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方法文章

体外酶活性检测用于评估法布里病和庞贝病对药物伴侣治疗的反应性

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DOI：

10.3791/56550

⸱

2017年12月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Albrecht-Kossel-Institute, University Rostock Medical Center, 2Department of Biology, University Federico II, 3Centogene AG

本文内容

摘要

目前需要使一类新型“孤儿药”——药理学伴侣药物的临床前检测具有可重复性、快速且高效。我们开发了一种简单、高度标准化且用途广泛的基于细胞培养的检测方法，可用于筛选合适的患者以及新的药理学伴侣药物。

摘要

使用个体化医学治疗溶酶体贮积症（LSDs）等罕见单基因疾病时，面临临床试验设计复杂、成本高昂以及患者数量稀少等挑战。大多数LSDs涉及数百种突变等位基因。这些疾病通常根据严重程度分为2至3种不同的临床类型。此外，对基因型进行分子表征有助于预测临床结局并指导患者管理。因此，我们开发了一种基于HEK293H细胞的简单细胞培养检测方法，该细胞异源过表达在法布里病和庞贝病中发现的突变。类似的方法最近已被用作法布里病中适用于药物伴侣治疗（PCT）突变的临床前检测手段。本文描述了一种改进的细胞培养检测方法，可快速评估法布里病和庞贝病中等位基因变异的表型，从而识别适合接受PCT的患者，并可能促进新型药物伴侣分子的开发。

引言

已有十余种溶酶体贮积症（LSDs）被证实与糖苷酶功能障碍相关，其病因是基因发生原发性突变。在法布里病（OMIM #301500）和庞贝病（OMIM #232300）中，分别已报道超过500种和200种错义突变1,2,3，约占全部突变总数的60%。目前仍在不断发现大量新的基因变异，其中许多变异的临床意义尚不明确。大量生化研究表明，在法布里病中，某些基因型并不会导致GLA基因（OMIM *300644）完全丧失功能，而是使相应的酶无法达到热力学上有利的折叠构象4。这会导致该酶在内质网中滞留并过早降解，尽管其本身具有功能活性。在其他溶酶体贮积症（包括庞贝病）中也得出了类似的结论5。此外，对酶变异体的分子特征分析有助于在诊断时对突变进行临床解读6，提示溶酶体贮积症的进展过程取决于突变的性质，具有个体差异性。因此，传统上将疾病分为2至3种临床类型的做法应重新评估，以优化临床咨询和治疗决策的流程。

目前这两种疾病均有酶替代疗法（ERT）可供使用。然而，ERT 在某些受累组织或器官（如大脑和骨骼肌）中的疗效有限。此外，ERT 可能引发免疫原性反应，从而损害其治疗效果。药理学伴侣分子（PCs）为携带所谓“响应性突变”的患者提供了一种颇具吸引力的替代治疗方案。PCs 可作为分子支架，促进蛋白质正确折叠与稳定，从而防止酶在内质网（ER）中滞留及其相关的降解过程。此外，PCs 可通过口服给药，并且有可能穿过血脑屏障。因此，对于特定基因型的患者，PC 治疗（PCT）可能是一种更为可行的治疗选择。有关 PCs 在溶酶体贮积症（LSDs）中应用的全面综述，请参阅 Parenti7 所撰写的优秀综述文章。

数百种致病性突变等位基因的发现对临床前药物测试提出了挑战，并要求建立一种简单、快速且高度标准化的评估方法，以筛选适合个体化医疗的患者。为了评估溶酶体贮积症（LSD）基因突变的有害效应，并检测候选突变以预测适合进行底物减少疗法（PCT）的患者，研究人员开发了一种在HEK293H细胞中高度标准化的过表达系统，该系统可实现快速且可靠的酶活性测定。此前已有类似过表达系统的报道，用于法布里病和庞贝病的研究，所用细胞包括COS-78,9,10,11、HeLa细胞12或HEK29313,14,15,16细胞，针对的是糖苷酶基因。

