无透镜视频显微技术用于贴壁细胞培养的动态定量分析

摘要

无透镜视频显微技术使我们能够直接在培养箱内监测细胞培养物。本文介绍了获取和分析长达2.7天的培养HeLa细胞数据的完整方案，最终获得包含2.2×10⁶次单个细胞形态测量结果和10584条细胞周期轨迹的数据集。

摘要

在此，我们证明了无透镜视频显微技术能够使我们在培养箱内部直接同时捕获数千个细胞的动力学行为，并且可以对单个细胞在多个细胞周期中的行为进行监测和定量分析。我们描述了用于监测和定量HeLa细胞培养长达2.7天的完整实验方案。首先，使用无透镜视频显微镜进行细胞培养的图像采集，随后数据通过四个步骤进行分析：多波长全息重建、细胞追踪、细胞分割以及细胞分裂检测算法。结果表明，我们能够获得包含超过10,000条细胞周期轨迹以及超过2 × 10⁶次细胞形态学测量的数据集。

引言

在整个多个细胞周期中监测培养的哺乳动物细胞，并准确测量细胞大小和细胞干重，是一项具有挑战性的任务。多种无标记光学技术能够完成这一任务^1,2：相移干涉测量法³、数字全息显微技术（DHM）^4,5,6,7、四波横向剪切干涉测量法^8,9以及定量相位断层成像技术^10,11。这些方法已为理解哺乳动物细胞的细胞周期带来了许多新的认识。然而，这些技术很少与自动细胞追踪算法相结合，在测量细胞质量轨迹时通量仍然有限¹（分别在^3,4,5,6中N<20）。因此，亟需一种新型光学方法，以实现对大量细胞（N>1000）的质量轨迹进行统计学测量。

本文展示了无透镜视频显微技术能够在培养箱内直接对数千个细胞进行同时成像，并沿数千条单个细胞周期轨迹定量分析单细胞参数的能力。无透镜显微术是一种定量相位成像技术，可在非常大的视场范围内（通常为数十 mm²，本文中为 29.4 mm²）获取高密度细胞的相位图像^12,13,14,15。从每幅图像中可确定多个单细胞层面的参数，例如，细胞面积、细胞干重、细胞厚度、细胞长轴长度和细胞长宽比^12,15。随后，通过应用细胞追踪算法，这些特征可被绘制为每个单细胞随实验时间变化的函数曲线^14,15。此外，通过检测细胞轨迹中细胞分裂的发生，还可提取其他重要信息，例如初始细胞干重（细胞分裂后立即）、最终细胞干重（细胞分裂前立即）以及细胞周期持续时间，即 两次连续分裂之间的时间间隔¹⁵。由于大视场通常允许在一次无透镜成像中分析 200 至 10,000 个细胞，因此这些测量可获得统计学上非常可靠的结果（N>1000）。

为了阐述基于无透镜视频显微镜的方法，本文描述了监测和量化 HeLa 细胞培养物长达 2.7 天的实验方案。数据分析是一个包含多波长全息重建、细胞追踪、细胞分割和细胞分裂算法的四步过程。本文表明，该无透镜视频显微镜系统所获得的空间分辨率和相对较快的帧率（每 10 分钟采集一次）可与标准的细胞追踪算法兼容。对该数据集的完整分析最终获得了跨越完整细胞周期的 10,584 条细胞轨迹的测量结果。

总之，无透镜视频显微技术是一种强大的工具，可在一个实验中自动监测数千个未标记、未同步且未经修饰的细胞，并对每个细胞持续追踪多个细胞周期。因此，我们的测量不仅提供了多个细胞参数的平均值，更重要的是揭示了大量细胞群体中的细胞间变异性。

