从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体

摘要

本文介绍一种简单快速的方法，通过用生物素和链霉亲和素包被细菌，从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体。

摘要

Salmonella typhimurium 是一种兼性胞内细菌，可引起人类胃肠炎。在侵入固有层后，S. typhimurium 细菌会迅速被巨噬细胞识别并吞噬，进入称为吞噬体的囊泡中，以期被降解。分离含有 S. typhimurium 的吞噬体已被广泛用于研究 S. typhimurium 感染如何改变吞噬体成熟过程，从而避免细菌被降解。传统上，含细菌吞噬体的分离依赖于蔗糖梯度离心法。然而，该方法耗时较长，且需要专用设备以及一定的操作技巧。本文介绍一种简单快速的方法，通过用生物素-链霉亲和素偶联的磁珠包被细菌，从巨噬细胞中分离含有 S. typhimurium 的吞噬体。采用该方法获得的吞噬体可悬浮于任意选择的缓冲液中，便于将分离的吞噬体用于多种检测，如蛋白质、代谢物和脂质分析。总之，这种分离含 S. typhimurium 吞噬体的方法具有特异性强、效率高、速度快、所需设备最少等优点，且比传统的蔗糖梯度超速离心法更具通用性。

引言

巨噬细胞是一类循环中的特化吞噬细胞，能够识别、内吞并降解外周组织中存在的任何外来颗粒，从凋亡细胞到入侵的微生物（如细菌）均在其作用范围内。当巨噬细胞通过其表面受体识别出通常存在于微生物表面的病原体特异性标志物（称为病原体相关分子模式，PAMPs）时，便会启动细胞膜的复杂重组过程，以包裹并吞噬病原体¹。

被吞噬的病原体随后被巨噬细胞包裹在一种称为吞噬体的细胞内囊泡中。通过与其他囊泡（如内体和溶酶体）发生一系列融合与分裂事件，含有病原体的吞噬体获得一组清除吞噬体内容物所必需的蛋白质。因此，在这一被称为吞噬体成熟的过程中，吞噬体的酶组成具有高度可变性²。

吞噬作用发生后不久，多聚体复合物液泡ATP酶（v-ATPase）通过与内体融合被整合到吞噬体膜中³。该复合物利用ATP将质子从细胞质泵入吞噬体腔内⁴。吞噬体的酸化对于与其他囊泡的融合事件⁵以及大量pH依赖性降解酶的活化至关重要⁶。另一种迅速在吞噬体膜上组装的多聚体酶复合物是NADPH氧化酶（NOX）复合物。NOX复合物通过氧化NADPH产生活性氧（ROS），这些活性氧被分泌至吞噬体腔内，对被吞噬微生物的杀灭起着重要作用⁷。

在成熟过程的初始阶段，吞噬体通常会表现出早期内体和晚期内体的标志物，例如Rab5和Rab7，以及v-ATPase的V₀亚基⁸。吞噬体与溶酶体及晚期内体融合后，被吞噬的病原体会暴露于多种水解酶中，如组织蛋白酶（cathepsin）蛋白酶、脂肪酶和β-半乳糖苷酶⁹。腔体的酸化对于这些酶的活化也至关重要。例如，组织蛋白酶D被切割生成具有活性的短链形式这一过程依赖于pH值¹⁰。这些酶可降解病原体，并促进产生来源于病原体的短肽，后者由巨噬细胞的主要组织相容性复合体（MHC）II类分子呈递给T细胞，从而触发适应性免疫反应¹¹。

因此，吞噬体成熟对于先天免疫反应至关重要，并且连接了免疫系统的先天性和适应性免疫应答。病原体已进化出多种策略以逃避巨噬细胞通过上述吞噬体成熟过程将其清除，这并不令人意外。例如，胞内细菌Mycobacterium tuberculosis和Legionella pneumophila通过抑制v-ATPase的组装及其导致的腔体酸化，从而阻断吞噬体的成熟^12,13。其他细菌，如Listeria monocytogenes或Shigella flexneri，则通过在吞噬体膜上诱导形成孔道，逃逸至胞质溶胶中^14,15。另一方面，Salmonella enterica血清型typhimurium（S. typhimurium）能够在液泡内修饰吞噬体的特性，将其转化为适合自身复制的环境¹⁶。这种能力使S. typhimurium成为研究病原体介导的吞噬体成熟干扰机制的一个极具价值的模型。

