体外酶活性检测用于评估法布里病和庞贝病对药物伴侣治疗的反应性

摘要

目前需要使一类新型“孤儿药”——药理学伴侣药物的临床前检测具有可重复性、快速且高效。我们开发了一种简单、高度标准化且用途广泛的基于细胞培养的检测方法，可用于筛选合适的患者以及新的药理学伴侣药物。

摘要

使用个体化医学治疗溶酶体贮积症（LSDs）等罕见单基因疾病时，面临临床试验设计复杂、成本高昂以及患者数量稀少等挑战。大多数LSDs涉及数百种突变等位基因。这些疾病通常根据严重程度分为2至3种不同的临床类型。此外，对基因型进行分子表征有助于预测临床结局并指导患者管理。因此，我们开发了一种基于HEK293H细胞的简单细胞培养检测方法，该细胞异源过表达在法布里病和庞贝病中发现的突变。类似的方法最近已被用作法布里病中适用于药物伴侣治疗（PCT）突变的临床前检测手段。本文描述了一种改进的细胞培养检测方法，可快速评估法布里病和庞贝病中等位基因变异的表型，从而识别适合接受PCT的患者，并可能促进新型药物伴侣分子的开发。

引言

已有十余种溶酶体贮积症（LSDs）被证实与糖苷酶功能障碍相关，其病因是基因发生原发性突变。在法布里病（OMIM #301500）和庞贝病（OMIM #232300）中，分别已报道超过500种和200种错义突变^1,2,3，约占全部突变总数的60%。目前仍在不断发现大量新的基因变异，其中许多变异的临床意义尚不明确。大量生化研究表明，在法布里病中，某些基因型并不会导致GLA基因（OMIM *300644）完全丧失功能，而是使相应的酶无法达到热力学上有利的折叠构象⁴。这会导致该酶在内质网中滞留并过早降解，尽管其本身具有功能活性。在其他溶酶体贮积症（包括庞贝病）中也得出了类似的结论⁵。此外，对酶变异体的分子特征分析有助于在诊断时对突变进行临床解读⁶，提示溶酶体贮积症的进展过程取决于突变的性质，具有个体差异性。因此，传统上将疾病分为2至3种临床类型的做法应重新评估，以优化临床咨询和治疗决策的流程。

目前这两种疾病均有酶替代疗法（ERT）可供使用。然而，ERT 在某些受累组织或器官（如大脑和骨骼肌）中的疗效有限。此外，ERT 可能引发免疫原性反应....

方案

1. 突变型 pcDNA3.1/GLA 和 pcDNA3.1/GAA 载体的构建

注意：此前已有报道关于GLA和GAA编码序列（cds）的克隆策略^15,18。

1. 利用定点突变技术进行定点突变
   1. 使用参考序列 NM_000169.2 和 NM_000152.4 作为定点突变的模板 GLA 和 GAA 基因。向商业供应商订购一组高纯度、无盐的引物（25-37 个碱基），其正向和反向引物在序列中央位置分别携带一种相应的序列修饰，以单独引入突变。使用免费的引物设计工具辅助引物设计。¹⁹.
   2. 对于反应体系，使用制造商提供的反应溶液和PCR条件的标准方案。
      1. 将5 µL 10x反应缓冲液、10 ng双链模板质粒DNA（pcDNA3.1/GLA或pcDNA3.1/GAA）、每种引物125 ng、1 µL提供的dNTP混合物、3 µL DMSO试剂加入适量去离子水中，使终体积为50 µL。最后加入2.5 U DNA聚合酶，用移液器吹打混匀。设置无引物样本作为阴性对照。
   3. 使用以下程序开....

结果

诱变实验步骤
为了评估GLA基因诱变的效率，将所获得的突变归类至以下类别之一。该诱变方法显示，约66.5%的GLA突变可在第一次尝试中获得，另有25%可在略微调整后的第二次PCR中获得。

类别1：首次尝试的定点突变PCR即有效。

类别2：首次诱变PCR失败（平板上无菌落，未插入突变）；通过将退火温度提高至68 °C并使用相同的引物组重复实验，获得了成功。

类别3：需要付出更多努力才能获得目标克隆（例如，通常需要设计一套或多套新的引物。

讨论

本文所述方案可为遗传性代谢性溶酶体疾病的酶损伤评估提供可靠的结果。本论文是对先前发表方案的修订。¹⁵最关键的修改涉及严谨性（即，在突变型载体构建准备过程中），细胞培养方案的标准化（即，HEK293H细胞的培养与转染条件），以及较高的实验重复次数（至少5次），这些因素均显著提高了结果的可重复性。总体而言，两个靶基因均易于进行诱变操作，且可并行构建多种突变体。考虑到HEK293H细胞内源性酶活性极低，仅为过表达的野生型基因活性的1/50（α-半乳糖苷酶A）和1/20（酸性α-葡萄糖苷酶），因此获得了相对较高的信噪比，野生型与突变型酶之间具有良好的分辨度。需要注意的是，由于酸性α-葡萄糖苷酶的活性比α-半乳糖苷酶A低一个数量级，因此在酶活性检测中两种酶所用的总蛋白量不同（分别为0.5和5 µg）。

