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开发一种电化学DNA生物传感器以检测食源性病原体

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DOI：

10.3791/56585

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2018年6月3日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

本文内容

摘要

介绍了一种电化学DNA生物传感器的制备方案，该传感器由聚乳酸稳定的、金纳米颗粒修饰的丝网印刷碳电极组成，用于检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。

摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见的食源性病原体，在全球范围内导致大量公共卫生问题，显著影响人类的发病率和死亡率。传统的V. parahaemolyticus检测方法，如基于培养的方法、免疫学检测和分子生物学方法，通常需要复杂的样品处理流程，且耗时长、操作繁琐且成本较高。近年来，生物传感器已被证明是一种具有前景且全面的检测手段，具有检测速度快、成本低和实用性高等优势。本研究聚焦于利用DNA杂交原理，开发一种高选择性和高灵敏度的V. parahaemolyticus快速检测方法。在本研究中，采用X射线衍射（XRD）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、透射电子显微镜（TEM）、场发射扫描电子显微镜（FESEM）和循环伏安法（CV）对合成的聚乳酸稳定金纳米颗粒（PLA-AuNPs）进行了表征。我们还进一步测试了PLA-AuNPs的稳定性、灵敏度和可重复性。结果表明，PLA-AuNPs在水溶液中形成了结构良好的稳定纳米颗粒。我们还观察到，由于电荷转移电阻（Rct）值降低以及活性表面积（0.41 cm2）增加，其灵敏度得到提升。本研究中的DNA生物传感器是通过在丝网印刷碳电极（SPCE）上修饰PLA-AuNPs，并以亚甲基蓝（MB）作为氧化还原指示剂而构建的。我们采用差分脉冲伏安法（DPV）评估了固定化和杂交过程。研究发现，所制备的生物传感器能够特异性区分完全互补、非互补和错配的寡核苷酸序列。此外，在针对多种食源性病原体的交叉反应性研究中，该传感器表现出可靠的高灵敏度检测能力，并成功实现了对中国台湾新鲜血蛤中V. parahaemolyticus的检测与鉴定。

引言

近年来，食源性疾病是公众和科学界广泛讨论的重要议题，主要与三种致病因素相关：微生物1、化学物质2和寄生虫3。受污染的食品可对人体健康造成严重后果，尤其对免疫系统较弱者、老年人、孕妇、婴儿及幼儿等高风险人群影响更为显著4。在非洲、亚洲和拉丁美洲，每年有超过百万例5岁以下儿童发生急性腹泻，食源性疾病已成为一种重要的全球性疾病5,6，世界卫生组织已确认微生物是其中最主要的致病因素7。Vibrio parahaemolyticus 是最受关注的致病菌株之一。该菌通常存在于沿海、河口及海洋环境中8，是一种革兰氏阴性细菌，在高盐环境中具有活性，若食用了未充分烹煮、处理不当或生的海产品，可引发严重的人类胃肠炎9。此外，某些患有基础疾病的人群更易因感染 V. parahaemolyticus 而出现伤口感染、败血症或耳部感染10。V. parahaemolyticus 的溶血素毒力因子分为两类，共同参与疾病的发生发展：由 tdh 基因编码的耐热直接溶血素（TDH）以及由 trh 基因编码的TDH相关溶血素11。临床标本中常可检出 V. parahaemolyticus 的毒力标志物（tdh 和 trh 基因），而在环境标本中则较少发现。

V. parahaemolyticus 具有在广泛条件下生存的能力，能够快速响应环境变化12。其增殖机制使其危害潜力增加，因为其毒性随细胞生物量的增加而同步上升13。更严重的是，气候变化为这些细菌提供了充足条件，加速其种群增长14。由于发生频率高，V. parahaemolyticus 需要在整个食品供应链中进行监测，尤其是在海产品贸易和生产环节，因为全球范围内这些产品中常含有大量该菌15,16。目前，该细菌的鉴定与分离依赖多种方法，包括生化试验、增菌培养与选择性培养基17、酶联免疫磁性吸附测定（ELISA）18、脉冲场凝胶电泳（PFGE）19、乳胶凝集试验以及聚合酶链式反应（PCR）检测20。这些方法通常需要专业技术人员、精密仪器和繁琐的操作步骤，且无法即时提供污染信息。这严重限制了对有害污染的及时发现以及现场应用的可能性。快速检测技术仍面临重大挑战。