一种非常相似的方法甚至已被申请为专利，即“"预测药理学伴侣治疗疾病反应的方法"17”，表明能够整合到临床实践中的细胞培养系统具有重要意义。

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方案

1. 突变型 pcDNA3.1/GLA 和 pcDNA3.1/GAA 载体的构建

注意：此前已有报道关于GLA和GAA编码序列（cds）的克隆策略15,18。

  1. 利用定点突变技术进行定点突变
    1. 使用参考序列 NM_000169.2 和 NM_000152.4 作为定点突变的模板 GLA 和 GAA 基因。向商业供应商订购一组高纯度、无盐的引物（25-37 个碱基），其正向和反向引物在序列中央位置分别携带一种相应的序列修饰，以单独引入突变。使用免费的引物设计工具辅助引物设计。19.
    2. 对于反应体系，使用制造商提供的反应溶液和PCR条件的标准方案。
      1. 将5 µL 10x反应缓冲液、10 ng双链模板质粒DNA（pcDNA3.1/GLA或pcDNA3.1/GAA）、每种引物125 ng、1 µL提供的dNTP混合物、3 µL DMSO试剂加入适量去离子水中，使终体积为50 µL。最后加入2.5 U DNA聚合酶，用移液器吹打混匀。设置无引物样本作为阴性对照。
    3. 使用以下程序开始PCR：第一步：95 °C 预变性1 min；第二步：95 °C 变性50 s；第三步：60 °C 退火50 s；第四步：68 °C 延伸8 min；重复第二至第四步18个循环；第五步：68 °C 最终延伸10 min。
      1. PCR结束后，加入1 µL的 DpnI限制性内切酶（10 U/µL），并将反应管在37 °C进一步孵育1 h。
  2. 目标克隆的转化与筛选
    1. 按照制造商的说明转化一份超感受态细胞。使用 SOC 培养基（胰蛋白胨 2% (w/v)，酵母提取物 0.5% (w/v)，NaCl 10 mM，KCl 2.5 mM，121 °C 灭菌，然后加入经无菌滤膜过滤的 MgCl₂ 溶液）2 并分别加入葡萄糖至终浓度为10和20 mM，以替代生产商提供的培养基。操作完成后，将250 µL样品突变液涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 °C培养18 h。
    2. 确保转化子的数量 >10，并且反应产生的菌落数量至少是无引物对照反应的三倍， 例如，使用发光板以方便菌落计数。然后挑取3个菌落，分别在LB肉汤培养基中制备3 mL过夜培养物。
    3. 第二天，使用标准试剂盒进行质粒制备，并利用T7（5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ）和BGHr（5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ）引物通过标准Sanger测序方法分析全长序列。
    4. 使用合适的分子生物学工具分析序列。当检测到预期突变，且与 NM_000169.2（α-半乳糖苷酶 A）或 NM_000152.4（酸性 α-葡萄糖苷酶）相比未发现其他序列异常时，选择该克隆进行转染级质粒纯化。
    5. 使用分光光度计测量吸光度以确定DNA的纯度。
      注意：仅允许使用产生质粒纯度达到260/280吸光度比值符合要求的制备方法 >1.8 用于细胞培养实验。

2. HEK293H 细胞的培养

  1. 将HEK293H细胞培养于含高糖（4.5 g/L）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。将细胞置于37 °C、5% CO2的水套式培养箱中培养。
  2. 将细胞培养至密度达80–90%。
  3. 吸除培养基，用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
  4. 加入0.05%胰蛋白酶-EDTA进行传代，于37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。
  5. 按1:15比例将细胞分种至新鲜培养基中，并接种于新的T75培养瓶以维持永久培养。请勿使用传代次数超过25代的细胞。