如上所述，检测参数常常存在争议，因为许多实验室已开发出各自的检测方法用于研究溶酶体糖苷酶。这些系统在细胞类型、质粒-载体设计、培养条件以及药物暴露时间等方面可能存在差异，仅举几例。近期发表的一项关于法布里病的荟.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
QuikChange II XL 定点突变试剂盒	Stratagene, La Jolla, CA, USA	#200522
引物 GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
引物 BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
胰蛋白胨	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8952.1
酵母提取物	Merck, Darmstadt, Germany	103,753
氯化钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,064,041,000
氯化钾	Merck, Darmstadt, Germany	1,049,360,500
MgCl2 × 6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,058,330,250
D (+)-葡萄糖一水合物	Merck, Darmstadt, Germany	1,083,422,500
氢氧化钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,064,980,500
甘氨酸	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3908.2
柠檬酸	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X863.3
磷酸氢二钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,065,860,500
乙酸钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,062,640,050
冰乙酸	Sigma Aldrich, Munich, Germany	A6283
LB 琼脂	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X969.2
LB 培养基	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X968.2
Zyppy 质粒小提试剂盒	ZymoResearch, Freiburg, Germany	D4020
QIAfilter 质粒中提试剂盒	Qiagen, Hilden, Germany	12245
HEK293H 细胞系	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11631-017
Dulbecco´s 改良伊格尔培养基	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	31966-047
HyClone 胎牛血清	GE Healthcare, South Logan, Utah, USA	SV30160.03
青霉素/链霉素	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15140-122
CELLSTAR 标准细胞培养瓶，Greiner Bio One	VWR International GmbH, Hannover, Germany	82050-854
细胞培养板（24 孔）	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	831,836
Cellstar 96 孔板	Greiner bio one, Frickenhausen, Germany	655185
SafeSeal 反应管，1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72,706
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11668-019
1-脱氧半乳糖基吡啶醇盐酸盐	Sigma Aldrich, Munich, Germany	D9641
1-脱氧半乳糖基吡啶醇盐酸盐	Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada	D236500
1-脱氧野尻霉素	Sigma Aldrich, Munich, Germany	D9305
PBS Dulbecco，不含钙，不含镁	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，酚红	Thermo Scientific, Braunschweig, Germany	25300054
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific, Braunschweig, Germany	23225
4-甲基伞形酮	Sigma Aldrich, Munich, Germany	M1381
4-甲基伞形基 α-D-半乳吡喃糖苷	Sigma Aldrich, Munich, Germany	M7633
4-甲基伞形基 α-D-葡萄吡喃糖苷	Sigma Aldrich, Munich, Germany	M9766
名称	公司	目录编号	备注
设备
孵育器 T6 型	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	n.a.
Luminous Plate Gr. 2 E	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P265.1
3130 xl 基因分析仪	Applied Biosystems, Darmstadt, Germany	n.a.
GFL-3032 细菌摇床	GFL, Burgwedel, Germany	n.a.
Avanti J-25 离心机	Beckman/Coulter, Krefeld, Germany	n.a.
Ultraspec 3100 pro 分光光度计	Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom	n.a.
水套式培养箱	Binder, Tuttlingen, Germany	n.a.
Vortex Genie 1 触摸混匀器	Scientific Industries, Bohemia, NY, USA	n.a.
Z 233 MK-2 制冷微量离心机	Hermle, Tuttlingen, Germany	n.a.
LaboStar 超纯水装置	Siemens, Berlin, Germany	n.a.
Thermo Shaker PST-60HL-4 旋转摇床	Biosan, Riga, Latvia	n.a.
Tecan GENios 酶标仪	Tecan, Männedorf, Switzerland	n.a.
HI 223 微处理器 pH 计	HANNA Instruments, Arvore, Portugal	n.a.
CASY 细胞计数与分析系统 型号 TT	Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
名称	公司	目录编号	备注
软件
Magellan 数据分析软件 v6.6	Tecan, Männedorf, Switzerland	n.a.
GraphPad Prism 5.04	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA	n.a.
Microsoft Office 2010	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	n.a.
BioEdit 序列比对编辑器，V7.0.1	http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html	n.a.
缩写
frw = 正向；rev = 反向
n.a. = 不适用