方法文章

无透镜视频显微术在黏附细胞培养动态定量分析中的研究

DOI：

10.3791/56580

⸱

2018年2月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

无透镜的视频显微镜使我们能够在孵化器内直接监测细胞培养。在这里, 我们描述了用于获取和分析2.7 天长时间获取培养的 HeLa 细胞的完整协议, 导致一个数据集 2.2 x 106测量单个细胞形态学和10584细胞周期轨道。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们表明, 无透镜的视频显微镜, 使我们能够同时捕获数以千计的细胞的动力学, 直接在孵化器内, 并有可能监测和量化的单个细胞沿几个细胞周期。我们描述了用于监视和量化 HeLa 细胞培养2.7 天的完整协议。首先, 用无透镜的视频显微镜进行细胞培养, 然后在四步过程中分析数据: 多波长全息重建、细胞跟踪、细胞分割和细胞分裂检测算法.因此, 我们表明, 有可能收集具有超过1万个细胞周期轨道和超过 2 x 106细胞形态学测量的数据集。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在几个细胞周期内监测培养的哺乳动物细胞, 准确测量细胞大小和细胞干质量是一项具有挑战性的任务。几个无标签的光学技术能够执行此任务1,2: 移相干涉测量3, 数字全息显微镜 (DHM)4,5,6,7, quadriwave 横向剪切干涉测量8,9和定量相断层扫描10,11。这些方法使人们对哺乳动物细胞周期的认识有了许多新的见解。然而他们很少加上自动细胞追踪算法, 并且他们的吞吐量仍然是有限的, 当测量细胞质量轨道1 (N < 20 分别在3,4,5,6). 因此, 需要用一种新的光学方法来测量大统计量 (N > 1000) 的细胞质量轨迹。

在本文中, 我们展示了无透镜视频显微镜的能力, 同时在孵化室内直接图像数以千计的细胞, 然后量化单个细胞指标沿数以千计的单个细胞周期轨道。无透镜显微镜是一种定量的相位成像技术, 它允许在一个非常大的视野 (通常数十毫米2, 这里29.4 毫米2)12,13 中获取密被包装细胞的相位图像. ,14,15。在单个单元格级别确定了几个度量值,例如、单元格区域、单元格的干质量、单元格粗细、单元格主轴长度和单元格长宽比12、15、每个图像。然后, 通过应用单元跟踪算法, 可以将这些功能绘制为每个单元格, 作为实验时间14、15的函数。此外, 通过检测细胞内的细胞分裂的发生, 有可能提取其他重要信息, 如初始细胞干质量 (刚刚细胞分裂), 最终细胞干质量 (刚刚细胞分裂) 和细胞周期持续时间,即, 两个连续的分区15之间的间隔。所有这些测量都可以计算出非常好的统计数据 (N > 1000), 因为大的视野通常允许分析200到1万细胞在一个单一的无透镜获取。

为了解释这种基于无透镜视频显微镜的方法, 我们描述了2.7 天内对 HeLa 细胞培养进行监测和量化的协议。数据分析是基于多波长全息重建、细胞跟踪、细胞分割和细胞分裂算法的四步过程。这里表明, 空间分辨率和相对较快的帧速率 (每10分钟一次采集) 获得与此无透镜视频显微镜设置兼容标准的细胞跟踪算法。对这个数据集的完整分析结果是在整个细胞周期内测量10584个细胞轨道。

总之, 无透镜视频显微镜是一个强大的工具, 自动监测数以千计的未标记, 不同步, 和未修改的细胞, 每个实验;在多个单元周期中跟踪每个单元格。因此, 我们的测量提供了几个细胞参数的平均值, 但更重要的是, 细胞间的变异超过了大量的细胞。