3. pcDNA3.1/GLA 和 pcDNA3.1/GAA 质粒转染及 HEK293H 细胞处理

  1. 转染前24 h，用含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS缓冲液洗涤T75细胞培养瓶中的HEK293H细胞一次2+，Mg2+. 按照上述方法使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，并接种1.5 × 105 使用不含抗生素、添加10% FBS的500 µL DMEM培养基，将细胞接种于24孔培养板的孔腔中。
  2. 根据制造商说明书进行转染操作。通常，将1 µg质粒DNA与2.5 µL转染试剂在100 µL无血清DMEM中混合，室温孵育20分钟，随后逐滴加入细胞中。
  3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时后，移除含有转染试剂的培养基。2 加入500 µL新鲜DMEM培养基（含10% FBS/1%青霉素-链霉素）。
    注意：在此步骤中，可根据需要向培养基中添加1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride（DGJ）或1-Deoxynojirimycin Hydrochloride（DNJ）（使用10 mM的水溶液储存液） 以获得终浓度为 20 µM 的 DGJ 和 DNJ。质粒转染 42 小时后，加入新鲜的 DGJ 或 DNJ。

4. 细胞收获及α-半乳糖苷酶A或酸性α-葡萄糖苷酶活性测定

  1. 细胞收获
    1. 在收获当天，将细胞从培养箱中取出，并吸除培养基。用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 轻柔洗涤细胞 2 次。
      注意：此步骤至关重要，因为 DGJ 和 DNJ 分别是 α-半乳糖苷酶和 α-葡萄糖苷酶的强效抑制剂，任何残留都会使检测结果无效。
    2. 直接向细胞表面加入 200 µL 去离子水。将细胞从培养板上冲洗下来，并转移至 1.5 mL 反应管中。
  2. 通过冻融法进行细胞裂解
    1. 将样品放入合适的泡沫架中，涡旋振荡 5 秒以提高裂解效率。将样品交替置于液氮中 10 秒，然后放入室温水浴中直至完全解冻（约 5 分钟）。
    2. 重复此过程 5 次，随后在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟。保留上清液，并用移液器转移至新的反应管中。
  3. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度
    1. 为每个样品准备一支新试管，加入 40 µL 去离子 H2O，再加入 10 µL 样品。短暂涡旋混匀后，取 10 µL 加入 96 孔板的孔中（每个样品设三个复孔）。将 2 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）储备液用去离子 H2O 按以下比例稀释，以制备标准曲线：50 µL H2O/50 µL BSA；60 µL H2O/40 µL BSA；70 µL H2O/30 µL BSA；80 µL H2O/20 µL BSA；90 µL H2O/10 µL BSA；100 µL H2O。
    2. 加入 200 µL BCA 试剂（试剂 A 与试剂 B 按 50:1 比例混合）启动反应，在 37 °C 黑暗条件下于旋转摇床（300 rpm）上轻微振荡孵育 1 小时。使用酶标仪在 560 nm 处测定吸光度。
      注意：样品中蛋白浓度通常为每 µL 含 1 至 1.5 µg。
  4. 使用人工 4-甲基伞形酮基底物（4-MUG）测定酶活性
    1. 根据计算结果稀释各样品，移取至新的 1.5 mL 反应管中，使终浓度为 0.05 µg 蛋白/µL（用于 α-半乳糖苷酶 A）或 0.5 µg 蛋白/µL（用于酸性 α-葡萄糖苷酶）。再次涡旋振荡 5 秒，取 10 µL 稀释液加入 96 孔板中（每个样品设两个复孔）。
    2. 加入 20 µL 相应的底物溶液以启动反应：
      α-半乳糖苷酶 A 检测：2 mM 4-甲基伞形酮基-α-D-半乳吡喃糖苷（4-MU-gal）溶于 0.06 M 磷酸柠檬酸缓冲液，pH 4.7。
      酸性 α-葡萄糖苷酶检测：2 mM 4-甲基伞形酮基 α-D-葡萄吡喃糖苷（4-MU-glu）溶于 0.025 M 醋酸钠缓冲液，pH 4.0。
    3. 将酶反应体系在 37 °C 黑暗条件下于旋转摇床（300 rpm）上轻微振荡孵育 1 小时。加入 200 µL 1.0 M、pH 10.5 的甘氨酸-NaOH 缓冲液终止反应。
    4. 使用 0.01 mg/mL 的 4-甲基伞形酮（4-MU）储备液制备标准曲线，具体如下：
      100 µL H2O/不加 4-MU；80 µL H2O/20 µL 4-MU；60 µL H2O/40 µL 4-MU；40 µL H2O/60 µL 4-MU；20 µL H2O/80 µL 4-MU；不加 H2O/100 µL 4-MU。将各稀释液 10 µL 加入 96 孔板中（每个设两个复孔），并向每孔加入 200 µL 1.0 M 甘氨酸-NaOH 缓冲液，以调整总体积和 pH。
    5. 使用配备适当滤光片组的荧光酶标仪测定酶活性，并使用相应设备的分析软件处理数据。
      注意：两种 4-MUG 底物在 α-半乳糖苷酶 A 或酸性 α-葡萄糖苷酶作用下均会生成 4-MU。释放的 4-MU 是一种荧光物质，可在激发波长 360 nm、发射波长 465 nm 条件下使用微量板荧光酶标仪进行检测。

