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方法文章

从血液中稀有的抗原特异性B细胞高效制备具有区分能力的人源单克隆抗体

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DOI：

10.3791/56508

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2018年2月6日

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

本文内容

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摘要

我们介绍一种从人体血液中循环的稀有B细胞出发，制备针对特定抗原的人源抗体的方法。该方法能够高效、快速地产生天然抗体，所获得的抗体可区分高度相似的抗原。

摘要

单克隆抗体（mAbs）是基础研究和生物医学领域中非常有用的强大工具。当抗体需要区分高度相似的结构时，其高特异性显得必不可少（例如一种正常蛋白及其突变体。目前生成此类具有区分能力的单克隆抗体（mAbs）的方法需要对多个产生抗体的B细胞进行广泛筛选，这一过程既昂贵又耗时。本文提出一种快速且经济高效的方法，可从人外周血循环B淋巴细胞出发，生成具有高度区分能力的全人源单克隆抗体。该策略的创新之处在于利用 readily available 外周血单个核细胞（PBMC），通过特异性抗原结合B细胞的正向筛选与所有其他细胞的反向剔除相结合的方式进行细胞选择。一旦分离出特异性B细胞，即可采用单细胞逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术获取编码相应单克隆抗体的cDNA（互补脱氧核糖核酸）序列，并随后在人源细胞中表达。在短至1个月内，即可生产出针对B细胞受体库自然识别的几乎所有目标抗原的毫克级高特异性人源单克隆抗体。

引言

本文所述方法可快速、灵活地生产针对特定抗原（Ag）的全人源单克隆抗体（mAbs）。单克隆抗体在许多基础研究应用中是必不可少的工具，例如体外（in vitro）和体内（in vivo）实验中的流式细胞术、组织学、蛋白质印迹（western-blotting）以及阻断实验。此外，单克隆抗体在医学领域的应用日益广泛，可用于治疗自身免疫性疾病、癌症以及控制移植排斥反应1。例如，抗CTLA-4和抗PD-1（或抗PD-L1）单克隆抗体最近已被用作癌症治疗中的免疫检查点抑制剂2。

最初的单克隆抗体（mAbs）是通过融合免疫小鼠或大鼠脾细胞获得的免疫球蛋白（Ig）分泌型杂交瘤产生的。然而，由于人体会对鼠源或大鼠源mAbs产生强烈的免疫反应，导致其迅速被清除并可能引发超敏反应，从而限制了它们在人类治疗中的应用3。为解决这一问题，已将mAbs中的动物蛋白序列部分替换为人源序列，从而产生所谓的嵌合鼠-人抗体或人源化抗体。然而，该策略仅能部分降低免疫原性，同时显著增加了生产成本和时间。更优的解决方案是从人B细胞直接产生人源mAbs，目前已有多种实现该目标的策略。其中一种是噬菌体或酵母展示技术，该技术将来自随机人源Ig重链和轻链组合文库的可变区结构域展示在噬菌体或酵母表面，并利用特定抗原进行筛选。该策略的主要缺点在于重链与轻链为随机配对，导致所产生抗体的多样性大幅增加。所获得的抗体不太可能等同于针对特定抗原（Ag）的自然免疫应答所产生的抗体。此外，原核生物甚至酵母系统无法系统性地重现人源蛋白的正确折叠和翻译后修饰。第二种人源mAb生产方法是通过EB病毒（Epstein-Barr virus）感染或表达抗凋亡因子BCL-6和BCL-XL，使天然人B细胞永生化4。然而，该方法仅适用于记忆B细胞，且效率较低，需要对大量能产生mAb的永生化B细胞进行筛选，才能鉴定出极少数（甚至可能没有）具有所需抗原特异性的mAb克隆。因此，该方法既昂贵又耗时。

最近描述了一种从分离的单个B细胞生产人源单克隆抗体（mAb）的新方案5。该方案依赖于优化的单细胞逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），用于扩增单个分选B细胞中的重链和轻链编码片段。随后将这些片段克隆并表达于真核表达系统中，从而实现完全人源mAb的重建。该方案已成功应用于来自疫苗接种供体的B细胞。在接种疫苗数周后采集细胞，以获得更高频率的针对目标抗原（Ag）的B细胞，从而缩短筛选所需时间6。此外，也已从HIV+（人类免疫缺陷病毒）感染患者7和黑色素瘤患者8中成功制备出其他完全人源mAb。尽管取得了这些进展，目前仍缺乏一种能够不依赖于B细胞记忆表型或频率而实现抗原特异性B细胞分离的通用方法。