S. typhimurium 是一种兼性胞内细菌，可引起人类胃肠炎。在侵入黏膜下层后，S. Typhimurium 细菌会迅速被巨噬细胞识别并吞噬，并被包裹于吞噬体中¹⁷。一些既往研究报道，含有 S. typhimurium 的吞噬体同时具有内体和溶酶体的标志物¹⁸，而其他研究则发现，在 S. Typhimurium 感染后，吞噬体与溶酶体的融合受到抑制¹⁹。

最初，通过免疫荧光显微镜研究了伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）感染后吞噬体的成熟过程。细菌携带型吞噬体分离技术的发展，使得能够更精确地研究吞噬体内容物中的内体和溶酶体标志物。迄今为止，分离含细菌吞噬体的主要方法是蔗糖阶梯梯度亚细胞分级法^18,20。然而，该方法需要多次离心步骤，可能导致吞噬体受到机械损伤，影响吞噬体组分（蛋白质和脂质）的稳定性，且耗时较长。此外，该方法需要使用超速离心机——这是一种专业设备，并非所有实验室都能配备。

最近，一种新方法被应用于含细菌吞噬体的分离，该方法通过使用生物素化脂肽（Lipobiotin）标记细菌病原体，随后利用链霉亲和素偶联的磁珠进行提取²¹。我们提出一种替代性的互补方法，即利用NHS-Biotin标记细菌表面含胺基的大分子，再通过链霉亲和素偶联的磁珠进行捕获。采用该方法获得的吞噬体高度富集早期内体和溶酶体标志物，可用于多种检测，从蛋白质分析到组学分析均可适用。此外，该方法无需超速离心机等特殊设备。更重要的是，通过省去离心步骤，显著减少了对吞噬体的机械损伤以及操作所需时间。该方法可轻松适用于其他细菌（如革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus）所含吞噬体的分离，本文亦包含了该菌的相关实验。综上所述，这种分离含S. typhimurium吞噬体的方法比传统的蔗糖梯度超速离心法更为简便、经济且耗时更短，可获得高度富集的含细菌吞噬体。

方案

所有涉及使用致病性S. typhimurium的操作必须在生物安全二级（BSL-2）或更高级别的实验室中进行。S. Typhimurium的培养与包被，以及对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的感染操作，均须在超净工作台内执行，以防止污染。含有S. typhimurium的吞噬体的分离可在任何BSL-2级实验台面上进行。

从小鼠中提取骨髓并将其分化为巨噬细胞的操作，遵循了动物福利方面的机构指南，并获得了北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局［Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen；文件编号：84-02.05.40.14.082 和 84-02.04.2015.A443］以及科隆大学的批准。

1. 培养伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）

1. 接种 S. 鼠伤寒沙门氏菌 使用细菌接种环将单个细菌菌落中的（SL1344菌株）接种至5 mL脑心浸液（BHI）肉汤中。
2. 在37 °C摇床培养箱中孵育细菌悬液过夜。
3. 次日，将1 mL细菌悬液转移至含有19 mL BHI肉汤的锥形瓶中，在37 °C摇床培养箱中孵育。
4. 监测 S. typhimurium 通过测量600 nm处的光密度（OD）来评估生长情况（OD₆₀₀使用分光光度计进行测量，每约30分钟测定一次。
5. 当OD₆₀₀ 当达到1.0时，从培养箱中取出细菌悬液并转移至50 mL离心管中。在4 °C条件下以5,400 x g离心15分钟。
6. 移除上清液，并用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。
7. 在 4 °C 条件下以 5,400 x g 离心 15 分钟。
8. 移除上清液，并将细菌重悬于 4.9 mL 无菌 PBS 中。