生物传感技术作为一种检测食源性病原体的新兴方法，因其具有节省时间、成本效益高、实用性强以及可实现实时分析等优势而备受关注21,22,23,24。然而，尽管生物传感器在加标样品和标准溶液中对分析物的检测已取得诸多积极成果，但在实际样品（无论是水相混合物还是有机提取物）中的应用研究仍显不足25。近年来，基于直接和/或间接脱氧核糖核酸（DNA）检测的电化学生物传感器因其可通过杂交事件特异性识别互补靶标，受到科学界越来越多的关注26,27,28,29。这类独特的方法相较于基于酶的生物传感器更加稳定，因此在微型化和商业化方面展现出良好的前景。本研究所旨在构建一种快速检测工具，能够基于DNA序列在杂交过程中的特异性，实现对V. parahaemolyticus的高选择性、高灵敏度和高实用性检测。该检测策略结合了聚乳酸稳定的金纳米颗粒（PLA-AuNPs）30、丝网印刷碳电极（SPCEs）以及杂交指示剂亚甲基蓝（MB）。进一步通过细菌DNA裂解液和新鲜蛤仔样品验证所构建检测体系的潜在应用价值。

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方案

注意：所有使用的化学和生化试剂均应为分析纯级别，且未经进一步纯化直接使用。所有溶液均需使用无菌去离子水配制。玻璃器皿在灭菌前须经高压灭菌处理。

注意：进行实验室操作时，请务必采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱、手套箱）和个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、不露趾的鞋子）。

1. 使用聚乳酸-金纳米颗粒制备和表征修饰电极

  1. PLA-AuNPs 的制备与表征
    1. 将 10 mL 柠檬酸钠溶液（38.8 mM）迅速加入 100 mL 沸腾的氯金酸水溶液（1 mM）中，随后冷却至室温。观察所制备的 AuNPs 溶液颜色变化：初始为黄色，随后变为黑褐色，最终呈深红宝石红色。
    2. 将 PLA 颗粒置于不锈钢模具中进行熔融处理，在 190 °C 下预热 10 分钟，随后进行压片：在 2.2 MPa 压力下压制 1 分钟，以制备 PLA 薄膜。冷却约 3 小时后，PLA 薄膜即可使用。
    3. 在室温下，将 0.68 mg 的 PLA 薄膜剧烈搅拌溶解于 5 mL 氯仿中。将溶解的 PLA 与 10 mL 前述制备的 AuNPs 溶液混合，并在室温下均匀搅拌。所得均匀混合物记为 PLA-AuNPs，并采用紫外-可见光谱（UV-Vis）、X 射线衍射（XRD）、透射电子显微镜（TEM）以及配备能谱仪（EDX）的场发射扫描电子显微镜（FESEM）进行表征。
  2. 修饰丝网印刷碳电极的制备与表征
    注：本研究所用的丝网印刷碳电极（SPCE）包含三电极系统：对电极、碳工作电极和 Ag/AgCl 参比电极。
    1. 用移液器迅速将 25 µL 均匀的 PLA-AuNPs 溶液滴加到 SPCE 表面，室温下晾干 24 小时后即可使用。
    2. 在铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]3-/4-）溶液中对修饰电极 SPCE/PLA-AuNPs 进行电化学表征，测定其活性表面积、电化学阻抗谱、重复性、重现性和稳定性30。

