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一种用于分析成年果蝇攀爬行为的自动化快速迭代负向趋地性实验方法 果蝇 神经退行性疾病模型

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DOI：

10.3791/56507

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2017年9月12日

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1Research Center for Translational Medicine, Tongji University School of Medicine, 2Key Laboratory of Arrhythmias of the Ministry of Education of China, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Neurobiology, Tongji University School of Medicine, 4Shanghai Advanced Research Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, 5Sino-Danish College, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本逐步实验方案利用一种可容纳数百只果蝇并由电动机同步其行为的自动化多圆筒系统，分析黑腹果蝇（Drosophila）的负向趋地性行为。在实现同步后，对果蝇的负向趋地性行为进行检测，并使用自主设计的RflyDetection软件进行数字记录与分析。

摘要

神经退行性疾病常伴随运动能力进行性丧失、寿命缩短以及年龄依赖性的神经退行性变。为了理解这些细胞事件的机制及其相互之间的因果关系， 黑腹果蝇，凭借其复杂的遗传工具和多样的行为特征，被用作评估神经退行性表型的疾病模型。本文描述了一种高通量分析方法 果蝇 成年果蝇的负向趋地性行为，可作为神经退行性疾病相关运动缺陷的指标。本研究设计并开发了一种自动化设备，通过初始电脉冲实现果蝇同步化，随后可在数秒至数分钟内记录其负向趋地性行为。利用自行设计的RflyDetection软件对数字视频记录的图像进行处理，以进行统计数据分析。与基于单只果蝇的手动控制负向趋地性检测方法不同，该精确、快速且高通量的实验方案可同时采集数百只以上果蝇的数据，为深入理解神经退行性疾病相关运动功能障碍的潜在机制提供了高效的研究手段。

引言

已开发出多种方案和方法用于分析Drosophila成虫的攀爬行为。传统的分析方法较为繁琐，通常需要将单只果蝇放入单独的试剂管中，并通过手动敲击使果蝇向下移动以实现同步化1,2,3,4。该方法费时费力，不适合大规模高通量研究，且手动敲击力度存在差异，带来潜在的实验变异及其他局限性。为改进该检测方法，研究人员开发了快速迭代负向趋地性（RING）检测法，可同时对大量果蝇进行高通量分析5。然而，该方法仍需依赖人工施加外力以实现果蝇行为的同步。我们改进的RING检测法在原有基础上进行了优化，采用一个金属底座承载多个盛有果蝇的试剂管，并由电动机自动控制以实现果蝇行为的同步化6。同步后立即记录果蝇的攀爬行为，并利用自主设计的软件进行分析。我们的自动化RING检测法消除了传统方法中逐只手动采集单个果蝇数据的繁琐过程，显著提高了数据获取的效率。此外，该自动化RING检测法已被应用于多项研究中，用于阐明阿尔茨海默病和帕金森病的潜在机制，验证了该方法的高效性与可靠性7,8,9。

本文中，我们演示了使用由DDC-Gal4驱动的RNAi果蝇进行自动化RING实验的方法。DDC-Gal4是一种特异性在多巴胺能（DA）和5-羟色胺能神经元中表达的Gal4品系，因此是分析与神经退行性变伴随的运动功能障碍相关靶基因效应的理想工具10。此外，我们引入了UAS-Dicer2果蝇品系，该品系可增强RNAi效率，从而构建出UAS-Dicer2; DDC-Gal4工具品系。我们选用的RNAi果蝇为auxilin（aux）RNAi v16182（auxR16182），该基因是我们先前发现会影响果蝇运动活性的基因8。同时，我们也准备了auxGFP果蝇，用于分析aux基因过表达所产生的效应。我们将展示如何利用自动化RING实验检测果蝇的负向趋地性，呈现实验结果，并讨论从结果中获得的相关意义。

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方案

1. 果蝇采集

  1. 将果蝇饲养在标准果蝇培养基中，条件为 25 °C、70% 湿度及 12 h/12 h 光照/黑暗循环。
  2. 在二氧化碳（CO2）麻醉下收集 UAS-Dicer2; DDC-GAL4 果蝇处女蝇。
  3. 将这些处女蝇与携带以下基因型的 2 日龄成年雄蝇杂交：UAS-mCD8GFP（对照）、auxR16182（aux RNAi）、auxGFP （aux 过表达）以及 auxR16182; auxGFP （挽救实验），雌雄比例为 2:1。
  4. 每组实验分别收集新羽化的雄性和雌性果蝇，每组置于 3 个培养瓶中 ，每个标准果蝇培养瓶中放入 10 只果蝇，并在 25 °C 下培养。
  5. 根据实验需要，将收集的果蝇维持最长至 35 天，并在第 5、15、25 和 35 天进行自动化的 RING 分析。