方案

1. 细胞培养监测采集

1. 在 DMEM + 谷氨酰胺（含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）培养基中培养 HeLa 细胞例如，GlutaMAX）培养基，添加10%（v/v）热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
2. 用纤连蛋白（25 µg/mL）包被6孔玻璃底培养板，孵育1小时。随后接种2 × 10⁵细胞。⁴ 每孔细胞数
3. 在培养过程中，每隔3天更换一次培养基。
4. 对于延时成像采集，使用视频无透镜显微镜（可商业获得）。
   注意：本方法基于 Ozcan 所描述的无透镜计算成像技术 等¹⁶ 在37 °C的受控温度下，于培养箱中进行连续监测的修改方案^12,15它采用互补金属氧化物半导体（CMOS）图像传感器，像素间距为1.67 µm，成像区域为6.4 × 4.6 mm²多波长照明由多芯片发光二极管（LED）装置提供，可发出红、绿、蓝三色光。其波长峰值分别位于636 nm、521 nm和452 nm，光谱带宽分别为25 nm、45 nm和25 nm。红绿蓝（RGB）LED位于一个150 µm针孔上方，距离细胞约5 cm。靠近LED处测得的各波长光功率低至10 µW，每次成像的照明时间仅为1秒。因此，在无透镜视频显微镜下观察细胞培养物时，预计不会产生光毒性问题。
5. 将细胞培养容器与CMOS传感器接触放置图1）。使用底部带有玻璃盖玻片的容器，这对无透镜成像的质量至关重要。也可使用塑料容器，但由于其光学质量较差，会导致无透镜成像质量下降。
6. 使用采集软件（商业可得）控制视频无透镜显微镜，该软件同时执行延时采集和全息重建。用户需在软件界面中输入的参数包括：帧率、实验持续时间以及细胞培养类型，即贴壁细胞或悬浮细胞。
7. 设置采集软件的输入参数。将帧率设为每10分钟采集一次，并将细胞培养类型设为“贴壁”。
   注意：每10分钟采集一帧的帧率是一个较优的折中方案，既能确保可靠的细胞追踪，又能使待分析的数据集大小保持在合理范围内。本无透镜显微成像系统可实现的最快帧率为每5分钟采集一帧。进一步提高帧率将导致CMOS传感器过度发热，可能影响培养细胞的存活率。
8. 启动延时成像采集，全息重建算法（商业可得）将自动处理无透镜采集的数据，以获得细胞培养的相位图像。该全息重建算法基于多波长相位恢复算法。¹⁷ 并在29.4 mm的大视场范围内为每个单细胞提供[-π, +π]范围内的RGB重建相位图像²无透镜同轴全息成像的原理是：使用平面波（归一化后的振幅为1）照射一个薄样品（位于 z=0 处），并在样品后方一段较短距离 z=Z（通常为 1 mm）处的 CMOS 传感器上探测其衍射强度图像。在我们的实验装置中，照明光源依次切换至 3 个波长（λ₁=0.450 µm, λ₂=0.540 µm，λ₃=0.647 µm）来测量同一样品的三个衍射图样。