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结果

诱变实验步骤
为了评估GLA基因诱变的效率，将所获得的突变归类至以下类别之一。该诱变方法显示，约66.5%的GLA突变可在第一次尝试中获得，另有25%可在略微调整后的第二次PCR中获得。

类别1：首次尝试的定点突变PCR即有效。

类别2：首次诱变PCR失败（平板上无菌落，未插入突变）；通过将退火温度提高至68 °C并使用相同的引物组重复实验，获得了成功。

类别3：需要付出更多努力才能获得目标克隆（例如，通常需要设计一套或多套新的引物。

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讨论

本文所述方案可为遗传性代谢性溶酶体疾病的酶损伤评估提供可靠的结果。本论文是对先前发表方案的修订。15最关键的修改涉及严谨性（即，在突变型载体构建准备过程中），细胞培养方案的标准化（即，HEK293H细胞的培养与转染条件），以及较高的实验重复次数（至少5次），这些因素均显著提高了结果的可重复性。总体而言，两个靶基因均易于进行诱变操作，且可并行构建多种突变体。考虑到HEK293H细胞内源性酶活性极低，仅为过表达的野生型基因活性的1/50（α-半乳糖苷酶A）和1/20（酸性α-葡萄糖苷酶），因此获得了相对较高的信噪比，野生型与突变型酶之间具有良好的分辨度。需要注意的是，由于酸性α-葡萄糖苷酶的活性比α-半乳糖苷酶A低一个数量级，因此在酶活性检测中两种酶所用的总蛋白量不同（分别为0.5和5 µg）。

