一种基于荧光的简易报告基因检测法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分

摘要

在本文中，我们描述了一种基于酵母的荧光报告基因检测方法，用于鉴定参与植物毒素蓖麻毒素A亚基（RTA）转运和杀伤过程的细胞组分。

摘要

细菌和植物来源的A/B型毒素利用真核细胞内的天然转运途径，到达细胞质中的胞内靶点，最终导致细胞死亡。这类A/B型毒素通常由一个具有酶活性的A亚基（例如，蓖麻毒素A链，RTA）和一个或多个负责与细胞结合的B亚基组成，后者介导毒素与特定细胞表面受体的结合。目前对A/B型毒素如何高效进入细胞并造成中毒作用的研究，帮助科学家深入理解了真核细胞中的基本细胞机制，例如内吞作用以及高等真核细胞内的蛋白质胞内分选过程。从医学角度来看，明确A/B型毒素的主要转运途径，对于为患者寻找有效的治疗方案，或开发基于毒素的癌症治疗策略同样具有重要意义。

由于在哺乳动物细胞中进行A/B毒素运输的全基因组分析较为复杂、耗时且昂贵，因此多项关于A/B毒素转运的研究已在酵母模式生物Saccharomyces cerevisiae中开展。尽管酵母细胞结构较为简单，但其基本的细胞过程与高等真核细胞相似，且在酵母中获得的研究结果通常可外推至哺乳动物体系。

在此，我们描述了一种快速且易于使用的报告基因检测方法，用于分析RTA在酵母中的细胞内转运过程。该新检测方法的一个重要优势在于，不仅可研究RTA从内质网（ER）向细胞质的逆向转位，还可研究毒素从质膜经内吞作用及逆向运输至内质网的全过程。该检测利用一种报告质粒，通过绿色荧光蛋白（GFP）的荧光发射间接测量RTA的毒性 体内 由于RTA可通过28S rRNA去嘌呤作用高效抑制蛋白质生物合成的起始，本实验通过检测荧光发射的变化，可鉴定参与细胞内RTA转运的宿主细胞蛋白。

引言

由产毒细菌感染所致的患者对每个社会医疗体系均构成严重的医疗和经济负担，尤其是目前仍普遍缺乏有效的治疗手段。为了开发新的治疗策略，有必要在分子水平上全面理解具有医学重要性的A/B型毒素（如霍乱毒素、志贺毒素或蓖麻毒素）的复杂中毒机制，而这需要建立并实施新型高效的检测方法。

近年来，多项研究试图通过使用耗时且成本高昂的方法（如放射性毒素标记）来分析酵母和哺乳动物细胞中的A/B毒素转运^1,2 以及基于siRNA的筛选方法³在某些情况下，已对毒素的转运过程进行了可视化观察 体内 通过化学和/或遗传方法将单个毒素亚基与荧光染料、量子点或荧光蛋白偶联后，利用荧光显微镜进行观察^4,5不幸的是，这类修饰通常会导致毒素失去活性和/或改变其天然特性。另一种巧妙的间接方法是利用基于酶的报告系统来回答多种科学问题，例如 lacZ 荧光素酶，或荧光蛋白（例如 GFP 或 Discosoma sp红色荧光蛋白（dsRed）

在本文中，描述了一种简单的方法，用于鉴定细胞内转运外源性施加的RTA所需的细胞组分 S. cerevisiae因此，含有N端ER导入信号并后接GFP的荧光报告质粒可作为蛋白质生物合成传感器，通过GFP荧光发射间接测量RTA介导的蛋白质翻译抑制 体内 翻译⁶如果与野生型相比，特定酵母基因敲除突变体中的RTA内吞作用和/或细胞内运输受到负向（或正向）影响，则可通过GFP荧光发射的增强（或减弱）来检测⁶.

迄今为止，所有分析酵母细胞中RTA转运的方法均局限于RTA从内质网到细胞质的逆向转位过程。在这种人工系统中，含有内质网导入信号的RTA由一个可诱导启动子表达，导致细胞出现自杀表型^1,7。尽管本文所描述的实验体系同样缺少蓖麻毒素的细胞结合B亚基，因此不能完全代表天然蓖麻毒素全毒素中毒的情况⁸，但该新检测方法能够高度模拟毒素从质膜经高尔基体转运至内质网的过程。有趣的是，初步研究获得的结果表明，RTA所利用的运输途径与蓖麻毒素全毒素的中毒路径具有显著的相似性。

综上所述，该方法可用于确定特定细胞蛋白在酵母中RTA内吞及转运过程中的具体作用。此外，该实验体系还可轻松适用于其他由不同酵母或细菌物种产生并分泌的核糖体失活毒素，例如zymocin或志贺毒素。

方案

注意：一般实验流程的概述如图所示 图1.

