本文介绍一种简单快速的方法，通过用生物素和链霉亲和素包被细菌，从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体。
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本文内容
摘要
摘要
Salmonella typhimurium 是一种兼性胞内细菌，可引起人类胃肠炎。在侵入固有层后，S. typhimurium 细菌会迅速被巨噬细胞识别并吞噬，进入称为吞噬体的囊泡中，以期被降解。分离含有 S. typhimurium 的吞噬体已被广泛用于研究 S. typhimurium 感染如何改变吞噬体成熟过程，从而避免细菌被降解。传统上，含细菌吞噬体的分离依赖于蔗糖梯度离心法。然而，该方法耗时较长，且需要专用设备以及一定的操作技巧。本文介绍一种简单快速的方法，通过用生物素-链霉亲和素偶联的磁珠包被细菌，从巨噬细胞中分离含有 S. typhimurium 的吞噬体。采用该方法获得的吞噬体可悬浮于任意选择的缓冲液中，便于将分离的吞噬体用于多种检测，如蛋白质、代谢物和脂质分析。总之，这种分离含 S. typhimurium 吞噬体的方法具有特异性强、效率高、速度快、所需设备最少等优点，且比传统的蔗糖梯度超速离心法更具通用性。
引言
巨噬细胞是一类循环中的特化吞噬细胞，能够识别、内吞并降解外周组织中存在的任何外来颗粒，从凋亡细胞到入侵的微生物（如细菌）均在其作用范围内。当巨噬细胞通过其表面受体识别出通常存在于微生物表面的病原体特异性标志物（称为病原体相关分子模式，PAMPs）时，便会启动细胞膜的复杂重组过程，以包裹并吞噬病原体1。
被吞噬的病原体随后被巨噬细胞包裹在一种称为吞噬体的细胞内囊泡中。通过与其他囊泡（如内体和溶酶体）发生一系列融合与分裂事件，含有病原体的吞噬体获得一组清除吞噬体内容物所必需的蛋白质。因此，在这一被称为吞噬体成熟的过程中，吞噬体的酶组成具有高度可变性2。
吞噬作用发生后不久，多聚体复合物液泡ATP酶（v-ATPase）通过与内体融合被整合到吞噬体膜中3。该复合物利用ATP将质子从细胞质泵入吞噬体腔内4。吞噬体的酸化对于与其他囊泡的融合事件5以及大量pH依赖性降解酶的活化至关重要6。另一种迅速在吞噬体膜上组装的多聚体酶复合物是NADPH氧化酶（NOX）复合物。NOX复合物通过氧化NADPH产生活性氧（ROS），这些活性氧被分泌至吞噬体腔内，对被吞....
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方案
所有涉及使用致病性S. typhimurium的操作必须在生物安全二级（BSL-2）或更高级别的实验室中进行。S. Typhimurium的培养与包被，以及对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的感染操作，均须在超净工作台内执行，以防止污染。含有S. typhimurium的吞噬体的分离可在任何BSL-2级实验台面上进行。
从小鼠中提取骨髓并将其分化为巨噬细胞的操作，遵循了动物福利方面的机构指南，并获得了北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局［Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen；文件编号：84-02.05.40.14.082 和 84-02.04.2015.A443］以及科隆大学的批准。
1. 培养伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）
- 接种 S. 鼠伤寒沙门氏菌 使用细菌接种环将单个细菌菌落中的（SL1344菌株）接种至5 mL脑心浸液（BHI）肉汤中。
- 在37 °C摇床培养箱中孵育细菌悬液过夜。
- 次日，将1 mL细菌悬液转移至含有19 mL BHI肉汤的锥形瓶中，在37 °C摇床培养箱中孵....
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结果
通过本方案分离含有细菌的吞噬体，首先需要对细菌进行生物素标记。因此，我们评估了该方法的有效性 S. typhimurium 通过共聚焦显微镜分析感染了生物素标记的mCherry的BMDMs的生物素化S. typhimurium 用Cy5-Streptavidin标记。简言之，BMDMs按照本方案所述方法用mCherry-S. typhimurium 先前已生物素标记但未与链霉亲和素偶联磁珠孵育的样本。在30分钟孵育后于 37 °C，用预温的PBS洗涤细胞，随后在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。通过多次PBS洗涤终止固定。接着在室温下用含3% Triton的PBS处理5分钟以通透细胞。然后将感染的BMDM与Cy5-Streptavidin在室温下孵育20分钟 4 °C经过充分洗涤后，将样品制备用于共聚焦显微镜分析（图1）。非生物素标记的 mCherry-S鼠伤寒沙门氏菌用作阴性对照。仅在生.......
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讨论
本文介绍了一种通过用生物素和链霉亲和素偶联的磁珠包被细菌来分离含有S. typhimurium的吞噬体的新方法。在轻柔裂解细胞膜后，可利用磁力架轻松提取含有细菌的吞噬体。我们证明，对细菌进行标记能够保持病原体诱导炎症反应的能力，并且不改变宿主细胞的吞噬特性。重要的是，通过该方法获得的吞噬体富含细菌以及内体/溶酶体标志物，且无胞质污染。
与传统的采用蔗糖梯度分离的吞噬体分离方法相比，该方法具有多项优势。它省去了耗时的多次离心步骤，使研究人员能够在更短时间内处理更多样本，并通过简单增加洗涤次数获得纯度更高的吞噬体样本。本方案的使用避免了对超速离心等特殊且敏感设备的需求。高速离心可能改变囊泡的特性，并降低最终得率22，这在本方案中应避免。我们还证明了包被 S. 鼠伤寒沙门氏菌 使用生物素和链霉亲和素偶联的磁珠不会改变巨噬细胞的吞噬能力。此外，用标记物感染后巨噬细胞中IL-6的诱导 S. typhimurium 与未标记细菌感染的巨噬细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Robinson 实验室的研究工作获得了德国科隆大学科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群（CECAD）的资助（该机构由德国联邦和州政府卓越计划框架下德国研究基金会（DFG）资助），以及德国研究基金会（SFB 670）、Köln Fortune 和德国科隆大学 Maria-Pesch 基金会所提供的项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EZ-Link NHS 生物素 | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag 链霉亲和素磁珠 | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| 蔗糖 | Carl Roth | 4621.1 | |
| 甘露醇 | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| 细胞松弛素 B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL 或 DynaMag 磁力架 | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 分光光度计 | Bio-Rad | 170-2501 | |
| 细菌接种环（10µl） | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| 鼠伤寒沙门氏菌 SL1344 菌株 | Leibniz Institute DSMZ-德国微生物与细胞培养保藏中心 | ||
| RPMI 培养基 | Biochrom | FG1415 | |
| PBS 缓冲液 | Biochrom | L1825 | |
| Cy5 标记链霉亲和素 | Invitrogen | SA1011 | |
| 抗 β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗 mCherry 抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| 抗 Rab5 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| 抗 Rab7 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| 抗 v-ATPase（V0）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| 抗 v-ATPase（V1）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| 抗组织蛋白酶 D 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| 抗 Tomm20 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| 抗钙连蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| 抗 GAPDH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
参考文献
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-79....
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