此处所述方法可高效 体外 基于B细胞受体（BCR）特异性分离人外周循环B细胞，继而高效、快速筛选获得高产量的完全人源抗原特异性单克隆抗体。该方法不仅适用于记忆B细胞或免疫应答后诱导产生的抗体分泌型B细胞，还可应用于人初始B细胞库。即使起始材料中抗原特异性B细胞频率极低，该方法仍可成功操作，充分表明其高效性。该方法的基本原理如下：使用两种携带有目标抗原的四聚体对外周血单个核细胞（PBMC）进行染色，每种四聚体分别标记不同的荧光染料（例如，藻红蛋白（PE）和别藻蓝蛋白（APC）），以及第三个与第三种荧光染料偶联的四聚体，该四聚体呈递一种密切相关抗原（例如，Brillant Violet 421（BV421）。为富集抗原结合细胞，将细胞与包被有抗-PE和抗-APC抗体的磁珠孵育，随后通过细胞分离柱进行分选。PE+ APC+ 细胞组分经选择后，使用多种针对不同PBMC细胞类型的特异性单克隆抗体（mAb）进行染色，以实现B细胞的鉴定，并进行流式细胞术分选。选择PE标记的B细胞+ 以及 APC+，但 Brilliant Violet-，被分离出来。此步骤可排除非B细胞或不与四聚体抗原结合但能与PE或APC结合的细胞（这些细胞将呈PE阳性）+ APC- 或 PE- APC+）或四聚体的非抗原部分（这些细胞将为 BV421）+。在此步骤中，对目标表位特异性不高的B细胞也会被反向筛选去除（这些细胞同样会带有BV421标记）+因此，该方法能够纯化出表达B细胞受体（BCRs）的高特异性B细胞，这些受体能够区分两种高度相似的抗原。单个特异性B细胞被收集于试管中，其经PCR扩增的Ig cDNA（互补脱氧核糖核酸）被克隆并由人源细胞系表达为分泌型IgG单克隆抗体。

为验证该方法的可行性，本研究描述了一种高效生成人源单克隆抗体（mAbs）的策略，这些抗体能够识别由主要组织相容性复合体I类分子（MHC-I）呈递的肽段，并可区分同一MHC-I等位基因上加载的该肽段与其他肽段。尽管该抗原（Ag）的复杂程度较高，但本方法仍可实现：（i）高效回收抗原特异性的单克隆抗体；（ii）产生能够区分两种结构相近抗原的单克隆抗体。该方法可直接应用于疫苗接种者或感染者，无需对实验流程进行任何修改，并且已在人源化大鼠系统中成功实施9。因此，本研究描述了一种通用且高效的策略，可用于生成完全人源的单克隆抗体，适用于基础研究和免疫治疗。

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方案

所有人类外周血样本均在知情同意后从匿名成年捐赠者处获取，符合当地伦理委员会的规定（法国血液机构，EFS，南特，程序编号 PLER NTS-2016-08）。

1. 人外周血单个核细胞的分离

注意：起始材料可以是全人类外周血或细胞分离样本。样本存放时间不应超过8小时，并需添加抗凝剂（例如，肝素）。

  1. 用2体积（人外周血）或5体积（细胞单采术样本）的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基稀释血液。
  2. 将35 mL稀释后的细胞悬液小心地铺加到50 mL离心管中15 mL密度梯度介质上方。根据稀释血液的总体积，准备相应数量的离心管。在水平转子中，以1,290 × g离心25分钟，室温操作，关闭刹车。
  3. 小心吸取位于密度梯度介质与血浆层之间的单个核细胞层，并将细胞转移至新的50 mL离心管中。
  4. 用RPMI培养基充满离心管，混匀后以1,290 × g离心10分钟，室温操作。小心弃去上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于20 mL RPMI培养基中，以200 × g离心10分钟以去除血小板。小心弃去上清液。重复此步骤一次。
  6. 将细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。
    注意：可直接进行四聚体标记，或在4 °C下以107 个细胞/mL的浓度保存过夜。