2. 自动化 RING 检测

  1. 将每种基因型的10只收集好的果蝇（不分性别）分别转移至每个小瓶中，然后拧紧瓶盖。每次实验同时分析对照果蝇和携带不同基因型的果蝇（最多可同时进行10个小瓶，每瓶10只果蝇）。
  2. 打开位于装置前方的数码相机，并在所有果蝇装载完毕并准备就绪后开始录像。
  3. 让果蝇在小瓶中适应1分钟后，启动步进控制器以控制步进驱动器；该驱动器将驱动小型电动机，控制连接的杠杆连续上升并在2秒内轻敲装置4次。见图1。
    1. 轻敲后，注意果蝇开始沿瓶壁向上爬行。确保录像持续进行。
  4. 按照步骤2.3所述方法，在60秒间隔下重复同步操作，连续进行3至5次试验。
  5. 对5、15、25和35日龄的果蝇重复该实验。每组至少进行3次独立实验，每次实验至少使用30只收集的果蝇（3个小瓶）。

3. 数据分析

  1. 将录制的视频导入计算机。
  2. 对每次试验，在轻敲后 6 秒处截取视频图像。
  3. 使用“文件”菜单，将截图导入 RflyDetection 软件（见图 2）。
  4. 使用工具栏上的基线图标，然后用光标在图像上标记小瓶的上、下基线，精确设定上、下基线位置。
  5. 在设置栏的“Flys in rect”字段中输入每瓶果蝇数量（例如，此处为 10），在“Tube Height”字段中输入小瓶长度（例如，此处为 14 cm）。
    1. 注意，软件会检测每瓶中每只果蝇的位置，并在屏幕上以点标记。
      注意：图 2 标示了所有菜单按钮点击位置。
  6. 注意，软件会自动计算每只果蝇的攀爬距离，并在右侧面板的表格中显示每瓶 10 只果蝇的平均值。（见图 2）
  7. 使用统计软件（例如，Prism）对攀爬数值进行进一步统计分析。
  8. 以均值 ± 标准误（SEM）形式呈现数据。
  9. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Bonferroni 多重比较检验，计算显著性 p 值（以星号表示，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。

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结果

本文展示了利用自动化 RING 实验评估果蝇负向趋地性行为的方法。与之前的 RING 实验不同，我们的实验采用了一种自动化装置，该装置可提供电刺激以同步果蝇动作，并能同时分析数百只果蝇（图1）。对 Dicer2; DDC>auxR16182 果蝇的分析显示，在6秒时间内，雄性和雌性果蝇的攀爬距离均随年龄增长而下降，表明在多巴胺能神经元中表达的 aux 基因对果蝇运动能力至关重要。在多巴胺能神经元中过表达 auxGFP 似乎并未影响果蝇的攀爬能力，而在多巴胺能神经元中共同表达 auxR16182 和 auxGFP 可挽救RNAi表型（图2 和 图3）。除了验证自动化 RING 实验是一种高效、高通量评估与多巴胺能神经元退化相关运动缺陷的方法外，这些结果还表明，...

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讨论

本文所述的自动化 RING 实验可同时对数百只果蝇的负向趋地性行为进行高通量分析。以往分析成年果蝇攀爬行为的方法通常涉及在单个试管中观察单只果蝇，并通过肉眼手动判断果蝇的位置。这种较为繁琐的过程有时可能导致数据误读或误判，且需要大量人力。我们的自动化 RING 实验仅需简单点击即可启动，仪器可自动同步并评估多达 100 只果蝇的攀爬能力。通过电子化同步，能够更精确地控制时间及其他参数，从而对成年果蝇攀爬过程的记录实现精准测量。

接下来，利用我们自行设计的 RflyDetection 软件，可以准确识别果蝇的位置。该软件会综合考虑整个二维小瓶区域（由矩形框确定）以及顶部和底部的基线，随后获取指定区域内所有果蝇的位置，并以点的形式呈现。此外，软件可自动计算攀爬距离及其平均值，从而实现更快、更便捷的数据处理。在合理的时间范围内，即可对大量果蝇的数据集进行可靠地采集与分析7,8,9。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Stock Center）和维也纳果蝇RNAi中心（Vienna Drosophila RNAi Center）提供果蝇品系。RING装置的专利归属于中国科学院上海高等研究院。有关RflyDetection软件的申请，请联系黄辅德（Fu-de Huang）（见作者列表）。本研究得到中国国家重点基础研究发展计划（973计划，项目编号2013CB945602）和国家自然科学基金（项目编号31270825和31171043）的资助。感谢Ho实验室成员提供的讨论与意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Forma 环境培养箱Thermo3949
二氧化碳气瓶FuLian GAS TechnologyGB/T6052
HDR-摄像机SONYHDR-CX220E
双目体视显微镜Xin ZhenSMZ-168BL
电子天平MinQiaoSL1002N
冰箱HaierSC-350
琼脂粉Sinopharm10000561
葡萄糖Sinopharm10010518
玉米粉Sinopharm5464654
红糖LiuCaiYuan45467936
速溶干酵母AB MAURI20886
AuxR16182VDRC7187
UAS-Dicer2Bloomington24650
UAS-mCD8GFPBloomington32185
DDC-Gal4由 Fude Huang 惠赠
AuxGFP由 Henry Chang 惠赠

参考文献

  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741(2015).
  4. Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
  7. Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
  8. Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

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RING RflyDetection

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