2. 使用 NHS-生物素/链霉亲和素偶联磁珠包被 S. typhimurium

1. 向先前步骤制备的细菌悬液中加入100 µL新配制的10 mg/mL生物素连接溶液（NHS-Biotin溶于二甲基亚砜DMSO中）。例如，将5 mg NHS-Biotin溶解于0.5 mL无菌DMSO中。通过反复吹打数次充分混匀。
2. 将混合液分装至五个1.5 mL离心管中。
3. 在室温（RT）下，于恒温金属浴中以350 rpm持续振荡孵育2小时。
4. 在室温下以15,000 × g离心10分钟，弃去上清液。
5. 用1 mL无菌PBS重悬沉淀，于室温下以15,000 × g离心10分钟，弃去上清液。
6. 重复步骤2.5两次，以彻底去除多余的生物素连接溶液。
7. 最后一次洗涤后，将沉淀重悬于1 mL无菌PBS中。
8. 取100 µL浓度为10 mg/mL的链霉亲和素偶联磁珠溶液转移至1.5 mL离心管中，并将其置于磁力架上静置5分钟。
9. 用移液器吸除溶剂，将链霉亲和素偶联磁珠从磁力架上取下，加入1 mL在步骤2.7中制备的生物素包被的细菌悬液并重悬。
10. 在室温下，于恒温金属浴中以350 rpm持续振荡孵育1小时。
11. 将溶液置于磁力架上，静置5分钟后，用移液器吸除未吸附在管壁上的细菌（将其收集至标记为"non-coated bacteria"的离心管中）。与磁铁接触侧管壁上吸附的组分为生物素/链霉亲和素包被的细菌。
12. 将含有标记细菌的离心管从磁力架上取下，加入1 mL无菌PBS重悬。
13. 再次将离心管置于磁力架上，静置5分钟，用移液器吸除PBS。
14. 重复步骤2.13和2.14两次，以去除所有未被链霉亲和素偶联磁珠包被的细菌。
15. 最后一次洗涤后，将包被的细菌重悬于500 µL无菌PBS中，并将离心管标记为"coated bacteria"。
16. 通过在BHI琼脂平板上进行系列稀释涂布，测定"non-coated bacteria"和"coated bacteria"两种溶液的菌落形成单位（cfu）。通常，从OD₆₀₀为1.0的20 mL初始细菌悬液中可获得约2 × 10⁸ cfu/mL的包被细菌。将包被的细菌悬液保存于4 °C，用于次日感染巨噬细胞。

3. BDMDs 的感染

1. 在细菌包被生物素和链霉亲和素偶联磁珠的同一天，将完全分化的BMDMs²²以每皿5 × 10⁶个细胞的密度接种于6 cm培养皿中。
2. 次日，将包被细菌悬液在4 °C条件下以15,000 × g离心5分钟。
3. 弃去上清液，并将沉淀重悬于补充有10%胎牛血清（FBS）的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中，调整浓度至10 × 10⁶ cfu/mL。
4. 为以感染复数（MOI）为10的条件感染巨噬细胞，吸除BMDMs中的培养基，加入5 mL上述制备的包被细菌悬液。针对不同细胞类型或分离吞噬体的实验目的，应优化确定最佳MOI。
5. 在室温下孵育10分钟，以同步化吞噬过程。
6. 随后将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟，以启动吞噬作用。其他类型的细胞可能需要不同的孵育时间以确保细菌被完全内化。
7. 从培养皿中移除含细菌的培养基，并用RPMI培养基洗涤细胞三次，以去除未被内化的细菌。
8. 最后加入含10% FBS和50 µg/mL庆大霉素的10 mL RPMI培养基，以杀灭所有未被吞噬的细菌。
9. 将感染后的BMDMs在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育至所需时间点。所需时间点应根据所用细菌种类、细胞类型及分析目的通过实验确定。在研究S. Typhimurium感染BMDMs中早期吞噬体-内体融合事件时，建议孵育30分钟；若分析后期事件，可在孵育2小时或4小时后提取吞噬体。巨噬细胞与S. Typhimurium共培养超过24小时会导致细胞死亡。在吞噬体提取前延长胞内感染时间可能导致生物素分子降解。然而，我们在24小时内未观察到包被细菌上的生物素丢失现象。

4. 分离 S. typhimurium含吞噬体

1. 按需配制吞噬体分离缓冲液 A（50 mM PIPES，pH 7.0，50 mM MgCl₂，5 mM EGTA），加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为 1 mM，细胞松弛素 B 至终浓度为 10 µM，并按制造商推荐添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
   注意：DTT 和细胞松弛素 B 必须在使用前立即加入吞噬体分离缓冲液 A 中。细胞松弛素 B 可破坏细胞骨架，促进细胞膜破裂。
2. 在预定时间点，移除感染细胞的培养基，并用室温预热的无菌 PBS 洗涤。
3. 每皿加入 750 µL 吞噬体分离缓冲液 A，冰上孵育 20 分钟。若使用不同数量的细胞，应按比例调整分离缓冲液 A 的体积。
4. 每皿加入 250 µL 吞噬体分离缓冲液 B（50 mM PIPES，pH 7.0，50 mM MgCl₂，5 mM EGTA，220 mM 甘露醇和 68 mM 蔗糖）。轻轻晃动培养板，确保缓冲液覆盖整个皿表面。若使用不同数量的细胞，应按比例调整分离缓冲液 B 的体积。
5. 用橡胶刮棒轻轻刮取细胞，将其从培养皿中收集，并转移至预冷的 1.5 mL 离心管中。
6. 使用 1 mL 注射器将细胞悬液通过 26G 针头至少推注 15 次（每次吸入和推出细胞悬液计为一次）。此步骤足以释放 BMDM 的胞质内容物。针头推注次数需根据不同细胞类型进行优化。
7. 将细胞悬液置于磁力架上，静置 5 分钟。吸附在磁铁上的颗粒即为含有包被S. Typhimurium 的吞噬体，上清液中含有其余细胞组分。
8. 将上清液转移至标记为 "胞质" 的 1.5 mL 离心管中。
9. 从磁力架上取下含有分离吞噬体的离心管，用 1 mL 无菌 PBS 重悬吞噬体。
10. 将吞噬体悬液再次置于磁力架上，静置 5 分钟后移除 PBS。
11. 重复步骤 4.9 和 4.10，以洗涤分离得到的含 S. typhimurium 的吞噬体。
12. 最后移除 PBS，将吞噬体重悬于所需缓冲液中；例如，用于蛋白质分析的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液。根据初始细胞数量和感染复数（MOI），每样本可获得约 50–200 µg 蛋白质。