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方案

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1. 细胞培养监测采集

  1. 在 DMEM + 谷氨酰胺 (例如, GlutaMAX) 中生长 HeLa 细胞, 辅以 10% (v/v) 热灭活胎小牛血清和1% 青霉素和链霉素。
  2. 涂层6井玻璃底部培养板与纤维连接蛋白 (25 µg/毫升) 为 1 h。然后每个井种子 2 x 104单元格。
  3. 在购置期间, 每3天更换一次培养基。
  4. 对于延时采集, 使用视频无透镜显微镜 (商用)。
    注: 这是基于无透镜的计算成像技术, 如欧兹坎et . 所述。16 , 它被修改为在孵化器中以37摄氏度12、15的控制温度执行连续监视。它具有一个互补的金属氧化物半导体 (CMOS) 图像传感器, 像素间距为1.67 µm, 成像面积为 6.4 x 4.6 毫米2。多波长照明由一个多芯片组件发光二极管 (led) 装置提供, 它提供红色、绿色和蓝色照明。波长分别为636、521和 452 nm, 其光谱带宽分别为25、45和 25 nm。红绿蓝 (RGB) 发光二极管位于150µm 针孔的上方, 距离细胞约5厘米。测量接近 LED 的光功率低至10µW 在每个波长和照明时间仅一秒每承购。因此, 在无透镜的视镜下观察细胞培养时, 不会出现光毒性问题。
  5. 将单元格区域性容器与 CMOS 传感器 (图 1) 联系在一起。在底部使用带有玻璃盖玻片的容器, 这对无透镜采集的质量很重要。还可以使用塑料容器, 但由于这些容器的光学质量较差, 无透镜采集将被降级。
  6. 使用采集软件 (商用) 控制视频无透镜显微镜, 既可实现定时采集, 又可进行全息重建。用户在软件界面中需要输入的参数包括帧速率、实验持续时间和细胞培养类型, 即黏附细胞或漂浮细胞。
  7. 设置采集软件的输入参数。每10分钟将帧速率设置为一次获取, 并将单元格区域性类型设置为 "粘附"。
    注意: 每10分钟一次获取帧速率是一个很好的折衷, 因为它确保了可靠的单元跟踪, 而结果数据集的大小仍然是合理的。最快的帧速率可实现与这种无透镜显微镜设置是每5分钟一次获得。进一步增加帧率导致 CMOS 传感器过度加热, 这会影响细胞在培养中的生存能力。
  8. 启动延时采集, 全息重建算法 (商用) 将自动处理无透镜采集, 获得细胞培养的相位图像。全息重建算法是基于多波长相位检索算法17 , 并提供一个 RGB 重建相图像的范围内的每一个单一的单元格 (π, + π) 在一个大视野的29.4 毫米2。无透镜在线全息术的原理是在 z=0 上用平面波 (在正常化后的振幅 1) 来照亮一个稀薄的样本, 并在 CMOS 传感器上检测随后的衍射强度图像在短距离 z = z, 通常为1毫米后,示例.在我们的设置中, 光照按顺序切换到3波长 (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) 来测量同一样本的三衍射模式。