2. 抗原特异性B细胞的四聚体相关磁珠富集

  1. 通过将PE或APC标记的优质链霉亲和素或BV421标记的链霉亲和素以1:4的摩尔比加入生物素化抗原单体中，制备抗原四聚体。在室温下每隔10分钟分三批加入适量的链霉亲和素偶联物，每次加入一份。
  2. 将细胞（每管最多3 × 108）分装至15 mL圆锥形离心管中，在460 × g下离心5分钟。
    注意：以下方案适用于一管样本。
  3. 用含2% FBS的200 µL PBS（磷酸盐缓冲液）重悬细胞沉淀。分别加入PE、APC和BV421偶联的四聚体，使每种四聚体终浓度为10 µg/mL。充分混匀后在室温下孵育30分钟。
  4. 使用含0.5% BSA（牛血清白蛋白）和2 mM EDTA（乙二胺四乙酸）的PBS制备冰上预冷的细胞分离缓冲液（SB）。
  5. 加入10 mL SB，在460 × g下离心5分钟以沉淀细胞。
  6. 用500 µL冰上预冷的SB重悬细胞，加入50 µL抗PE和50 µL抗APC磁性微珠。
  7. 充分混匀后在4 °C下孵育20分钟。
  8. 重复步骤2.5两次。
  9. 小心弃去上清液，并将细胞沉淀用冰上预冷的SB重悬至浓度为2 × 108 个细胞/mL。
  10. 用3 mL SB平衡置于磁铁上的大型磁性层析柱。
  11. 将步骤2.9中的细胞悬液转移至平衡好的层析柱顶部，使其完全流尽。关键步骤：为避免柱体堵塞，需使细胞通过70 µm尼龙滤网过滤。
  12. 用3 mL冰上预冷的SB冲洗原细胞管，并将冲洗液直接转移至层析柱上（若发生过滤，则同时冲洗70 µm尼龙滤网）。
  13. 当缓冲液完全流入层析柱后，向柱中再加入3 mL冰上预冷的SB。
  14. 重复步骤2.13进行另一次3 mL洗涤。
  15. 将层析柱从磁铁上取下，置于一个15 mL圆锥形收集管上方。
  16. 向层析柱顶部加入5 mL冰上预冷的SB，并立即用推杆将细胞从柱中彻底洗脱。重复此步骤一次。
  17. 将收集的细胞（富集的相关四聚体阳性细胞组分）在460 × g下离心5分钟，随后进行额外的抗体染色。
    注意：如适用，可合并所有管中收集的细胞。

3. 抗原特异性人B细胞的染色与细胞分选

  1. 用含有抗人CD3（终稀释度：1:20）、CD19（1:20）、CD14（1:50）、CD16（1:50）和7AAD（1:1000）抗体的混合物重悬细胞沉淀，总体积为100 µL含2% FBS的PBS，4 °C孵育30分钟。
  2. 向细胞中加入10 mL PBS，以460 × g离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。将细胞沉淀重悬于200 µL PBS中，过滤至70 µm尼龙滤网。
  3. 使用带有100 µm喷嘴、压力为20 psi的流式细胞分选仪，在单细胞水平分选特异性B细胞，分选速度不得超过1,000 events/s9。
    注意：所用的设门策略见图1。首先根据CD14-CD16-7AAD-设门排除单核细胞、NK细胞及死细胞（在图1中未显示）。随后选择CD19+ B细胞，并进一步根据PE和APC标记的特异性抗原四聚体双染色细胞进行设门。通过设门选择BV421阴性细胞（非特异性抗原四聚体未染色）以排除非特异性B细胞。
  4. 将单个B细胞分选至预先装有10 µL 1x PBS和10单位RNase抑制剂的8联排PCR管中，并置于96孔PCR管架上。立即在-80 °C冷冻保存PCR管。
    注意：流式细胞仪上选择的分选模式为：得率模式（yield mask）：0，纯度模式（purity mask）：32，相位模式（phase mask）：0。如有需要，单细胞分选可调整至96孔或384孔PCR板。单个B细胞必须尽快冷冻，如需要，可在-80 °C保存数周。