如上所述，检测参数常常存在争议，因为许多实验室已开发出各自的检测方法用于研究溶酶体糖苷酶。这些系统在细胞类型、质粒-载体设计、培养条件以及药物暴露时间等方面可能存在差异，仅举几例。近期发表的一项关于法布里病的荟...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢 Mandy Loebert 和 Tina Czajka 提供出色的技术支持。我们感谢 Flora Luo（哈佛医学院，美国马萨诸塞州波士顿）在语言润色方面的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
QuikChange II XL 定点突变试剂盒 Stratagene, La Jolla, CA, USA#200522
引物 GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
引物 BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.
胰蛋白胨Carl Roth, Karlsruhe, Germany8952.1
酵母提取物Merck, Darmstadt, Germany103,753
氯化钠Merck, Darmstadt, Germany1,064,041,000
氯化钾Merck, Darmstadt, Germany1,049,360,500
MgCl2 × 6H2OMerck, Darmstadt, Germany1,058,330,250
D (+)-葡萄糖一水合物Merck, Darmstadt, Germany1,083,422,500
氢氧化钠Merck, Darmstadt, Germany1,064,980,500
甘氨酸Carl Roth, Karlsruhe, Germany3908.2
柠檬酸Carl Roth, Karlsruhe, GermanyX863.3
磷酸氢二钠Merck, Darmstadt, Germany1,065,860,500
乙酸钠Merck, Darmstadt, Germany1,062,640,050
冰乙酸Sigma Aldrich, Munich, GermanyA6283
LB 琼脂Carl Roth, Karlsruhe, GermanyX969.2
LB 培养基Carl Roth, Karlsruhe, GermanyX968.2
Zyppy 质粒小提试剂盒ZymoResearch, Freiburg, GermanyD4020
QIAfilter 质粒中提试剂盒Qiagen, Hilden, Germany12245
HEK293H 细胞系Invitrogen, Karlsruhe, Germany11631-017 
Dulbecco´s 改良伊格尔培养基 Invitrogen, Karlsruhe, Germany31966-047
HyClone 胎牛血清 GE Healthcare, South Logan, Utah, USASV30160.03
青霉素/链霉素Invitrogen, Karlsruhe, Germany15140-122
CELLSTAR 标准细胞培养瓶，Greiner Bio OneVWR International GmbH, Hannover, Germany82050-854
细胞培养板（24 孔）Sarstedt, Nümbrecht, Germany831,836
Cellstar 96 孔板Greiner bio one, Frickenhausen, Germany655185
SafeSeal 反应管，1.5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany72,706
Lipofectamine 2000Invitrogen, Karlsruhe, Germany11668-019
1-脱氧半乳糖基吡啶醇盐酸盐 Sigma Aldrich, Munich, GermanyD9641
1-脱氧半乳糖基吡啶醇盐酸盐 Toronto Research Chemicals, Toronto, CanadaD236500
1-脱氧野尻霉素 Sigma Aldrich, Munich, GermanyD9305
PBS Dulbecco，不含钙，不含镁Biochrom, Berlin, GermanyL 1825
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，酚红Thermo Scientific, Braunschweig, Germany25300054
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific, Braunschweig, Germany23225
4-甲基伞形酮Sigma Aldrich, Munich, GermanyM1381
4-甲基伞形基 α-D-半乳吡喃糖苷Sigma Aldrich, Munich, GermanyM7633
4-甲基伞形基 α-D-葡萄吡喃糖苷Sigma Aldrich, Munich, GermanyM9766
名称公司目录编号备注
设备
孵育器 T6 型Heraeus Instruments, Hanau, Germanyn.a.
Luminous Plate Gr. 2 ECarl Roth, Karlsruhe, GermanyP265.1
3130 xl 基因分析仪 Applied Biosystems, Darmstadt, Germanyn.a.
GFL-3032 细菌摇床GFL, Burgwedel, Germany n.a.
Avanti J-25 离心机Beckman/Coulter, Krefeld, Germanyn.a.
Ultraspec 3100 pro 分光光度计Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdomn.a.
水套式培养箱 Binder, Tuttlingen, Germanyn.a.
Vortex Genie 1 触摸混匀器Scientific Industries, Bohemia, NY, USAn.a.
Z 233 MK-2 制冷微量离心机Hermle, Tuttlingen, Germany n.a.
LaboStar 超纯水装置Siemens, Berlin, Germanyn.a.
Thermo Shaker PST-60HL-4 旋转摇床Biosan, Riga, Latvian.a.
Tecan GENios 酶标仪Tecan, Männedorf, Switzerlandn.a.
HI 223 微处理器 pH 计HANNA Instruments, Arvore, Portugaln.a.
CASY
细胞计数与分析系统
型号 TT		Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
名称公司目录编号备注
软件
Magellan 数据分析软件 v6.6Tecan, Männedorf, Switzerlandn.a.
GraphPad Prism 5.04GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USAn.a.
Microsoft Office 2010Microsoft Corporation, Redmond, WA, USAn.a.
BioEdit 序列比对编辑器，V7.0.1http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.htmln.a.
缩写
frw = 正向；rev = 反向
n.a. = 不适用

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