我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。
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摘要
摘要
以时相依赖的方式研究细胞周期中的各种调控事件，有助于深入理解细胞的生长与分裂过程。将细胞群体同步于细胞周期的特定阶段，已被证明在相关实验研究中具有重要价值。使用毒性相对较低的化学试剂对细胞进行同步化处理，相较于使用药理学抑制剂，更有利于后续细胞周期事件的研究，并可实现对特定有丝分裂阶段的富集。本文介绍了一种用于将人类细胞同步于细胞周期不同阶段的实验方案，包括通过双胸苷阻断与释放程序将细胞同步于S期和M期，以研究有丝分裂蛋白在染色体排列与分离过程中的功能。该方案对于研究兼具明确间期功能的多功能蛋白的有丝分裂作用尤为有效。以我们的研究为例，Cdt1是一种在G1期DNA复制起点许可中起关键作用的蛋白，其有丝分裂功能只有在特异性耗尽G2/M期的Cdt1时才能有效研究。本文详细描述了利用双胸苷同步化方法耗尽G2/M期特异性Cdt1的实验流程。同时，我们还阐述了胸苷释放后的细胞固定方法，以及利用高分辨率共聚焦显微镜进行活细胞成像的技术。该方法同样适用于在生理状态及扰动条件下（例如对Ndc80复合物组分Hec1的研究）分析有丝分裂蛋白的功能，因为它能够提供大量处于有丝分裂阶段的细胞样本，用于固定细胞和活细胞分析，正如本文所示。
引言
在细胞周期中，细胞经历一系列高度调控且时间精确的事件，以实现基因组的准确复制和细胞增殖。在哺乳动物中，细胞周期包括间期和M期。间期分为三个阶段：G1期、S期和G2期，细胞在此期间复制其基因组并进行生长，这是正常细胞周期进程所必需的1,4。在M期，包括有丝分裂（前期、前中期、中期、后期和末期）和胞质分裂，一个母细胞产生两个遗传上完全相同的子细胞。在有丝分裂过程中，复制后的姐妹染色单体发生凝缩（前期），并通过组装好的有丝分裂纺锤体的微管在其动粒上被捕获（前中期），进而被驱动至赤道板位置排列（中期），随后姐妹染色单体分离并被拉向相反的纺锤极，实现均等分配（后期）。两个子细胞通过基于肌动蛋白的收缩环的作用实现物理上的分离（末期和胞质分裂）。动粒是一种特化的蛋白质结构，组装于染色单体的着丝粒区域，作为纺锤体微管的附着位点。其主要功能是介导染色体的捕获与排列，并协助纠正错误的纺锤体微管连接，同时参与调控纺锤体组装检验点，以确保染色体分离的保真性3,4。
细胞同步化技术是研究细胞周期进程中分子和结构事件的理想工具。该方法可用于富集处于特定阶段的细胞群体，以进行多种类型的分析，包括基因表达谱分析、细胞生化过程分析以及蛋白质亚细胞定位检测。同步化的哺乳动物细胞不仅可用于单个基因产物的研究，还可用于涉及全基因组分析的方法，包括基因表达的微阵列分析5、miRNA表达模式分析6、翻译调控研究7以及蛋白质修饰的蛋白质组学分析8。此外，细胞同步化还可用于研究基因表达或蛋白质敲低、敲除，以及化学物质对细胞周期进程的影响。
细胞可以在细胞周期的不同阶段进行同步化。物理和化学方法均被广泛用于细胞同步化。细胞同步化的最重要标准是同步化过程应无细胞毒性且可逆。由于药理学试剂在同步化细胞时可能带来潜在的不良细胞效应，依赖化学试剂的方法在研究关键细胞周期事件时具有一定优势。例如，羟基脲（hydroxyurea）、阿糖腺苷（amphidicolin）、含羞草氨酸（mimosine）和洛伐他汀（lovastatin）可用于将细胞阻滞在G1/S期，但由于它们会抑制特定的生化通路，因而会激活细胞周期检查点机制并导致大量细胞死亡9,10。