4. 单细胞逆转录-聚合酶链式反应

  1. 将冷冻样本直接置于PCR条管中，在干浴仪中70 °C加热5分钟，以裂解细胞。
  2. 将条管转移至冰上，每管加入10 µL含有1 mM dNTP、25 µg/mL oligo(dT)引物、5 µM随机六聚体、20单位RNA酶抑制剂和400单位逆转录酶的2× 预混缓冲液，进行逆转录（RT）。
    注意：细胞解冻后必须尽快进行逆转录，以避免RNA降解。
  3. 在25 °C孵育5分钟，使随机六聚体杂交，随后在50 °C孵育1小时，最后在95 °C孵育3分钟以终止反应。
  4. 对编码重链可变区（vH）以及κ（vLκ）或λ轻链（vLλ）的每个区域进行两轮巢式PCR扩增。
    注意：或者，逆转录产物可在-20 °C冷冻保存，最多可保存一周。
    1. 第一轮PCR中，每40 µL反应体系加入3 µL cDNA，反应体系包含1.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、2.5单位DNA聚合酶和200 nM外侧引物（引物序列见图2和材料表）。
      注意：外侧引物混合物组成。重链扩增：4种正向引物（5'LVH混合物）和2种反向引物（3'CµCγ混合物）。κ轻链扩增：3种正向引物（5'LV|混合物）和1种反向引物（3'Cκ543-566）。λ轻链扩增：7种正向引物（5'LVl混合物）和1种反向引物（3'Cl）。
      注意：引物由Tiller 等设计，用于扩增所有重链和轻链家族基因5。
    2. 采用以下循环条件：94 °C预变性4分钟，随后进行40个循环（每个循环包括94 °C 30秒、VH和VLκ为58 °C 30秒（VLλ为60 °C）、72 °C 55秒），最后在72 °C延伸7分钟。
    3. 第二轮PCR中，取第一轮扩增产物3 µL作为模板，终体积为40 µL，反应体系包含1.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、2.5单位DNA聚合酶和200 nM内侧引物（内侧引物包含用于克隆至表达载体的限制性酶切位点，引物序列见图2和材料表）。
      注意：内侧引物混合物组成。重链扩增：9种正向引物（5'AgeIVH混合物）和3种反向引物（3'SalIJH混合物）。κ轻链扩增：9种正向引物（5'AgeIV|混合物）和3种反向引物（3'BsiWIJκ混合物）。λ轻链扩增：6种正向引物（5'AgeIVl混合物）和1种反向引物（3'XhoICl）。
      注意：引物由Tiller 等设计，用于扩增所有重链和轻链家族基因5。
    4. 采用以下循环条件：94 °C预变性4分钟，随后进行40个循环（每个循环包括94 °C 30秒、VH和LCκ为58 °C 30秒（LCλ为60 °C）、72 °C 45秒），最后在72 °C延伸7分钟。
  5. 取5 μL vH、vLκ和vLλ的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，通过观察条带（重链可变区扩增产物约500 bp，轻链可变区扩增产物约350 bp）确定阳性孔。
  6. 使用专用于PCR产物纯化的超滤膜，对阳性孔中剩余的35 µL PCR产物进行纯化。
  7. 用60 µL H2O洗脱PCR产物。

