突触电流的局灶性大斑块记录 黑腹果蝇 幼虫神经肌肉接头

摘要

可以从视觉化的突触小结局部记录突触电流 果蝇 三龄幼虫神经肌肉接头。该技术可实现对单个突触小结活动的监测。

摘要

果蝇 神经肌肉接头（NMJ）是研究谷氨酸能突触传递的优良模型系统。本文描述了一种对可视化末梢小结进行局灶性大斑块记录突触电流的技术 黑腹果蝇 幼虫神经肌肉接头。该技术需要定制记录用微电极，并使用配备高倍率、长工作距离水浸物镜、微分干涉差（DIC）光学系统及荧光附件的复合显微镜。记录电极置于通过DIC光学、落射荧光或两者结合所观察到的特定突触膨大顶部。该技术的优势在于可监测有限数量释放位点的突触活动。记录电极具有 直径为几微米，且释放位点位于电极边缘之外 不会显著影响记录到的电流。所记录的突触电流具有快速的动力学特征，易于分辨。这些优势对于研究自发性或非同步突触活动增强的果蝇突变品系尤为重要。

引言

Drosophila 是研究控制突触传递分子机制的优良模型系统。Drosophila 的神经肌肉系统为谷氨酸能型，因此可利用 Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）来研究谷氨酸能释放的保守特性。自 Jan 和 Jan 的研究¹以来，三龄幼虫已被广泛用于通过记录兴奋性接头电位（EJPs）或电流（EJCs）来研究诱发性和自发性突触传递。EJPs 通常使用尖锐的玻璃微电极进行细胞内记录，反映的是整个 NMJ 的活动，包括在特定肌纤维上形成突触的所有突触小结。

相比之下，通过将微电极尖端放置在神经末梢或突触膨大附近，可对少量释放位点的活动进行局灶性记录。该技术最初由 Katz 和 Miledi²采用，局灶性细胞外记录已成功应用于多种神经肌肉接头（NMJ）制备，包括蛙^3,4,5、小鼠^6,7,8、甲壳类^{9,10,11,12,13,14,15,16}以及Drosophila^{17,18,19,20,21,22,23}。Dudel 进一步发展了该方法，优化了大电极记录电极^24,25。在 Dudel 的实现中，该技术与松散贴附式膜片钳方法²⁶非常接近。

的 果蝇 幼虫神经肌肉接头具有明确的突触小体，且带有遗传编码的神经元荧光标记的转基因品系（参见 材料表) 均可轻松获得。这些优势使我们能够从选定的突触小体记录EJCs和mEJCs^20,21,22在此，我们详细描述这一技术。

方案

1. 记录电极的制备

1. 拉制玻璃电极
   1. 使用以下程序设置微电极拉制仪（参见材料表）：
      1. 第1行：加热510 拉制—速度30 时间250；第2行：加热490 拉制—速度30 时间250。
         注意：时间单位对应每单位0.5 ms；其他单位为相对值。每次更换灯丝后，应通过斜率测试调整加热值。
   2. 使用显微镜（35倍放大）检查拉制后电极的内径，确保其在7 – 10 µm范围内（图1A）。将毛细管储存于密闭容器中，防止灰尘积聚。
2. 火焰抛光
   1. 使用微加工仪（参见材料表），以最大加热值的80 – 90%对毛细管进行火焰抛光（持续1 – 2秒）。确保抛光后电极的最终内径为5 µm（图1A）²⁷。
3. 弯曲电极
   注意：需制作两个弯折，以便在高倍物镜下将电极置于肌肉上方。
   1. 使用图1B所示装置。将电极固定于操纵器上，并将尖端置于灯丝上方，但不接触灯丝。
   2. 将加热值设为最大值的60 – 70%，踩下微加工仪踏板加热1 – 2秒（参见材料表），使灯丝发热。使用L形针轻轻下拉电极尖端（见图1B放大图），弯折角度约为90^o（图1C）。
   3. 用镊子夹住电极，手动将其置于喷灯火焰上，在距离第一个弯折7 – 10 mm处进行第二次弯折，弯折角度约为120^o（图1C）。

图1. 微移液管制备的最后步骤。（A）拉制并进行火焰抛光后的电极尖端。（B.1）尖端弯曲的实验装置。（B.2）右侧放大显示方框区域。电极和灯丝被固定，使电极尖端位于金属丝略上方，且不与之接触。（C.1）记录用电极。（C.2）右侧放大显示方框区域。第一个弯折处的角度约为90°，第一个弯折处与电极尖端之间的距离约为1 mm。比例尺 = 3 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 额外的准备工作