另一方面，通过向培养基中添加胸腺嘧啶核苷（thymidine）以反馈抑制DNA复制，即所谓的"胸腺嘧啶核苷阻滞"，可在特定时点阻滞细胞周期进程11,12,13。此外，也可使用诺考达唑（nocodazole）和RO-3306将细胞同步于G2/M期9,14。诺考达唑通过抑制微管组装发挥作用，但其细胞毒性相对较高。此外，经诺考达唑阻滞的细胞可能因有丝分裂逃逸（mitotic slippage）而提前返回间期。双胸腺嘧啶核苷阻滞法可将细胞阻滞在G1/S期，释放阻滞后，细胞可同步地通过G2期并进入有丝分裂。通过高分辨率共聚焦显微镜对固定细胞或活细胞成像，均可观察到从胸腺嘧啶核苷阻滞中释放的细胞在细胞周期中的正常进程。当细胞在双胸腺嘧啶核苷阻滞释放后进入并经历有丝分裂时，可特异性地研究有丝分裂相关蛋白扰动的影响。Cdt1是一种多功能蛋白，在G1期参与DNA复制起始许可，并在有丝分裂期间对动粒微管的连接也具有重要作用15。为了研究Cdt1在有丝分裂期间的功能，需要采用一种既能避免其在G1期对复制许可造成影响，又能特异性地仅在G2/M期实现其耗竭的方法。本文提供了基于双胸腺嘧啶核苷阻滞的详细实验方案，结合固定细胞和活细胞成像技术，用于研究在细胞周期不同阶段具有多种功能的蛋白在有丝分裂中的作用。
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方案
1. 双胸腺嘧啶阻断与释放：试剂制备
- 配制500 mL添加有10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 将胸苷溶于无菌水中，配制成100 mM的储存液，分装后于-80 °C保存。
2. 有丝分裂进程的固定细胞成像方案（图1A）
- 第1天，接种约2 x 105 将HeLa细胞接种至含盖玻片（经70%乙醇和紫外照射灭菌）的6孔板中，每孔加入2 mL DMEM培养基。于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养24 h。2.
- 1st 胸苷阻断：第2天，将所需体积的胸苷充分混入新鲜DMEM培养基中（100 mM 储存液，终浓度为2 mM）。
- 向6孔板中每个孔的细胞加入2 mL含胸腺嘧啶的培养基，孵育18 h。
- 第3天，吸除培养基，用2 mL 1×PBS洗涤细胞两次，再用新鲜预热的DMEM洗涤一次；将细胞置于新鲜预热的DMEM培养基中培养9小时，以解除细胞阻滞。
- 2nd 胸苷阻断：向6孔板中每孔细胞再次加入2 mL含胸苷的培养基（终浓度为2 mM）。
- 继续孵育18小时。
- 第4天，吸除培养基，用2 mL 1× PBS洗涤细胞两次，再用新鲜预热的DMEM洗涤一次。
- 将siRNA（对照和Cdt1）和转染试剂分别用无血清培养基稀释，室温孵育10分钟。将两者混合后继续在室温孵育20分钟。每次转染使用的siRNA终浓度为100 nM。将反应混合物加入已去除胸腺嘧啶核苷的细胞中。
- 在37 °C下孵育细胞9–10小时以解除阻滞，并在室温下用4%多聚甲醛固定盖玻片上的细胞20分钟。
注意：PFA 具有毒性，需佩戴适当的防护装备。 - 在室温下用0.5%（v/v）去垢剂透化处理细胞10分钟，然后用1×PBS洗涤细胞两次，每次5分钟，之后进行免疫染色。
- 用含1% (w/v) BSA的1×PBS在室温下封闭细胞1 h，随后在含1% (w/v) BSA的1×PBS中加入50 µL一抗（小鼠抗α-tubulin抗体，1:1,000稀释；兔抗Zwint1抗体，1:400稀释；小鼠抗phospho-ɣ H2AX抗体，1:300稀释），37 ℃孵育1 h oC.
