开发一种电化学DNA生物传感器以检测食源性病原体

摘要

介绍了一种电化学DNA生物传感器的制备方案，该传感器由聚乳酸稳定的、金纳米颗粒修饰的丝网印刷碳电极组成，用于检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。

摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见的食源性病原体，在全球范围内导致大量公共卫生问题，显著影响人类的发病率和死亡率。传统的V. parahaemolyticus检测方法，如基于培养的方法、免疫学检测和分子生物学方法，通常需要复杂的样品处理流程，且耗时长、操作繁琐且成本较高。近年来，生物传感器已被证明是一种具有前景且全面的检测手段，具有检测速度快、成本低和实用性高等优势。本研究聚焦于利用DNA杂交原理，开发一种高选择性和高灵敏度的V. parahaemolyticus快速检测方法。在本研究中，采用X射线衍射（XRD）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、透射电子显微镜（TEM）、场发射扫描电子显微镜（FESEM）和循环伏安法（CV）对合成的聚乳酸稳定金纳米颗粒（PLA-AuNPs）进行了表征。我们还进一步测试了PLA-AuNPs的稳定性、灵敏度和可重复性。结果表明，PLA-AuNPs在水溶液中形成了结构良好的稳定纳米颗粒。我们还观察到，由于电荷转移电阻（R_ct）值降低以及活性表面积（0.41 cm²）增加，其灵敏度得到提升。本研究中的DNA生物传感器是通过在丝网印刷碳电极（SPCE）上修饰PLA-AuNPs，并以亚甲基蓝（MB）作为氧化还原指示剂而构建的。我们采用差分脉冲伏安法（DPV）评估了固定化和杂交过程。研究发现，所制备的生物传感器能够特异性区分完全互补、非互补和错配的寡核苷酸序列。此外，在针对多种食源性病原体的交叉反应性研究中，该传感器表现出可靠的高灵敏度检测能力，并成功实现了对中国台湾新鲜血蛤中V. parahaemolyticus的检测与鉴定。

引言

近年来，食源性疾病是公众和科学界广泛讨论的重要议题，主要与三种致病因素相关：微生物¹、化学物质²和寄生虫³。受污染的食品可对人体健康造成严重后果，尤其对免疫系统较弱者、老年人、孕妇、婴儿及幼儿等高风险人群影响更为显著⁴。在非洲、亚洲和拉丁美洲，每年有超过百万例5岁以下儿童发生急性腹泻，食源性疾病已成为一种重要的全球性疾病^5,6，世界卫生组织已确认微生物是其中最主要的致病因素⁷。Vibrio parahaemolyticus 是最受关注的致病菌株之一。该菌通常存在于沿海、河口及海洋环境中⁸，是一种革兰氏阴性细菌，在高盐环境中具有活性，若食用了未充分烹煮、处理不当或生的海产品，可引发严重的人类胃肠炎⁹。此外，某些患有基础疾病的人群更易因感染 V. parahaemolyticus 而出现伤口感染、败血症或耳部感染¹⁰。V. parahaemolyticus 的溶血素毒力因子分为两类，共同参....

方案

注意：所有使用的化学和生化试剂均应为分析纯级别，且未经进一步纯化直接使用。所有溶液均需使用无菌去离子水配制。玻璃器皿在灭菌前须经高压灭菌处理。

注意：进行实验室操作时，请务必采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱、手套箱）和个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、不露趾的鞋子）。

1. 使用聚乳酸-金纳米颗粒制备和表征修饰电极

1. PLA-AuNPs 的制备与表征
   1. 将 10 mL 柠檬酸钠溶液（38.8 mM）迅速加入 100 mL 沸腾的氯金酸水溶液（1 mM）中，随后冷却至室温。观察所制备的 AuNPs 溶液颜色变化：初始为黄色，随后变为黑褐色，最终呈深红宝石红色。
   2. 将 PLA 颗粒置于不锈钢模具中进行熔融处理，在 190 °C 下预热 10 分钟，随后进行压片：在 2.2 MPa 压力下压制 1 分钟，以制备 PLA 薄膜。冷却约 3 小时后，PLA 薄膜即可使用。
   3. 在室温下，将 0.68 mg 的 PLA 薄膜剧烈搅拌溶解于 5 mL 氯仿中。将溶解的 PLA 与 10 mL 前述制备的 AuNPs 溶液混合，并在室温下均匀搅拌。所得均匀混合物记为 PLA-AuNPs，并采用紫外-可见光谱（UV-Vis）、X 射线衍射（XRD）、透射电子显微镜（TEM）以及配备能谱仪（EDX）....