2. 细胞培养数据分析

1. 用于细胞追踪时，采用 Trackmate 算法，这是一种开源的 Fiji 插件，可实现单颗粒的自动追踪¹⁸首先，将完整的时间序列图像导入Fiji（使用加载图像序列命令）。由于数据集通常较大，包含400帧RGB图像，每帧约29.7 Mb，因此以8位格式加载速度更快。接下来，TrackMate Fiji插件将引导用户完成细胞追踪算法的多个阶段，包括细胞检测阶段、细胞追踪阶段，以及对细胞检测结果和计算轨迹施加的多种滤波步骤。在每个阶段，均可配置算法参数并立即显示结果，以便必要时可轻松前后切换，调整设置。TrackMate界面的各个菜单如图所示 图2 使用HeLa细胞实验的实际设置条件。
2. 设置采集软件的输入参数如下（参见 图2将估计的斑点直径设为15像素，检测阈值设为0.25，链接最大距离设为15像素，间隙闭合最大距离设为15像素，轨迹中的斑点数量设为3.5。
   注意：这些参数设置会因实验不同而有所差异，尤其是“估计的斑点直径”，其对应于细胞大小（此处以1.67 µm为单位的像素表示）。同样，“链接最大距离”也适用此说明，该参数表示细胞在连续两帧之间移动的最大距离（此处同样以1.67 µm为单位的像素表示）。其最优值取决于细胞运动性，同时也受细胞密度的影响。
3. 细胞追踪过程结束后，以三个文本文件的形式生成结果（点击“分析”按钮，参见 图2）。最有用的文件名为“Spots in tracks statistics”，包含一个表格，列出了在采集过程中检测到的所有细胞及其对应的 (x,y) 位置、帧编号和轨迹编号。基于此数据，使用专用算法进行细胞分割并检测细胞分裂（参见补充代码文件）。另外两个文件名为“Links in tracks statistics”和“Track statistics”，包含与轨迹相关的所有结果， 例如 轨迹持续时间、检测到的间隙数量、轨迹起始帧等
4. 使用细胞分割算法（参见补充代码文件），从重建的相位图像中自动提取若干描述细胞形态的参数。这些参数包括细胞表面积（S）、细胞长轴长度（L）、细胞短轴长度（l）以及细胞长宽比（L/l）。如前所述，无透镜显微镜恢复的相位信号与样品层的密度和厚度成正比。¹⁵.
5. 除了细胞的形态特征外，还应从重建的相位图像中提取定量的细胞干重（CDM）测量值^13,19,20
    方程 (1)
   其中 φ(x,y) 是重建的相位偏移¹⁹，λ 为波长，α = 1.8 × 10^-4 m³/kg 与干质量相关的折射率特异性指数^1,19.
6. 利用细胞折射率与培养基折射率之差来估算细胞厚度。细胞厚度与折射率差之间的关系 h(x,y）且测得的相位偏移由下式给出²⁰:
    方程 (2.1)
   公式 (2.2)
   与 Δn(x,y) = n_细胞 (x,y) - n_培养基 (x,y），细胞与培养基之间折射率的差异。下文中，假设 Δ 为恒定值n = 0.025，该值是根据在HeLa细胞核中测得的折射率（n = 1.355）估算得到的¹¹）以及磷酸盐缓冲液（PBS）培养基（n=1.33）的折射率。尽管细胞厚度值仅为基于假设的参考值，但其相对变化具有意义，可用于检测分裂中的细胞。
7. 使用专用算法（参见补充代码文件）检测细胞分裂事件，并提取与所检测到的细胞分裂相关的细胞轨迹。为检测细胞分裂，首先识别测量厚度大于 8 µm 的细胞，随后检查在时空上邻近的位置是否出现新的细胞。通过该方法，细胞分裂的检测依赖于两个可靠的判据。此外，也可将其他更为复杂的方法应用于无透镜延时成像数据以实现细胞分裂的检测。^21,22,23.

结果

在全息重建过程中，光场由标量场 A 描述（其中 表示在距离样品为 z 的平面上、横向位置为 、波长为 λ 处 A 的复数值）。光的传播由惠更斯-菲涅耳理论建模，该理论提供了一个传播核函数

讨论

本文中，我们展示了可在培养箱内使用无透镜视频显微技术，以捕捉数千个细胞的动力学行为。为了描述整体方法，我们说明了如何利用标准的细胞追踪算法分析培养中HeLa细胞长达2.7天的延时成像数据。最终获得的数据集包含2.2×10⁶次细胞测量结果以及10,584条细胞周期轨迹。实验在HeLa细胞培养物上进行，细胞间距离相对较大（细胞密度<500个细胞/mm²），且细胞形态可近似为圆盘状。这两个特征有利于自动细胞追踪分析的应用，从而能够获取如此大规模的数据集。对于细胞间距离更小或形态更复杂的其他细胞系，追踪难度将增加，所获得的数据集规模也会相应减小。

我们认为，这种方法在许多研究中具有重要意义，例如细胞增殖和细胞大小相关研究。后者是基础生物学中的一个重要研究领域，仍有许多问题尚未解决，正如Ginzberg et al.²⁹在综述中所详细讨论的那样。本研究提出的方案因此提供了一种测量细胞增殖研究所需关键参数的方法，即细胞周期持续时间、细胞干重、细胞周期起始与结束时的细胞干重比值以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无透镜视频显微镜 Cytonote	Iprasense
Horus 图像采集软件	Iprasense
6 孔玻璃底培养板	MatTek corporation	货号：P06G-0-14-F
DMEM + GlutaMAX 培养基	Gibco
热灭活胎牛血清	Eurobio
青霉素和链霉素	Gibco
纤连蛋白	Sigma Aldrich
Matlab 图像处理工具箱	Mathworks