结果

通过本方案分离含有细菌的吞噬体，首先需要对细菌进行生物素标记。因此，我们评估了该方法的有效性 S. typhimurium 通过共聚焦显微镜分析感染了生物素标记的mCherry的BMDMs的生物素化S. typhimurium 用Cy5-Streptavidin标记。简言之，BMDMs按照本方案所述方法用mCherry-S. typhimurium 先前已生物素标记但未与链霉亲和素偶联磁珠孵育的样本。在37 °C孵育30分钟后，细胞用预热的PBS洗涤，并在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。通过大量PBS洗涤终止固定。随后在室温下用含3% Triton的PBS处理5分钟以通透细胞。感染的BMDM接着在4 °C下与Cy5-链霉亲和素孵育20分钟。经充分洗涤后，样品制备用于共聚焦显微镜分析图1）。未生物素标记的 mCherry-S鼠伤寒沙门氏菌用作阴性对照。Cy5-链霉亲和素的荧光信号仅在生物素...

讨论

本文介绍了一种通过用生物素和链霉亲和素偶联的磁珠包被细菌来分离含有S. typhimurium的吞噬体的新方法。在轻柔裂解细胞膜后，可利用磁力架轻松提取含有细菌的吞噬体。我们证明，对细菌进行标记能够保持病原体诱导炎症反应的能力，并且不改变宿主细胞的吞噬特性。重要的是，通过该方法获得的吞噬体富含细菌以及内体/溶酶体标志物，且无胞质污染。

与传统的采用蔗糖梯度分离的吞噬体分离方法相比，该方法具有多项优势。它省去了耗时的多次离心步骤，使研究人员能够在更短时间内处理更多样本，并通过简单增加洗涤次数获得纯度更高的吞噬体样本。本方案的使用避免了对超速离心等特殊且敏感设备的需求。高速离心可能改变囊泡的特性，并降低最终得率²²，这在本方案中应避免。我们还证明了包被 S. 鼠伤寒沙门氏菌 使用生物素和链霉亲和素偶联的磁珠不会改变巨噬细胞的吞噬能力。此外，用标记物感染后巨噬细胞中IL-6的诱导 S. typhimurium 与未标记细菌感染的巨噬细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EZ-Link NHS 生物素	Thermo Fisher Scientific	20217
FluidMag 链霉亲和素磁珠	Chemicell	4205
PIPES	Carl Roth	9156.2
MgCl2	Carl Roth	A537.4
EGTA	Carl Roth	3054.3
蔗糖	Carl Roth	4621.1
甘露醇	Carl Roth	4175.1
DTT	Sigma	43816
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液	Thermo Fisher Scientific	1861280
细胞松弛素 B	Sigma	C6762
DYNAL 或 DynaMag 磁力架	Thermo Fisher Scientific	12321D
SmartSpec 3000 分光光度计	Bio-Rad	170-2501
细菌接种环（10µl）	Sarstedt	86.1562.010
鼠伤寒沙门氏菌 SL1344 菌株	Leibniz Institute DSMZ-德国微生物与细胞培养保藏中心
RPMI 培养基	Biochrom	FG1415
PBS 缓冲液	Biochrom	L1825
Cy5 标记链霉亲和素	Invitrogen	SA1011
抗 β-肌动蛋白抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778
抗 mCherry 抗体	Thermo Fisher Scientific	PA5-34974
抗 Rab5 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-46692
抗 Rab7 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-10764
抗 v-ATPase（V0）抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-28801
抗 v-ATPase（V1）抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-20943
抗组织蛋白酶 D 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-6486
抗 Tomm20 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-17764
抗钙连蛋白抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-46669
抗 GAPDH 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-20357