5. 表达克隆

  1. 准备插入片段
    注意：将每种纯化的 PCR 产物各取 60 µL，在终体积为 100 µL 的适当限制性酶切缓冲液中进行酶切。
    1. 对于 vH PCR 产物，加入 50 单位 AgeI 和 50 单位 SalI，于 37 °C 孵育 1 小时。
    2. 对于 vLλ PCR 产物，加入 50 单位 AgeI 和 50 单位 XhoI，于 37 °C 孵育 1 小时。
    3. 对于 vLκ PCR 产物，加入 50 单位 AgeI，于 37 °C 孵育 1 小时。使用 96 孔 PCR 膜纯化酶切产物，并用 60 µL H2O 洗脱。将 60 µL 洗脱液在终体积为 100 µL 的 BsiWI 限制性酶切缓冲液中进行酶切，加入 50 单位 BsiWI，于 55 °C 孵育 1 小时。
    4. 通过 80 °C 加热 15 分钟使酶失活。
  2. 表达载体的制备
    注意：vH PCR 产物被克隆至一个表达载体（HCγ1）中，该载体包含 IgG1 的重链恒定区 Cγ1。vLκ PCR 产物被克隆至一个表达载体（LCκ）中，该载体包含轻链恒定区 Cκ。vLλ PCR 产物被克隆至一个表达载体（LCλ）中，该载体包含轻链恒定区 Cλ。
    1. 进行以下酶切反应：
      1. 将 1 µg 表达载体 HCγ1 与 10 单位 AgeI 和 10 单位 SalI 内切酶混合于制造商推荐的限制性缓冲液中，总体积为 20 µL，于 37 °C 孵育 1 小时。
      2. 将 1 µg 表达载体 LCκ 与 10 单位 AgeI 限制性内切酶混合于制造商推荐的限制性缓冲液中，总体积为 20 µL，于 37 °C 孵育 1 小时。加入 10 单位 BsiWI 限制性内切酶，于 55 °C 孵育 1 小时。
      3. 将 1 µg 表达载体 LCλ 与 10 单位 AgeI 和 10 单位 XhoI 内切酶混合于制造商推荐的限制性缓冲液中，总体积为 20 µL，于 37 °C 孵育 1 小时。
    2. 将每种酶切混合物于 65 °C 加热 10 分钟以使限制性内切酶失活。
    3. 在 20 µL 的 1x DNA 连接酶缓冲液中，加入 1 单位 T4 DNA 连接酶，将 5 µL 酶切后的 PCR 产物与 2 µL（100 ng）相应的线性化表达载体连接，于 4 °C 过夜孵育。
      注意：也可在 4 °C 连接 3 小时。
  3. 克隆
    1. 将 20 µL 连接反应混合物中的 1 µL 电转化至 45 µL 自制的感受态 TOP10 E. coli 中（参见《分子生物学实验指南》第 1.8.4–1.8.8 节）。立即加入 500 µL 2X YT 培养基，于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。将转化后的细菌涂布于 2x YT 氨苄青霉素平板上，于 37 °C 过夜培养。
    2. 对每次转化的八个菌落进行 PCR 筛选。
      1. 在冰上配制如下反应预混液：45 µL 5x PCR 缓冲液、12 µL MgCl2（25 mM）、4 µL dNTPs（母液含每种 10 mM）、10 µL 正向引物（母液 10 µM），该引物与载体序列互补（引物 Ab-vec-sense），以及 10 µL 反向引物（母液 10 µM），靶向重链或轻链恒定区（引物序列见材料表）。用 H2O 定容至 200 µL。然后加入 4 µL DNA 聚合酶（5 U/µL）。
      2. 将 25 µL 反应预混液分装至 8 孔 PCR 管条中，置于冰上。
      3. 使用无菌牙签挑取单个菌落。将牙签在 2x TY 氨苄青霉素平板上划线以制备复制平板，然后将牙签浸入 PCR 反应管中。
      4. 按以下循环条件进行筛选 PCR：94 °C 预变性 10 分钟，随后进行 25 个循环（94 °C 30 秒、55 °C 30 秒、72 °C 50 秒）。
      5. 取 5 µL PCR 产物在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，以鉴定阳性菌落。
        注意：阳性菌落的重链载体 PCR 产物大小约为 850 bp，轻链载体约为 600 bp 。
    3. 从复制平板中挑取四个阳性菌落，分别接种于 2 mL LB 培养基中，于 37 °C、200 rpm 摇床中过夜培养。
    4. 按照制造商说明，使用质粒提取试剂盒从液体培养物中提取质粒。
    5. 使用 Ab-vec-sense 引物对质粒进行 Sanger 测序，以验证可变区的正确插入。
      注意：含有正确插入片段（编码 HC 及其对应的 LC）的质粒将共转染至 293A 细胞中以实现抗体分泌。通过 ELISA 检测小规模表达的单克隆抗体的特异性。如适用，则进行大规模生产。