2. 电化学DNA生物传感器的开发

  1. 探针制备
    注意：单链DNA探针和互补DNA的序列是根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库的信息选定的。
    1. 根据以下序列，从商业实验室购买合成的寡核苷酸（20-mer单链DNA探针、20-mer互补DNA、20-mer错配DNA和21-mer非互补DNA），以冻干粉形式提供：
      硫醇化单链DNA探针：5′- / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′
      互补DNA：5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′
      单碱基错配DNA：5′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′
      三碱基错配DNA：5′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′
      非互补DNA：5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′
    2. 使用无菌TE溶液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.5）配制所有寡核苷酸的储备液（100 µM），分装为若干分析用份量。储存于-4 °C，使用前再进行适当稀释。
  2. 固定化与杂交条件的优化
    注意：本研究采用聚乳酸-金纳米颗粒修饰的丝网印刷碳电极（SPCE/PLA-AuNPs），并通过滴涂法实现DNA的固定化与杂交。
    1. 首先将25 µL硫醇化单链DNA探针固定在SPCE/PLA-AuNPs表面，室温下空气中干燥24小时，最终标记为SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA。通过三个因素优化固定化条件：单链DNA浓度（0.2至1.4 µM）、时间（30至210分钟）和温度（25至75 °C）。
    2. 将25 µL互补DNA溶液移取至SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA表面，进行杂交反应，最终标记为SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA。通过两个因素优化杂交条件：时间（5至30分钟）和温度（25至75 °C）。
    3. 将完成固定化与杂交的电极浸入20 µM亚甲基蓝（MB）溶液中30分钟。用0.5 M ABS/20 mM NaCl（pH 4.5）洗涤以去除非特异性吸附的DNA和过量MB，随后用去离子水冲洗。采用微分脉冲伏安法（DPV）测定MB还原的峰电流。DPV测量在不含指示剂的0.1 M PBS（pH 7）中进行。
  3. 所构建DNA生物传感器的表征
    1. 将SPCE/PLA-AuNPs电极浸入20 µM MB溶液中30分钟，用0.5 M ABS/20 mM NaCl（pH 4.5）洗涤，再用去离子水冲洗，然后进行测量。对探针DNA、互补DNA、错配DNA和非互补DNA样品的所有相互作用均采用类似步骤处理。
    2. 测定电化学还原过程。
      注意：DPV测量使用商业化的Autolab仪器及其配套接口软件完成。
      MB电化学还原的DPV测量在0.1 M PBS（pH 7）中进行，无指示剂存在；电位范围为-0.5 V至0.25 V，步进电位0.005 V，调制振幅0.05 V，扫描速率为7.73 mVs-1。进一步研究了所构建DNA生物传感器的选择性、灵敏度、重复性和热稳定性。报告结果为三次重复实验的平均值。

