无透镜视频显微技术用于贴壁细胞培养的动态定量分析

摘要

无透镜视频显微技术使我们能够直接在培养箱内监测细胞培养物。本文介绍了获取和分析长达2.7天的培养HeLa细胞数据的完整方案，最终获得包含2.2×10⁶次单个细胞形态测量结果和10584条细胞周期轨迹的数据集。

摘要

在此，我们证明了无透镜视频显微技术能够使我们在培养箱内部直接同时捕获数千个细胞的动力学行为，并且可以对单个细胞在多个细胞周期中的行为进行监测和定量分析。我们描述了用于监测和定量HeLa细胞培养长达2.7天的完整实验方案。首先，使用无透镜视频显微镜进行细胞培养的图像采集，随后数据通过四个步骤进行分析：多波长全息重建、细胞追踪、细胞分割以及细胞分裂检测算法。结果表明，我们能够获得包含超过10,000条细胞周期轨迹以及超过2 × 10⁶次细胞形态学测量的数据集。

引言

在整个多个细胞周期中监测培养的哺乳动物细胞，并准确测量细胞大小和细胞干重，是一项具有挑战性的任务。多种无标记光学技术能够完成这一任务^1,2：相移干涉测量法³、数字全息显微技术（DHM）^4,5,6,7、四波横向剪切干涉测量法^8,9以及定量相位断层成像技术^10,11。这些方法已为理解哺乳动物细胞的细胞周期带来了许多新的认识。然而，这些技术很少与自动细胞追踪算法相结合，在测量细胞质量轨迹时通量仍然有限¹（分别在^3,4,5,

方案

1. 细胞培养监测采集

1. 在 DMEM + 谷氨酰胺中培养 HeLa 细胞例如，GlutaMAX）培养基，添加10%（v/v）热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
2. 用纤连蛋白包被6孔玻璃底培养板（25 µg/mL）中孵育 1 小时。然后接种 2 x 10⁴ 每孔细胞数
3. 在获取过程中，每3天更换一次培养基。
4. 对于延时成像采集，使用视频无透镜显微镜（可商业获得）。
   注意：本方法基于 Ozcan 所描述的无透镜计算成像技术 等¹⁶ 在受控温度的培养箱中进行连续监测的修改版本 37 °C^12,15采用互补金属氧化物半导体（CMOS）图像传感器，其像素间距为 1.67 µm 成像区域为6.4 x 4.6 mm². 多波长照明由多芯片发光二极管（LED）装置提供，可发出红、绿、蓝三色光。波长峰值分别位于636 nm、521 nm和452 nm，光谱带宽分别为25 nm、45 nm和25 nm。红-绿-蓝（RGB）LED位于上方 150 µm 距离细胞约5 cm处的针孔。靠近LED处测得的光功率低至 10 µW 在每个波长下，每次采集....

结果

在全息重建过程中，光场由标量场 A 描述（其中 表示距离样品为 z 的平面上、横向位置为 、波长为 λ 时 A 的复数值）。光的传播由惠更斯-菲涅耳理论建模，该理论提供了一个传播核函数

讨论

本文中，我们展示了可在培养箱内使用无透镜视频显微技术，以捕捉数千个细胞的动力学行为。为了描述整体方法，我们说明了如何利用标准的细胞追踪算法分析培养中HeLa细胞长达2.7天的延时成像数据。最终获得的数据集包含2.2×10⁶次细胞测量结果以及10,584条细胞周期轨迹。实验在HeLa细胞培养物上进行，细胞间距离相对较大（细胞密度<500个细胞/mm²），且细胞形态可近似为圆盘状。这两个特征有利于自动细胞追踪分析的应用，从而能够获取如此大规模的数据集。对于细胞间距离更小或形态更复杂的其他细胞系，追踪难度将增加，所获得的数据集规模也会相应减小。

我们认为，这种方法在许多研究中具有重要意义，例如细胞增殖和细胞大小相关研究。后者是基础生物学中的一个重要研究领域，仍有许多问题尚未解决，正如Ginzberg et al.²⁹在综述中所详细讨论的那样。本研究提出的方案因此提供了一种测量细胞增殖研究所需关键参数的方法，即细胞周期持续时间、细胞干重、细胞周期起始与结束时的细胞干重比值以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无透镜视频显微镜 Cytonote	Iprasense
Horus 图像采集软件	Iprasense
6 孔玻璃底培养板	MatTek corporation	货号：P06G-0-14-F
DMEM + GlutaMAX 培养基	Gibco
热灭活胎牛血清	Eurobio
青霉素和链霉素	Gibco
纤连蛋白	Sigma Aldrich
Matlab 图像处理工具箱	Mathworks