2. 细胞培养数据分析

  1. 对于单元跟踪, 使用 Trackmate 算法, 一个开源斐济插件, 用于自动跟踪单个粒子18。首先, 将全部的时间推移捕获加载到斐济 (加载图像序列命令)。由于数据集的大小很大, 通常 400 RGB 帧为 29.7 Mb, 因此以8位格式加载它们会更快。接下来, Trackmate 斐济插件引导用户通过细胞跟踪算法的几个阶段, 即单元检测阶段、单元跟踪阶段以及用于单元检测和计算轨道的几个滤镜。在每个阶段, 配置算法并立即显示结果, 以便在必要时可以轻松地来回导航以重新调整设置。Trackmate 接口的各种菜单显示在图 2中, 其中的实际设置用于 HeLa 单元实验。
  2. 将采集软件的输入参数设置为如下 (请参见图 2)。将估计的 blob 直径设置为15像素, 探测器阈值为 0.25, 链接最大距离为15像素, 间隙闭合最大距离为15像素, 轨道中的点数为3.5。
    注意: 这些设置明显不同于一个实验, 特别是与单元格大小对应的 "估计 blob 直径" (这里给出的像素为1.67 µm)。同样的评论也适用于 "链接最大距离", 它解释了在两个连续帧 (这里给出的像素为1.67 µm) 的最大距离。它的最佳值取决于细胞的运动, 也依赖于细胞密度。
  3. 在单元格跟踪过程的末尾, 以三个文本文件 ("分析" 按钮) 的形式生成结果, 请参见图 2)。最有用的文件, 名为 "轨道统计" 中的 "点", 由一个表列出所有检测到的单元格, 它们各自 (x、y) 位置在获取、帧号和跟踪编号中。根据这些数据, 使用专用算法执行单元格分割和检测单元划分 (请参阅辅助代码文件)。另外两个文件被命名为 "跟踪统计信息" 和 "跟踪统计信息" 中的 "链接", 包括处理轨道的所有结果,例如跟踪工期、检测到的间隙数、跟踪初始帧等。
  4. 使用单元格分割算法 (见补充码文件), 自动提取几个描述细胞形态学从重建阶段图像的指标。这些指标是细胞表面积, 细胞主轴长度 (l), 细胞小轴长度 (l) 和细胞长宽比 (l/升)。从无透镜显微镜中恢复的相位与前述15所讨论的试样层的密度和厚度成正比。
  5. 除了细胞的形态学特征外, 从重建阶段13,19,20提取定量细胞干质量 (CDM) 测量结果
    figure-protocol-1情商 (1)
    其中φ (x, y) 是重构的相移19, λ波长和α = 1.8 x 10-4 m3/千克与折射率变化有关的特定折射率1, 19。
  6. 用估计细胞折射率与培养基的差异来评估细胞厚度。20给出了单元格厚度h(x、y) 和测量的相移之间的关系:
    figure-protocol-2情商 (2.1)
    figure-protocol-3情商 (2.2)
    使用Δn(x,y) = n单元格(x,y)- n中 (x,y), 单元格和区域性媒体之间的折射率差。在下面, 假定Δn = 0.025的常量值, 这是从在 HeLa 细胞核 (n = 1.35511) 和磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 培养基 (n = 1.33) 中测量的折射率估计出来的。虽然细胞厚度值只是指示性的, 因为它是基于一个假设, 它的相对变化是有意义的, 可以利用来检测分裂细胞。
  7. 使用专用算法 (请参阅辅助代码文件) 检测细胞分裂的发生, 然后提取与检测到的细胞分裂相关联的单元轨道, 以检测细胞分裂, 测量厚度大于8µm 的单元格。首先确定, 然后检查一个新的细胞是否在空间和时间紧密地出现。这样, 细胞分裂的检测依赖于两个健壮的标准。可替代的和更精细的细胞分裂检测方法可以应用到 lensfree 时间推移获取21,22,23。

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结果

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对于全息重建过程, 光场由标量字段a figure-results-1描述 (其中是从样本到距离z的平面上的a的复数值, 以及侧面位置和波长λ). figure-results-2光传播是由惠更斯-菲涅尔理论建模的, 它提供了一个传递者内核. figure-results-3 因此, 探测器平面上的场振幅, Az 与光振幅0 的关系如下:
figure-results-4即

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本文中, 我们表明, 无透镜的视频显微镜可以在孵化器内使用, 以捕获数以千计的细胞的动力学。为了描述整个方法, 我们解释了如何用标准的细胞跟踪算法来分析2.7 天的 HeLa 细胞在培养中的时间推移获取。结果是一个具有 2.2 x 106单元格测量和10584个单元周期轨道的数据集。这项收购是对 Hela 细胞的一种文化进行的, 细胞间距离相对较大 (细胞密度 < 500 细胞/毫米2), 细胞形态学可以与圆盘近似。这两项功能便于应用自动单元跟踪分析, 从而可以收集如此大的数据集。其他细胞系较小的细胞间距离或更复杂的形貌将更难以跟踪和后续数据集将更小。

我们认为, 这种方法是有趣的许多研究, 例如细胞增殖和细胞大小的研究。后者是基础生物学研究的一个重要领域, 许多问题仍未得到解答, 如 Ginzberg et . 所述的很好的讨论。29. 在这项工作中提出的议定书因而提供了一种手段来衡量细胞增殖研究所需的重要指标, 即细胞周期持续时间、细胞干质量、末端与周期开始和细胞之间...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可承认的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cytonote 无透镜视频显微镜 Iprasense
Horus 采集软件Iprasense
6 孔玻璃底培养板MatTek 公司零件号：P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX 培养基 Gibco
热灭活胎牛血清 Eurobio
青霉素和链霉素 Gibco
纤连蛋白 Sigma Aldrich
Matlab，图像处理工具箱 数学工厂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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