6. 单克隆抗体的制备

  1. 小规模制备用于特异性检测
    1. 转染前一天，将15,000个人类胚胎肾293A（HEK 293A）细胞接种于 200 µL 在96孔板中，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。在CO₂培养箱中孵育过夜。2 培养箱（5% CO₂）2) 在 37 °C.
    2. 使用线性聚乙烯亚胺衍生物作为转染试剂，在含有10% FBS的DMEM培养基中对293A细胞进行共转染。
      注意：转染需设三个重复。以下方案适用于平底96孔板的一个孔。
      1. 稀释 0.5 µL DNA转染试剂的加入 10 µL 150 mM NaCl。稀释 0.125 µg vH 和 0.125 µg 表达vL的载体转入 10 µL 150 mM NaCl。每种稀释液涡旋10秒。
      2. 添加 10 µL 稀释的DNA转染试剂加入到 10 µL DNA 溶液。涡旋 15 秒，室温孵育 15 分钟。加入 20 µL 逐滴加入293A细胞中，并轻轻摇晃培养板混匀。
    3. 转染后16小时更换培养基，并在无血清培养基中继续培养细胞5天。
      注意：使用无血清培养基，以避免血清免疫球蛋白污染所生产的抗体。
    4. 通过460 × g离心5分钟以去除细胞和碎片。
    5. 使用多通道移液器吸取上清液，并将其转移至V型底96孔板中。
    6. 将相关抗原（Ag）包被过夜 4 °C 在 100 µL 每孔加入1×重悬的ELISA/ELISPOT包被缓冲液 最终浓度为 2 µg/mL 在96孔ELISA板中。参见示例 9.
    7. 用含10% FBS的DMEM培养基在室温下封闭孔板2 h 37 °C
    8. 添加 50 µL 转染293A细胞上清液的步骤6.1.5，并在室温下孵育2小时。
    9. 添加 100 µL 与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗人IgG抗体 1 µg/mL 并在室温下孵育1小时。加入 50 µL 显色底物（TMB），20 分钟。
    10. 在分光光度计上读取450 nm处的光密度值。
      注意：通过ELISA检测确定的特异性单克隆抗体可进一步进行大规模生产，并利用对人IgG具有亲和力的蛋白A柱进行纯化。
  2. 特异性单克隆抗体的大规模生产与纯化
    1. 转染前一天，接种 6 x 106 人胚胎肾293A（HEK 293A）细胞接种于175 cm²培养瓶中2 含25 mL添加10% FBS的DMEM的培养瓶。在CO₂培养箱中过夜孵育2 培养箱（5% CO₂）2) 在 37 °C.
      注意：转染时细胞应达到70%融合度。
    2. 使用线性聚乙烯亚胺衍生物作为转染试剂，在含有10% FBS的DMEM培养基中对293A细胞进行共转染。
      1. 稀释 50 µL DNA转染试剂的加入 450 µL 150 mM NaCl。稀释 10 µg vH 和 10 µg 表达vL的载体的导入 500 µL 150 mM NaCl。每种稀释液涡旋10秒。
      2. 将稀释后的DNA转染试剂加入DNA溶液中，涡旋15秒，室温孵育15分钟。将1 mL混合液逐滴加入细胞中，并轻轻晃动培养瓶混匀。
    3. 转染后16小时更换培养基，并在无血清培养基中继续培养细胞5天。
    4. 用25 mL移液管吸取收集培养基。
    5. 以 460 × g 离心 5 分钟，去除细胞和碎片。
    6. 使用蛋白A包被的1 mL色谱柱，在快速蛋白液相色谱（FPLC）系统上纯化抗体 4 °C.
      1. 用 20 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7）平衡蛋白 A Sepharose 柱。
      2. 使用滤器过滤6.2.5中的细胞培养基 1.22 µm 过滤，然后 0.45 µm 过滤器
      3. 将过滤后的培养基上样至层析柱中。
      4. 用20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7）洗涤，并用0.1 M柠檬酸盐缓冲液（pH 3.5）洗脱。
      5. 在分光光度计上测定280 nm处的光密度，并立即用1 M Tris缓冲液（pH 9）中和含蛋白的组分。
    7. 将纯化的抗体在4℃下透析过夜 4 °C 使用截留分子量为3.5 K的透析盒，在PBS缓冲液（pH 7.4）中进行透析。
    8. 通过灭菌 0.2 µm 根据制造商说明，通过尺寸排阻色谱法进行过滤并控制纯度。

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结果

本项目从健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）出发，制备识别由主要组织相容性复合体I类分子HLA-A*0201（HLA-A2）呈递的人巨细胞病毒肽段Pp65495（Pp65）的人源单克隆抗体（mAbs）。这些单克隆抗体能够区分该复合物与同一MHC-I分子呈递的其他肽段所形成的复合物。

根据上述方案，使用 HLA-A2/Pp65-PE、HLA-A2/Pp65-APC 和 HLA-A2/MelA2-BV421 四聚体对 PBMC 进行染色。在对 PE 和 APC 四聚体阳性细胞进行免疫磁珠富集后，洗脱的细胞再用其他单克隆抗体进行染色。在流式细胞分选仪上，首先对磁珠富集后的细胞圈选活的 CD14-CD16-CD3-CD19+ 单细胞（B 细胞）。图 1 展示了用于分离表达能够区分 HLA-A...

