灭活 HIV-1。 体外本文描述了制备和表征GRFT修饰电纺纤维（EFs）的方法。首先，采用静电纺丝技术制备聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）纤维支架。随后，利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学法对纤维表面进行GRFT修饰。采用扫描电子显微镜（SEM）评估表面修饰后纤维的尺寸与形貌。此外，可使用基于gp120或血凝素（HA）的酶联免疫吸附试验（ELISA）定量测定结合至纤维表面的GRFT含量及其从表面的解吸附情况。该方案可广泛应用于制备多种不同蛋白质表面修饰的纤维材料。 关键词：电纺纤维，PLGA，GRFT，表面修饰，EDC/NHS化学法，扫描电子显微镜，ELISA，gp120，血凝素，蛋白质固定化
引言
将电纺纤维（EFs）用作局部递送平台有望显著降低性传播感染（STIs）的发生率。目前，全球有超过3600万人感染人类免疫缺陷病毒（HIV），仅2015年就报告了超过200万例新发病例1,2。此外，单纯疱疹病毒2型（HSV-2）感染影响着全球数亿人，并已被证明可使HIV感染风险增加2至5倍3。鉴于HSV-2感染与HIV易感性之间的关联，人们迫切希望开发出能够同时预防多种性传播感染的新活性成分。此外，开发新型递送载体以改善这些抗病毒药物的递送效果，有望进一步提高其防护和治疗效力。为此，研究人员已探索将电纺纤维（EFs）作为一种新型递送平台，以降低HIV-1和HSV-2感染的流行率。
在过去的二十年中，电纺丝纤维（EFs）已被广泛应用于药物递送和组织工程领域4。通常选择生物相容性聚合物，以便更顺利地转化为治疗应用。制备聚合物电纺丝纤维时，根据聚合物疏水性的不同，将其溶解于有机溶剂或水溶液中5。在电纺丝过程开始前，将目标活性物质加入该溶剂或水溶液中。随后将聚合物溶液吸入注射器，并在施加电场的情况下缓慢喷出。该过程通常形成具有片状或圆柱状宏观结构的聚合物纤维（图1），其....
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方案
1. 静电纺丝纤维支架的制备与构建
警告：所有涉及溶剂或聚合物溶液的操作均应在化学通风橱中进行。 开始实验前，请参阅每种试剂的材料安全数据表。
- 为了电纺3 mL 15% w/w PLGA聚合物溶液，将720 mg的50:50聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA；0.55至0.75 dL/g，31-57 kDa）称量至一个10 mL闪烁瓶中。该溶液体积基于当前研究中常用的批次大小。
注意：加入给定体积溶剂中的聚合物质量必须首先通过确定用于溶解聚合物的溶剂密度来计算。溶剂六氟异丙醇（HFIP）的密度为1.59 g/mL。因此，基于所需3.0 mL HFIP的体积，溶剂的质量为4.8 g（3.0 mL × 1.59 g/mL）。对于PLGA与HFIP的15% w/w比例，需向3.0 mL HFIP中加入720 mg PLGA（0.15 × 4,800 mg = 720 mg）。使用% w/w聚合物/溶液而非% w/v的优势在于，这提供了最终溶液的明确定义质量。该明确定义的质量可在步骤1.3期间发生溶剂蒸发时，实现更准确的溶剂补充。 - 使用血清学玻璃移液管向含有PLGA的玻璃闪烁瓶（来自步骤1.1）中加入3.0 mL HFIP。用塑料薄膜覆盖瓶口，然后测量并记录瓶的质量。
- 将聚合物悬浮液在37 °C下孵育过夜，以确保聚合物完全溶解。如果任何溶剂蒸发导致瓶质量减少，则添加HFIP直至瓶恢复步骤1.....
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结果
纤维形态对表面修饰的电纺纤维（EFs）抵抗病毒的能力具有显著影响。尽管静电纺丝是一种简便直接的方法，但未经优化的聚合物配方可能导致纤维形态不规则（图5B-C）。静电纺丝条件的改变若导致串珠状或无定形膜状结构的形成，通常是由溶剂与聚合物不相容、聚合物黏度低、流速或其他静电纺丝参数不当所致。纤维结构的这些变化可能导致载药纤维的药物释放曲线不同，或影响偶联效率的一致性，从而改变纤维在物理或化学上阻碍病毒穿透的能力。采用所述静电纺丝条件制备的PLGA电纺纤维应具有清晰可辨的纤维形态，直径范围在1.5至2.8 µm之间（图6）。为确定纤维形态及直径，应在进行其他表征或修饰步骤之前，使用扫描电子显微镜（SEM）对电纺纤维进行观察。
空白、0.05、0.5 和 5 nmol GRFT 纤维的扫描电镜图像显示，纤维形.......
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讨论
由于具有多孔结构和较大的比表面积，电纺纤维（EFs）已在医疗健康领域获得多种应用，其中之一是作为治疗剂的递送载体。药物及其他活性物质可被包载于电纺纤维内部，实现可调控的释放；同时，生物分子和化学配体也可共价连接至纤维表面，以实现细胞特异性靶向52或生物传感53。本文描述了表面修饰凝集素GRFT的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）电纺纤维（GRFT-EFs）的制备方法，该纤维可作为预防HIV感染的递送支架。GRFT-EFs通过静电纺丝技术合成，相较于其他纤维制备方法，具有成本低、产量高的优势49,53。
实验方案中的关键步骤
电纺纤维（EFs）的形成在很大程度上依赖于聚合物溶液的性质，特别是溶液或溶剂的黏度54。影响聚合物溶液黏度的因素包括聚合物的分子量、聚合物浓度以及所用溶剂的种.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢卓越犹太遗产基金对本研究的资助。感谢斯图尔特·威廉姆斯二世博士 慷慨提供静电纺丝系统的使用。我们还要感谢肯尼斯·帕尔默博士为我们提供甘露糖结合蛋白Griffithsin。此外，我们感谢诺布尤基·松田博士及其实验室团队为我们提供了GRFT ELISA实验技术的培训。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）50:50 | Lactel | B6013-2P | |
| 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP） | Thermo Scientific | 147541000 | |
| 钝头分液针 18g × 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
| BD 3 mL 注射器 鲁尔锁头 | VWR | 309657 | |
| Parafilm（塑料膜） | Sigma Aldrich | P7793 | |
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES缓冲液） | Sigma Aldrich | M3671 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S7653 | |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P9333 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma Aldrich | S7907 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | P0662 | |
| 羟基琥珀酰亚胺（NHS） | Thermo Scientific | 24500 | |
| 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC） | Thermo Scientific | 22980 | |
| 2-巯基乙醇 | Fisher | BP176 | |
| 裂殖藻素（GRFT） | Kentucky Bioprocessing | NA | 定制生产，无产品编号 |
| 二甲基亚砜 | Milipore | 317275 | |
| 聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯（吐温20） | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tris EDTA缓冲液 | Sigma Aldrich | 93283 | |
| 平底免疫非无菌96孔板 | Thermo Scientific | 3355 | |
| 流感病毒血凝素（HA） | Kentucky Bioprocessing | NA | 定制生产，无产品编号 |
| 山羊抗GRFT一抗 | Kentucky Bioprocessing | NA | 定制生产，无产品编号 |
| 兔抗山羊IgG-HRP二抗 | Santa Cruz | 2056 | |
| Sure Blue TMB微孔过氧化物酶底物 | KPL | 52-00-00 |
参考文献
- Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
- Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
- Freeman, E. E., et al.
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重印与许可