3. 使用真实样品验证制备的DNA生物传感器

  1. 细菌菌株的制备
    1. 根据细菌样本对海产品的严重污染程度进行筛选31,32 .
      注意： 副溶血性弧菌 作为参考菌株以及另外8种细菌菌株（空肠弯曲菌, 单核细胞增生李斯特菌, 鼠伤寒沙门氏菌, 肠炎沙门氏菌, 肺炎克雷伯菌，大肠杆菌 O157:H7, Bacillus cereus，以及 副溶血弧菌本研究采用常见食源性病原体的电化学DNA生物传感器验证。
    2. 每两周在相应的琼脂培养基上对细菌菌株进行常规传代培养，以维持其活性，参考 表1 培养条件。
    3. 在含有20%（v/v）甘油的相应增菌肉汤中于-80 °C长期保存菌株，甘油可通过防止冰晶形成来保护细菌，避免其在冷冻过程中受损。随后，将甘油保存管中的菌种用接种环接种至相应的增菌肉汤中。根据各类细菌各自的生长时间和温度要求进行培养，以复苏菌种。
    4. 确定数量 副溶血性弧菌 采用涂布平板技术培养细胞33一种标准且广为人知的微生物计数方法，通过一系列稀释液获得微生物数量。
      1. 培养 副溶血性弧菌 在37 °C、140 rpm振荡条件下，于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB + 3% NaCl）中培养。然后，取1 mL菌液转移至9 mL TSB + 3% NaCl中，以获得10倍稀释液。-1 稀释倍数
    5. 重复此步骤九次，以获得最多 10 个的完整系列-10 稀释倍数。接着，取每种稀释倍数的菌液0.1 mL（从10开始）-1 至 10-10在弧菌选择性琼脂平板上进行菌落计数。将平板置于37 °C培养24 h。
    6. 使用菌落计数器计数单个菌落，然后通过反向计算（菌落形成单位数/移液量 × 稀释倍数）得出每毫升菌落形成单位密度（CFU/mL）-1）。根据菌落形成单位（CFU）的校准曲线推算细菌细胞悬液中每毫升菌落形成单位（CFU/mL）的浓度-1 相对于吸光度。
  2. PCR检测的制备
    1. 采用改良的煮沸裂解法提取基因组DNA34首先，将单个细菌菌株划线接种于琼脂培养基上，并接种至液体培养基中，随后在相应的生长条件下（140 rpm 摇床）培养。
    2. 将1 mL液体培养物移入微量离心管中。在4830 × g、4 °C条件下离心1分钟，以获得菌体沉淀。加入约500 µL无菌TE缓冲液重悬菌体沉淀。将所得悬液于加热块中98 ± 2 °C孵育10分钟，随后立即在-18 °C冷却10分钟，以裂解细胞并释放DNA。
    3. 在 4830 × g 和 4 °C 条件下离心基因组 DNA 3 分钟，以获得澄清的悬浮液，并将上清液保存于 -20 °C 以备后续使用。使用生物分光光度计，通过在波长 260 nm（核酸的光吸收波长）和 280 nm（蛋白质的光吸收波长）处的紫外吸收测定，确定所提取基因组 DNA 的浓度和纯度，然后利用标准生化实验鉴定所有菌株。35 并通过16S rRNA基因测序进行验证36最后，将基因组DNA在92 °C下变性2分钟，然后迅速置于冰水中冷却，再应用于生物传感器。
    4. 进一步确认存在的现象 副溶血性弧菌 使用PCR扩增toxR基因。在热循环仪中进行该反应，引物序列为5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3'和5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'。PCR扩增总体积为25 µL，包含无菌水（15.5 µL）、缓冲液（5 µL）、引物（1 µL，10 µM）、dNTP混合物（1 µL）、DNA模板（2 µL）和Taq DNA聚合酶（0.2 µL，10x），优化扩增条件。
    5. 充分混匀各组分，并在已设定为30个扩增循环的PCR仪中进行目标序列的扩增反应。在本研究中，每个循环均包含三步反应 即初始变性（94 °C，3 min），随后进行30个循环的变性（94 °C，1 min）、退火（63 °C，1.5 min）和延伸（72 °C，1.5 min），最后进行终延伸（72 °C，7 min）。
    6. 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳确定扩增产物及其大小。使用 commercially produced gel-documentation system 拍摄凝胶图像。
  3. 鸟蛤样品的制备
    1. 获取新鲜样品。
      注意：我们的新鲜蛤仔（Anadara granosa从马来西亚雪兰莪州沙登的湿货市场获取样品，并迅速用冰盒运送到实验室进行分析。将样品分为两组，即处理组和未处理组，假设蛤蜊从捕捞开始至放入冷藏储存期间均保持一致的采收条件。
    2. 对处理组的蛤蜊进行预处理，先在 -20 °C 下保存 24 小时，然后在 DNA 提取前于 20 °C 下暴露于紫外光照射 4 小时。
      注意：对照组所采用的冷冻温度和紫外线照射会杀死或至少抑制自然积累的 副溶血性弧菌 在蛤蜊中。不要采用70 °C的更高巴氏杀菌条件，因为本研究中受控条件的目的是模拟新鲜蛤蜊的实际状况。同时，样品到达实验室后，立即对未经处理组的样品直接进行分析，不进行任何预处理。
    3. 传代培养一种菌株 副溶血性弧菌 ATCC 17802 菌株接种于含3% NaCl的TSB培养基中。通过将含3% NaCl的TSB培养基进行适当稀释后涂布于CA培养基，测定接种物中的活菌数量，以获得浓度为10的接种液4 CFU mL-1 的 副溶血性弧菌用蒸馏水冲洗每个蛤仔，并刷去污物，然后在超净工作台中使用无菌镊子将组织从壳中取出。
    4. 将约10 g鸟蛤组织样品加入90 mL无菌TSB（3% NaCl）中，使用匀浆器匀浆60秒。加入已知量的 副溶血性弧菌 向加标样品的均质化样本肉汤中加入至9 mL。将未加标的样品作为阴性对照。估算细胞数量 副溶血性弧菌 通过将0.1 mL样品涂布于CA培养基上接种至蛤样品中，并随后将1 mL样品移入微量离心管中用于DNA提取，以进行生物传感器和PCR检测。
    5. 提取基因组DNA 副溶血性弧菌 经改良的煮沸裂解法处理加标与未加标样品后36最后，使用生物分光光度计在260 nm波长（核酸的光吸收波长）和280 nm波长（蛋白质的光吸收波长）下测定DNA浓度和纯度。