注意：RTA 对人类具有高毒性，需要具备安全实验室 S2 级许可（相当于生物安全二级）。整个实验过程中请佩戴手套。

1. 带有His标签的RTA在异源系统中的表达 大肠杆菌

1. 使用标准电穿孔方法将表达质粒 pET24-RTA_(His)6 或空载体 pET24a⁽⁺⁾ 转化至 E. coli 细胞中^9,10。含空质粒的细胞作为阴性对照。
2. 在含卡那霉素（100 µg/mL）的 LB 平板上筛选阳性克隆后，将含 RTA 表达质粒或空载体的菌落接种于 5 mL LB_kan 培养基（含 100 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基）中，于 37 °C、220 rpm 条件下培养 24 小时。
3. 向 1 L LB_kan 培养基中加入 5 mL 预培养菌液，于 37 °C、220 rpm 条件下培养至菌液 OD₆₀₀ 达到 0.8–1.0（约需 3–4 小时）。随后将培养温度降至 28 °C，并用 H₂O 配制 1 M 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）储备液。
4. 通过加入 IPTG 至终浓度 1 mM 以诱导 E. coli 中 RTA 的表达。
5. 在 28 °C、220 rpm 条件下继续培养 3.5 小时后，于 10,000 × g、4 °C 离心 10 分钟收集菌体，用 5 mL 结合缓冲液（500 mM NaCl、10 mM 咪唑、20 mM KH₂PO₄，pH = 7.4）在 10,000 × g、4 °C 条件下洗涤菌体沉淀两次，每次 10 分钟，最后将菌体沉淀重悬于 5 mL 结合缓冲液中。
   注意：本步骤可暂停，菌体可在 -80 °C 保存数天。

2. 通过亲和层析纯化带组氨酸标签的RTA

1. 按照以下程序在冰上进行细胞超声处理：脉冲15秒（20微米），暂停30秒。重复此步骤五次。
2. 将细胞裂解液在21,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，并使用无菌注射器滤器系统（0.2 µm孔径）过滤上清液。
   注意：成功超声处理的样品其细胞沉淀边缘呈透明状。
3. 使用配备5 mL基于Ni²⁺的亲和层析柱的自动纯化系统，从经无菌过滤的E. coli上清液中纯化His标签RTA组分。通常采用1 mL/min的洗脱流速，并对整个纯化系统进行冷却，以防止毒素结合效率降低及活性丧失。
   注意：高效RTA纯化的参数详见表1。更多详细信息请参见Becker et al.⁹。
   1. 首先用20 mL结合缓冲液平衡亲和层析柱，以去除保存液。使用注射器将经无菌过滤的上清液加样至亲和层析柱上。
   2. 用25–35 mL结合缓冲液洗涤层析柱，以去除未结合的蛋白质。持续洗涤直至280 nm处的紫外吸光度接近初始值。
   3. 用20–35 mL洗脱缓冲液（500 mM咪唑、500 mM NaCl、20 mM KH₂PO₄，pH = 7.2）洗脱结合的RTA组分，并将样品置于冰上保存（图2A和图2B）。
      注意：RTA组分的洗脱表现为紫外吸收增加。请注意仅收集该洗脱峰，以避免非特异性结合蛋白的污染。
   4. 取20 µL洗脱样品进行考马斯亮蓝染色¹¹或Western印迹分析^12,13（可选）。使用一抗抗His抗体（1:1,000）和二抗抗小鼠IgG-HRP（1:10,000）检测RTA并验证样品纯度（图3）。
   5. 将洗脱的RTA组分通过5 mL脱盐柱进行脱盐，并将样品平衡于0.8 M山梨醇溶液中。
      1. 将纯化系统中的亲和柱更换为脱盐柱，首先用20 mL 0.8 M山梨醇溶液平衡层析柱。
      2. 通过注射器将洗脱的RTA组分加样至脱盐柱上。用100 mL 0.8 M山梨醇溶液洗涤层析柱，并在紫外吸收开始上升时立即开始收集脱盐后的RTA组分至15 mL离心管中（图2C）。
      3. 将洗脱的RTA组分在4 °C保存。
         注意：当电导率上升时应立即停止收集RTA组分，以避免盐分污染。脱盐步骤的参数详见表1。
4. 使用截留分子量为10 kDa的离心浓缩柱，在10,000 × g、4 °C条件下离心30–180分钟，将洗脱的RTA组分浓缩至终体积1–2 mL，并将样品在4 °C保存3–4周。
   警告：切勿冷冻样品，因冷冻会导致RTA活性完全丧失。
5. 使用常规蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白浓度应在1–1.5 mg/mL范围内。
   注意：若蛋白浓度过高（>5 mg/mL），RTA易发生沉淀。