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讨论

所提出的方案是一种直接从血液中循环的抗原特异性B细胞高效制备人源单克隆抗体（mAbs）的方法。该方法结合了三个关键环节：（i）采用四聚体偶联的磁珠富集技术，可实现对目标B细胞的高效富集； 体外 分离极为稀有的抗原结合B细胞；（ii）采用三种不同荧光染料标记的抗原四聚体（其中两种为相关抗原，一种为无关抗原）进行流式细胞术分选的设门策略，以特异性分离仅表达针对目标抗原的B细胞受体的B细胞；（iii）通过单细胞逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术重建相应的重组单克隆抗体cDNA，并在人类细胞中表达这些cDNA。

既往研究提出在分选人B细胞并从分离的B细胞后续生产单克隆抗体（mAbs）之前，使用一种或两种荧光标记的相关抗原对人B细胞进行标记6,7,8。一项针对类风湿关节炎患者的研究以及一项在自身免疫小鼠模型中的研究，曾使用无关的荧光抗原来表征自身反应性B细胞并确定其频率

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢细胞计量设施“CytoCell”（SFR Santé，Biogenouest，南特）提供的专业技术支持。同时感谢重组蛋白生产平台（P2R）和IMPACT平台（INSERM 1232，SFR Santé，Biogenouest，南特）全体工作人员的技术支持。感谢Emmanuel Scotet和Richard Breathnach对本稿件提出的建设性意见。本工作由法国政府“未来投资”计划资助的IHU-Cesti项目提供资金支持，该项目由法国国家科研署（ANR）管理（ANR-10-IBHU-005）。IHU-Cesti项目还获得了南特都会区和卢瓦尔河地区大区的支持。本工作是在国家科研署通过“未来投资”计划资助的LabEX IGO项目（ANR-11-LABX-0016-01）框架下完成的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEK 293A细胞系Thermo Fisher ScientificR70507
DMEM（1X）Dulbecco改良Eagle培养基Gibco by life technologies21969-035(+) 4.5 g/L D-葡萄糖
0.11 g/L 丙酮酸钠
(-) L-谷氨酰胺
RPMI 1640 培养基（1X）Gibco by life technologies31870-025
牛血清白蛋白（BSA）聚丙烯酸K45-001
Nutridoma-SP罗氏11011375001100X 浓缩液
PBS-磷酸盐缓冲液（10倍浓度），pH 7.4AmbionAM9624
EDTA（乙二胺四乙酸）0.5 M pH=8Invitrogen by Life Technologies15575-020
胎牛血清（FBS）Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - 淋巴细胞分离液EuroBioCMSMSL01-01密度 1.0777 ± 0.001
链霉亲和素R-藻红蛋白偶联物Invitrogen by Life TechnologiesS21388优质级 1 mg/ml，含 5 mM 叠氮化钠
链霉亲和素，别藻蓝蛋白偶联物Invitrogen by thermoFisher scientificS323621 mg/ml
2 mM 叠氮化钠 优级纯
Brilliant violet 421 streptavidinBiolegend405225conc：0.5 mg/ml
抗PE偶联磁性微珠Miltenyi Biotec130-048-801
抗APC偶联磁性微珠Miltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs 或 QuadroMACs 分选仪Miltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109使用稀释度 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788使用稀释度1:20
CD14 PerCP-Cy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116使用稀释度 1:50
CD16 PerCP-Cy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440使用稀释度1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)使用稀释度1:1000
FACS ARIA III 细胞分选仪细胞计数器BD Biosciences
8联排PCR管Axygen321-10-061
96孔微量管架Dominique Dutscher45476
RNAseOUT 核糖核酸酶抑制剂（重组）Invitrogen by thermoFisher scientific10777-0195000U（40U/μl）
无 DNase/RNase 的蒸馏水Gibco10977-035
寡核苷酸(dT)18 mRNA引物New England BioLabsS1316S5.0 A260单位
随机六聚体Invitrogen by thermoFisher scientificN808012750 μM，5 nmol
Superscript III 逆转录酶Invitrogen 赛默飞世尔科技18080-044数量：10000U（200U/μl）
GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶PromegaM7805
dNTP 试剂盒，分子生物学级Thermo ScientificR01824*100 μmol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		第一轮 PCR - 重链扩增 - 外侧引物 - 正向引物
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		第一轮 PCR——重链扩增——外侧引物——正向引物
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		第一轮 PCR - 重链扩增 - 外侧引物 - 正向引物
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		第一轮PCR——重链扩增——外侧引物——正向引物
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		第一轮PCR——重链扩增——外侧引物——人Ig恒定区反转录引物——细菌PCR筛选
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		第一轮PCR——重链扩增——外侧引物——人Ig反向引物
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——正向引物
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——正向引物
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		第二轮 PCR - 重链扩增 - 内引物 - 正向引物
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——正向引物
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——正向引物
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——正向引物
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		第二轮 PCR——重链扩增——内侧引物——正向引物
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		第二轮 PCR——重链扩增——内侧引物——正向引物
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		第二轮 PCR - 重链扩增 - 内引物 - 正向引物