结果

通过观察含柠檬酸钠的水溶液颜色变化，可揭示金纳米颗粒（AuNPs）的形成过程，溶液颜色由浅黄色变为深宝石红色。PLA-AuNPs的生成通过紫外-可见光谱（UV-vis）得到证实（图1），其中表面等离子体共振（SPR）峰在约540 nm处出现。PLA-AuNPs的存在和形成在500–600 nm波长范围内均有体现，具体位置取决于颗粒尺寸³⁷。AuNPs和PLA-AuNPs的X射线衍射（XRD）图谱如图2所示。所有晶粒衍射峰出现在2θ为31.7°、38.2°、44.4°、64.7°和77.7°处，分别归属于立方面心结构（FCC）金（金属）纳米材料的（100）、（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS卡片号：00-004-0783）。PLA-AuNPs的晶粒衍射峰强度在31.7°处呈现更宽的衍射峰，表明AuNPs嵌入在聚乳酸（PLA）基质中，提示形成了多相金纳米结构

讨论

成功构建此类电化学生物传感器框架的关键步骤包括：为换能器选择合适的生物识别元件（此处为核酸或DNA）；构建换能器传感层的化学方法；换能材料；DNA固定化与杂交过程的优化；以及利用实际样品对所开发的生物传感器进行验证。

成功开发高灵敏度和高选择性电化学DNA生物传感器的核心在于优化固定化与杂交条件。在本研究中，我们采用亚甲基蓝（MB）作为氧化还原复合物。MB与DNA的相互作用存在多种机制：（i）通过MB的阳离子电荷与单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）磷酸骨架上的阴离子电荷之间的静电相互作用；（ii）通过MB插入到dsDNA中交替的G-C碱基对之间实现嵌插作用；（iii）通过共价键连接至目标ssDNA末端，该方法标记密度较低（每条DNA链仅结合一个或两个MB分子）；（iv）通过MB与ssDNA中未配对的鸟嘌呤碱基发生相互作用。我们采用了第四种机制，能够准确识别副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus），避免细菌间的交叉反应，并在新鲜蛤蜊样本中实现检测。在特定条件下发生氧化后，MB与ssDNA之间的亲和力增强。当ssDNA与其互补序列杂交时，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Merck	100056
氯仿	Merck	102445
二氨基乙烷四乙酸	Promega	E5134
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	255793
乙醇	Sigma-Aldrich	16368
三水合氯化金(III)	Sigma-Aldrich	520918
盐酸	Merck	100317
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M44907
磷酸二氢钠一水合物	Sigma-Aldrich	S3522
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5119
聚乳酸树脂，商用级 4042D	NatureWorks	4042D
氯化钾	R&M Chemicals	59435
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P9791
铁氰化钾(III)	R&M Chemicals	208019
无水乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
柠檬酸三钠	Sigma-Aldrich	S1804
三(羟甲基)氨基甲烷	Fisher Scientific	T395-100
Tris碱	Fisher Scientific	BP152-500
含双染料的2X PCR预混液	Norgen Biotek	28240
琼脂糖凝胶	Merck	101236
Bolton琼脂	Merck	100079
Bolton肉汤	Merck	100079
CHROMagar弧菌培养基	CHROMagar	VB910
dNTPs	Promega	U1511
无核酸酶水	Thermo Scientific	R0581
伊红亚甲蓝琼脂	Merck	101347
GelRed	Biotium	41001
甘油	Merck	104092
Go Taq缓冲液	Promega	M7911
上样染料 100 bp DNA ladder	Promega	G2101
上样染料 1kb DNA ladder	Promega	G5711
氯化镁	Promega	91176
甘露醇卵黄多粘菌素琼脂	Merck	105267
麦康凯琼脂	Merck	105465
营养肉汤	Merck	105443
Taq DNA聚合酶	Merck	71003
胰蛋白胨大豆肉汤	Merck	105459
胰蛋白胨大豆琼脂	Merck	105458