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结果

通过观察含柠檬酸钠的水溶液颜色变化，可揭示金纳米颗粒（AuNPs）的形成过程，溶液颜色由浅黄色变为深宝石红色。PLA-AuNPs的生成通过紫外-可见光谱（UV-vis）得到证实（图1），其中表面等离子体共振（SPR）峰在约540 nm处出现。PLA-AuNPs的存在和形成在500–600 nm波长范围内均有体现，具体位置取决于颗粒尺寸37。AuNPs和PLA-AuNPs的X射线衍射（XRD）图谱如图2所示。所有晶粒衍射峰出现在2θ为31.7°、38.2°、44.4°、64.7°和77.7°处，分别归属于立方面心结构（FCC）金（金属）纳米材料的（100）、（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS卡片号：00-004-0783）。PLA-AuNPs的晶粒衍射峰强度在31.7°处呈现更宽的衍射峰，表明AuNPs嵌入在聚乳酸（PLA）基质中，提示形成了多相金纳米结构

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讨论

成功构建此类电化学生物传感器框架的关键步骤包括：为换能器选择合适的生物识别元件（此处为核酸或DNA）；构建换能器传感层的化学方法；换能材料；DNA固定化与杂交过程的优化；以及利用实际样品对所开发的生物传感器进行验证。

成功开发高灵敏度和高选择性电化学DNA生物传感器的核心在于优化固定化与杂交条件。在本研究中，我们采用亚甲基蓝（MB）作为氧化还原复合物。MB与DNA的相互作用存在多种机制：（i）通过MB的阳离子电荷与单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）磷酸骨架上的阴离子电荷之间的静电相互作用；（ii）通过MB插入到dsDNA中交替的G-C碱基对之间实现嵌插作用；（iii）通过共价键连接至目标ssDNA末端，该方法标记密度较低（每条DNA链仅结合一个或两个MB分子）；（iv）通过MB与ssDNA中未配对的鸟嘌呤碱基发生相互作用。我们采用了第四种机制，能够准确识别副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus），避免细菌间的交叉反应，并在新鲜蛤蜊样本中实现检测。在特定条件下发生氧化后，MB与ssDNA之间的亲和力增强。当ssDNA与其互补序列杂交时，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢马来西亚博特拉大学提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Merck100056
氯仿Merck102445
二氨基乙烷四乙酸PromegaE5134
磷酸氢二钠 Sigma-AldrichS9763
磷酸氢二钠Sigma-Aldrich255793
乙醇 Sigma-Aldrich16368
三水合氯化金(III)Sigma-Aldrich520918
盐酸Merck100317
亚甲蓝Sigma-AldrichM44907
磷酸二氢钠一水合物Sigma-AldrichS3522
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP5119
聚乳酸树脂，商用级 4042DNatureWorks4042D
氯化钾R&M Chemicals59435
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP9791
铁氰化钾(III)R&M Chemicals208019
无水乙酸钠Sigma-AldrichS2889
氯化钠Sigma-AldrichS9888
柠檬酸三钠Sigma-AldrichS1804
三(羟甲基)氨基甲烷Fisher ScientificT395-100
Tris碱Fisher ScientificBP152-500
含双染料的2X PCR预混液Norgen Biotek28240
琼脂糖凝胶Merck101236
Bolton琼脂Merck100079
Bolton肉汤Merck100079
CHROMagar弧菌培养基CHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
无核酸酶水Thermo ScientificR0581
伊红亚甲蓝琼脂 Merck101347
GelRedBiotium41001
甘油Merck104092
Go Taq缓冲液PromegaM7911
上样染料 100 bp DNA ladderPromegaG2101
上样染料 1kb DNA ladderPromegaG5711
氯化镁Promega91176
甘露醇卵黄多粘菌素琼脂Merck105267
麦康凯琼脂Merck105465
营养肉汤Merck105443
Taq DNA聚合酶Merck71003
胰蛋白胨大豆肉汤Merck105459
胰蛋白胨大豆琼脂Merck105458

参考文献

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