1. 配制类似血淋巴（HL3）溶液（单位：mM）：70 NaCl，5 KCl，20 MgCl₂，5 NaHCO₃，115 蔗糖，5 葡萄糖，5 HEPES₂，10 NaHCO₃₃，5 海藻糖，115 蔗糖，5 HEPES 和 1 mM CaCl₂；调节pH至7.3 - 7.4。将溶液保存在冰箱中，并每周新鲜配制。
2. 制作刺激电极的方法与记录用玻璃电极相同，但无需将其弯曲。
   注意：刺激电极的制备方法在文中已有详细描述 ²⁸ 和 ²⁷最终拉制电极经火焰抛光后的直径应为 5 - 7 µm。
3. 将刺激移液管插入连接至注射器的微电极持 holder 中。
4. 使用涂有硅橡胶环氧树脂的小型培养皿（35 × 10 mm）制备解剖板（参见 材料表如所述 ²⁸.
   注意：硅橡胶在使用前应完全固化。
5. 选取一只游走期三龄幼虫，按所述方法进行解剖^27,28,29,30.
   注意：为了观察轴突终末，使用果蝇品系 CD8-GFP（参见 材料表)
   1. 使用镊子（参见 材料表），挑选3个^rd 来自试剂瓶的龄期幼虫
   2. 用大头针固定幼虫，第一枚大头针置于后端，另一枚大头针置于前端（靠近口钩处）。
   3. 加入HL3溶液。
   4. 使用弹簧剪刀进行切割（参见 材料表从幼虫背部的顶端钩针一直到底端钩针。
   5. 将幼虫肌片固定，于幼虫左右两侧各加一枚大头针。
   6. 使用镊子去除内脏和气管。
   7. 使用弹簧剪在腹神经索外侧切断神经。

3. EJC的电生理记录

图 2. 记录装置。 固定在硅涂层培养皿（箭头）上的神经肌肉接头（NMJ）样品置于直立式复合显微镜的可移动载物台上，该显微镜配备落射荧光装置、高倍物镜和两个显微操作器。显微镜放置在防震台上。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 记录
   1. 将含有制备样本的培养皿放置在显微镜载物台上（图2）。将参考电极插入浴液中。
   2. 用HL3溶液填充记录电极。在10倍物镜下（见材料表），将电极浸入浴液，并使用显微操作器（见材料表）将其置于第2、3或4腹节的肌肉6和7上方（图3 A.1 和 A.2）。
   3. 切换至60倍物镜（见材料表）。使用落射荧光或微分干涉（DIC）光学系统对目标区域进行聚焦。将电极尖端置于突触小结上方（图3 B.1-3）。
   4. 将电极极其轻柔地压向肌肉表面。过度施压可能损伤神经肌肉接头（NMJ）或引起自发性突触活动增加。确保电极尖端未被堵塞——若已堵塞，应予以更换。
   5. 打开放大器、A/D转换板和计算机。
   6. 在放大器上选择电压钳模式。
   7. 启动数据采集软件，并选择“无间隙”（gap-free）记录模式。
   8. 在计算机屏幕上观察微型终板电流（mEJCs）的出现。
   9. 确保mEJCs的幅度在0.2 - 0.7 nA范围内。
      注意：较小的终板电流提示记录电极存在缺陷或位置不当。

图3. 突触小体的可视化。（A）在10倍放大倍数下观察半节段的明场图像（A.1），以及框选区域的放大图像，显示肌肉6和7（A.2，箭头标记记录电极）。比例尺 = 50 µm。（B）利用表皮荧光成像（B.1）或微分干涉差（DIC）光学技术，在携带遗传编码神经元标记物（CD8-GFP）的Drosophila品系中可视化突触小体（B.2）。图像使用60倍物镜和GFP成像滤光立方体拍摄（见材料表）。突触小体以箭头标示，B.3展示了荧光图像与DIC图像的叠加结果。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 刺激
   1. 使用显微操作器，在视觉控制下将刺激电极放置在支配腹部第2至第4节段的轴突附近。
   2. 通过拉动连接至电极夹持器的注射器活塞施加负压，使轴突被吸入电极内部（图2）。
   3. 打开刺激器。调节隔离单元上的旋钮（见材料表），将电流设为零，然后缓慢增加电流，直至出现EJCs（或达到阈值）。
   4. 以高于阈值的模式进行刺激，刺激电流约为观察到EJCs所需阈值电流的两倍。
      注意：根据我们的经验，该刺激强度最适宜避免动作电位失败或异常放电。例如，若EJCs在0.2 mA的刺激电流下出现，则在整个实验过程中使用0.4 mA的电流。
3. 封接电阻
   1. 将放大器的电极电阻开关转至“封接测试”位置，测量记录用大斑电极的封接电阻。观察“电流”窗口中显示的以GΩ为单位的封接电阻值。
   2. 确保封接电阻在0.5 - 2 MΩ范围内。超出此范围的数值表明电极未正确抛光或位置不当。
   3. 在整个记录过程中持续监测封接电阻，确保其在实验期间保持恒定。