- 用1×PBS洗涤细胞3次后，每张盖玻片加入50 µL二抗（Alexa 488和Rhodamine Red，按1:250比例溶于含1% (w/v) BSA的1×PBS中），室温孵育1小时。
- 用1×PBS洗涤细胞两次，每次5分钟，随后在室温下用DAPI（0.1 µg/mL溶于1×PBS）处理细胞5分钟。
- 用1×PBS洗涤细胞两次，每次5分钟，然后将带有细胞的一面朝下置于干净的显微镜载玻片上适量的封片剂中。
- 使用倒置高分辨率共聚焦显微镜，配备适当相机以满足所需图像质量，采用60倍或100倍1.4数值孔径平场复消色差DIC油浸物镜，对免疫染色蛋白的细胞进行成像。
- 在室温下使用适用于显微镜的软件，以0.2 µm厚度采集z轴层扫图像。
3. 有丝分裂进程的活细胞成像方案（图3A）
- 第1天，接种约0.5–1 × 105 表达 mCherry-H2B 和 GFP-α-tubulin 的 HeLa 细胞（表达水平因细胞类型及其表达的蛋白略有差异）接种于含 1.5 mL DMEM 培养基的 35 mm 玻底培养皿中，置于 37 °C 湿润培养箱中培养 24 小时 oC 和 5% CO₂2.
- 1st 胸苷阻断：第2天，向培养皿中的细胞加入1.5 mL含胸苷的培养基（终浓度为2 mM，含100 mM胸苷）。
- 孵育18小时。
- 第3天，吸除含胸苷的培养基，用1× PBS洗涤细胞3次（前两次每次2 mL），再用新鲜预热的DMEM洗涤1次。
- 将siRNA（对照和Hec1）和转染试剂分别用无血清培养基稀释，室温孵育10分钟。将两者混合后继续在室温孵育20分钟。每次转染使用的siRNA终浓度为100 nM。将反应混合物加入已去除胸腺嘧啶核苷的细胞中。
- 在1.5 mL新鲜预热的DMEM培养基中培养细胞8小时，以解除细胞阻滞。
- 2nd 胸苷阻断：向培养皿中的细胞加入1.5 mL含胸苷的培养基（终浓度为2 mM）。
- 继续孵育18小时。
- 第4天，吸去培养基，用1× PBS洗涤细胞三次（前两次每次2 mL），再用预热的新鲜DMEM洗涤一次。随后将细胞置于补充有10% FBS和20 mM HEPES（pH 7.0）的预热新鲜Leibovitz's (L-15)培养基中培养8小时，以解除细胞阻滞。
- 将培养皿放入已开启至少30分钟的高分辨率共聚焦显微镜的温控腔室中，以确保成像开始前载物台及实验环境的温度稳定。
- 使用60倍物镜在明场下对焦，直至细胞可见，然后手动移动载物台至目标区域。
- 使用所选的显微镜图像采集软件设置光源和激光功率/曝光、图像采集参数以及实验持续时间。使用GFP（488激发；385 nm发射）和mCherry（561 nm激发和385 nm发射）的滤光片进行图像采集。
- 每10分钟交替采集一次脉冲透射光和荧光图像，持续进行延时实验，总时长可达16小时。
- 使用适用于显微镜的软件，在胸苷双阻断释放后9小时，以12个间隔为1.0 µm的z平面采集图像。
- 使用源软件 Fiji/ImageJ 分析追踪单个细胞有丝分裂进程的图像，并最终组装相应的视频。
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结果
双胸苷阻断释放后固定细胞中分裂进程与微管稳定性的研究
Cdt1 参与 G1 期 DNA 复制起点的许可。它在 S 期被降解，但在 G2/M 期重新积累。为了研究其在有丝分裂中的作用，需要利用最合适的细胞同步化技术——双胸腺嘧啶阻断法，特异性地在 G/M 期耗尽内源性 Cdt1。15细胞在从第2次释放后立即转染siRNAnd 胸腺嘧啶核苷阻断法，用于使细胞停留在S期，此时G1期中复制起点的许可过程（该过程也需要Cdt1功能）早已完成。通过Western印迹法验证了转染siCdt1并经双重胸腺嘧啶核苷阻断释放9小时后Cdt1的耗竭情况（图1B）。在双胸苷阻断释放后9小时固定细胞，结果显示对照组和转染Cdt1 siRNA的细胞中大多数均处于中期阶段。而在双胸苷阻断释放后10小时固定细胞时，结果显示大多数Cdt1 siRNA处理的细胞仍停滞在晚前期阶段，而对照组细胞则如期进入后期，并正常分离染色体（
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讨论
双胸苷同步化最关键的优点在于，它可在短时间内获得大量有丝分裂细胞样本，且其中许多细胞同步进入有丝分裂期，从而能够更高效地分析染色体排列、双极纺锤体形成以及染色体分离过程。