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——反向引物
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——反向引物
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		第二轮 PCR——重链扩增——内引物——反向引物
5'LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		第一轮PCR——轻链κ的扩增——外侧引物——正向引物
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		第一轮PCR——轻链κ的扩增——外侧引物——正向引物
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		第一轮PCR——轻链κ的扩增——外侧引物——正向引物
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		第一轮PCR——轻链κ的扩增——外侧引物——逆转录引物——细菌PCR筛选
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		第二轮 PCR - 扩增轻链 κ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVk1_9_1–13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		第二轮 PCR - 扩增轻链 κ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		第二轮 PCR - 扩增轻链 κ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		第二轮 PCR - 扩增轻链 k - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		第二轮 PCR - 扩增轻链 k - 内引物 - 正向引物
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		第二轮 PCR - 扩增轻链 κ - 内引物 - 正向引物
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		第二轮 PCR——轻链 κ 的扩增——内引物——正向引物
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		第二轮 PCR - 扩增轻链 κ - 内引物 - 正向引物
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		第二轮 PCR - 轻链 k 的扩增 - 内引物 - 正向引物
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		第二轮 PCR - 扩增轻链 κ - 内引物 - 正向引物
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		第二轮 PCR——轻链 κ 的扩增——内引物——正向引物
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		第二轮 PCR - 轻链 k 的扩增 - 内引物 - 正向引物
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		第一轮PCR——轻链扩增 λ - 外引物 - 正向引物
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		第二轮 PCR——轻链扩增 λ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		第二轮 PCR——轻链扩增 λ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		第二轮 PCR——轻链扩增 λ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		第二轮 PCR——轻链扩增 λ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		第二轮 PCR——轻链扩增 λ - 内引物 - 正向引物
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		第二轮PCR——轻链扩增 λ - 内引物 - 正向引物
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		第二轮 PCR——轻链扩增 λ - 内部引物 - 反向引物 - 细菌PCR筛选
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		细菌PCR筛选
QA 琼脂糖-TM，分子生物学级MP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR板Macherey Nagel743.100.100
酶 Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
酶 SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
酶 Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
酶 BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1（GenBank登录号 FJ475055）
LCk（GenBank登录号 FJ475056）
LCl（GenBank 登录号 FJ517647）
T4 DNA连接酶Invitrogen 赛默飞世尔科技15224.017100U（1U/μl）
2X YT 培养基Sigma AldrichY1003-500ML
氨苄青霉素Sigma Aldrich10835242001
LB（Luria Bertani）肉汤（Lennox）Sigma AldrichL3022-250G
Nucleospin 质粒 DNA、RNA 和蛋白质纯化Macherey Nagel740588.250
Jet PEI DNA转染试剂PolyPlus101-40
平底96孔板Falcon353072
V型底96孔板Nunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 cm² 培养瓶Nunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT 包被缓冲液eBiosciences00-0044-59
Nunc MaxiSorp 平底 96 孔 ELISA 板Nunc/Thermofisher44-2404-21高蛋白结合
辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人 IgG 抗体BD Pharmingen / BD Biosciences55788
TMB底物BD Biosciences555214
链霉亲和素SigmaS0677
1 mL-HiTrap protein A HP 柱GE Healthcare17-0402-01
ÄKTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GL 柱GE Healthcare17517501
NGC Quest 10 Plus 色谱系统BioRad7880003

参考文献

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

标签

外周血单个核细胞单细胞逆转录PCR流式细胞术分选HLA-A2/Pp65四聚体磁性微珠分离ELISA检测表面等离子共振免疫球蛋白基因扩增
从血液中稀有的抗原特异性B细胞高效制备具有区分能力的人源单克隆抗体
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