4. 分析

1. 使用定制软件进行记录分析（参见材料表）。
   注意：本实验室使用自主研发的Quantan³¹软件，该软件专为检测局部记录的EJC和mEJC而设计（图4）。该软件包含高斯数字滤波器，可识别重叠的多量子事件中的量子峰（图4A）。其他方法见文献¹⁷。

图 4. 量子分析。 使用 Quantan 软件检测 mEJC（A）和 EJC（B）。事件区域以绿色标记，峰值由红色箭头标出。请点击此处查看此图的放大版本。

结果

焦点大电极记录技术可实现对选定突触小结突触活动的监测（图5）。当电极置于突触小结顶部时（图5A，位点1），所记录到的微小兴奋性突触电流（mEJCs）（图5C，位点1）其幅度显著高于噪声水平，并具有陡峭的上升相（在亚毫秒范围内）。当记录电极从突触小结移开数微米后（图5A，位点2），所记录mEJCs的幅度几乎降至噪声水平（图5B，位点2）。此时记录到的兴奋性突触电流（EJCs）难以与噪声区分，且其上升相明显延长（图5C，位点2与位点1对比）。

记录到的EJCs和mEJCs所涉及的释放位点数量有限，以及局...

讨论

Drosophila 是研究突触传递的一种理想模式生物。在幼虫神经肌肉接头（NMJ）上已采用多种记录方式，包括突触电位的细胞内记录、双电极电压钳记录突触电流^33,34，以及本文所述的突触电流的局灶性大斑记录。后一种技术可对可视化神经末梢处的突触传递进行精确定量分析。

所述方案的成功关键在于能否清晰地观察目标区域，以及能否定制记录电极的制备。因此，高质量的微分干涉差（DIC）光学系统、高倍率长工作距离的水浸物镜，以及用于电极火焰抛光和弯曲的定制设备都至关重要。

这种方法的优点在于能够监测位于记录电极下方的少数突触的活动。然而需要注意的是，位于电极边缘附近的突触小体也可能对记录到的活动有所贡献。因此，在实验过程中，电极的位置以及封接电阻必须保持稳定。

监测单个突触小结活动的能力可与近期的成像技术相结合。例如，可在单个活性区进行光学检测活动

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sutter P-97	Sutter instrument	P-97	微电极拉制仪
Narishige MF-830	Narishige	MF-830	显微操作器
WPI MF200	WPI	MF200	显微操作器
玻璃毛细管	WPI	B150-86-10	玻璃毛细管
Microtorch 1WG61	Grainer	1WG61	微型火炬
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒	Dow Corning	SYLGARD 184	用于制备解剖板的硅胶材料
解剖针	Amazon	B00J5PMPJA	用于固定幼虫的针具
镊子	WPIINC	500342	用于放置解剖针、移除幼虫内脏和气管
剪刀	WPIINC	501778	用于剪开幼虫表皮和神经
Olympus BX61WI	Olympus	BX61WI	直立显微镜
Olympus Lumplan FL N 60x	Olympus	UPLFLN 60X	60倍显微镜物镜
Olympus UPlan FL N 10x	Olympus	Uplanfl N 10X	10倍显微镜物镜
Narishige 显微操作器	Narishige	MHW-3	三轴水力显微操作器
npi Electronic GmbH ELC-03XS	npi Electronic GmbH	ELC-03XS	电生理放大器
A.M.P.I Master 8	A.M.P.I.	Master 8	电刺激器
A.M.P.I Iso-Flex	A.M.P.I.	Iso-Flex	刺激隔离器
TMC 抗振台	TMC	63-9090	抗振台
TMC 法拉第笼	TMC	81-333-90	法拉第笼
Digidata 1322A	Axon Instruments	Digidata 1322A	Digidata 数据采集系统
计算机	Dell	Dell Dimension 5150	安装 Windows XP 操作系统的计算机
电极夹持器	WPI	MEH3SW	电极夹持器
光学滤光片	Omega optical	XF 115-2	用于绿色荧光蛋白（GFP）检测的滤光立方体
pCLAMP 8	Axon Instruments	8.0.0.81	信号记录软件
Quantan	实验室内部软件	-	信号处理软件
Canton-S（野生型）	Bloomington 菌种中心	64349	对照果蝇品系
cpx SH1	J.T. Littleton 惠赠	-	突触融合蛋白敲除果蝇品系，具有增强的自发胞吐作用
CD8-GFP	Bloomington 菌种中心	5137	神经元表达荧光标记（GFP）的果蝇品系