许多调控蛋白复合物和信号通路都致力于确保有丝分裂的正常进行，而该过程的失调可能导致肿瘤发生。通过对稳定表达mCherry-H2B和GFP-微管蛋白并从双胸苷阻断释放的HeLa细胞进行活细胞成像显示，大多数对照细胞在核膜破裂（NEB）后约60分钟内进入后期并完成染色体分离（图3B）。另一方面，对Hec1功能受到干扰的HeLa细胞进行活细胞成像显示，大多数细胞长时间停滞在有丝分裂期，伴有染色体排列异常，随后进入后期或发生凋亡（图3C）。
过量胸腺嘧啶可抑制S期的DNA合成，从而将细胞阻滞在G1/S期11。尽管双胸腺嘧啶阻滞同步化是细胞周期和有丝分裂进程研究中最常用的方法，但仍需注意该方法存在的一些...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢日本东北大学的Kozo Tanaka博士分享稳定表达mCherry-Histone H2B和GFP-α-tubulin的HeLa细胞。本研究得到了美国国家癌症研究所资助DV（R00CA178188）以及西北大学启动资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | 4 °C 下保存 |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | 4 °C 下保存 |
| Leibovitz’s (1x) L-15 培养基 | Life Technologies | 21083-027 | 4 °C 下保存 |
| 血清减量培养基（Opti-MEM） | Life Technologies | 319-85-070 | 4 °C 下保存 |
| 青霉素和链霉素 | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 稀释 |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | 4 °C 下保存 |
| 胸苷 | MP Biomedicals LLC | 103056 | 溶于无菌蒸馏水 |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | 参考文献 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | 参考文献 13 | |
| 表达 GFP-H2B 的 HeLa 细胞 | |||
| 表达 GFP-α-微管蛋白和 mCherry H2B 的 HeLa 细胞 | 由日本东北大学 Kozo Tanaka 博士慷慨惠赠 | ||
| 甲醛溶液 | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | 有毒，需谨慎操作 |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | 有毒，需谨慎操作 |
| 小鼠抗-α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 稀释 |
| 兔抗-Zwint1 抗体 | Bethyl | A300-781A | 1:400 稀释 |
| 小鼠抗-磷酸化-γH2AX (Ser139) 抗体 | Upstate Biotechnology | 05-626, 克隆 JBW301 | 1:300 稀释 |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 稀释 | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 稀释 | |
| BioLite 6 孔多孔培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE 倒置显微镜 | Nikon Instruments | ||
| 共聚焦用转盘系统 | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD 相机 | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 四波长激光器 | Agilent Technologies | ||
| 显微镜用培养系统 | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements 软件 | Nikon Instruments |
参考文献
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