3. 酵母转化与细胞壁去除

1. 将野生型或选定的酵母基因敲除突变株转化含有GFP报告基因的质粒pRS315-K28_SP-GFP⁶ 使用标准的醋酸锂转化方法¹⁴在亮氨酸缺失的葡萄糖培养基平板（2% 葡萄糖、1.5% 琼脂、0.5% 硫酸铵、0.17% 酵母氮源基础（YNB）和 0.087% 无亮氨酸的缺失混合物）上，于 30 °C 培养细胞 2–3 天，以筛选阳性克隆。
2. 从每块平板上挑选3个不同的酵母克隆，接种于100 mL亮氨酸缺陷型棉子糖培养基（2% 棉子糖、0.5% 硫酸铵、0.17% YNB、0.087% 无亮氨酸的d/o混合物）中，在30 °C、220 rpm条件下培养至OD₆₀₀ = 1.0-2.0（2-4 × 10⁷ 细胞/毫升
   注意：不同酵母缺失菌株的细胞生长情况存在差异。监测 OD₆₀₀ 通过分光光度计。
3. 计算OD₆₀₀ 值，将样品稀释至OD₆₀₀ = 0.1–0.3（1:5 至 1:10 稀释），测定 OD₆₀₀ 在分光光度计中。以 H 作为对照₂O，补充相应量的亮氨酸，置于去氧棉子糖培养基中。最后，重悬OD₆₀₀ = 125 溶于 5 mL 无菌水（5 × 10⁸ 细胞/毫升
4. 在 25 °C 下以 10,000 × g 离心细胞 5 分钟，用 5 mL 无菌水洗涤细胞两次，并将细胞重悬于 50 mL 原生质球缓冲液（0.8 M 山梨醇，10 mM Tris-HCl（pH 7.5），10 mM CaCl₂）中₂，2 mM 二硫苏糖醇（DTT）和 200 µg/mL 裂解酶。
5. 在30 °C、100 rpm条件下孵育50 mL培养物90分钟。可选：每隔15分钟通过相差显微镜监测原生质球形成情况。在显微镜下，细胞应呈深半透明灰色。明亮（折光性强）的细胞表示消化不足，而细胞影（颜色浅灰、内部结构极少或无）则表示消化过度。
6. 检测每个样品的球形质体制备效果。
   1. 完成步骤3.5后，取4 µL经原生质球化处理的50 mL培养物与496 µL原生质球化缓冲液混合（约2 × 10⁶ 原生质球）在400 × g下离心10分钟。
   2. 将沉淀重悬于10 mL H₂O 蒸馏水，涡旋震荡样品 30 秒，取 10 µL 样品涂布于缺乏亮氨酸但含葡萄糖的平板（2% 葡萄糖，1.5% 琼脂，0.5% 硫酸铵，0.17% YNB，以及不含亮氨酸的 0.087% d/o 混合物）上。
   3. 在30 °C条件下培养细胞3天。计数平板上生长的细胞克隆总数。进行数据分析时，仅使用效率高于98%的样本（细胞克隆总数） <每皿40个菌落
7. 将步骤3.5的细胞在400 × g、4 °C条件下离心10分钟，用5 mL稳定型亮氨酸缺陷棉子糖培养基（0.8 M山梨醇，2%棉子糖，0.5%硫酸铵，0.17%酵母氮源基础培养基，以及0.087%不含亮氨酸的补充混合物）洗涤细胞两次。将细胞重悬于5 mL稳定型亮氨酸缺陷棉子糖培养基中（1 × 10⁸ cells/mL）。⁸ 细胞/mL），并直接用于GFP报告基因检测的测量（第4节）。

4. 96孔板中GFP报告基因检测测量

1. 将步骤 3.7 中获得的酵母细胞原生质体接种到 96 孔板中（每孔 200 µL）。
2. 在每个孔中加入 70 µL 含有阴性对照的稳定化亮氨酸缺陷型棉子糖培养基（来自表达空载体的 IPTG 诱导的 E. coli 细胞裂解液经 Ni²⁺-亲和纯化后的洗脱液），或加入终浓度为 5 µM（相当于 160 g/L RTA）的纯化 RTA。
3. 立即向每孔中加入 30 µL 稳定化半乳糖溶液（30% 半乳糖，0.8 M 山梨醇），以诱导 GFP 表达，并随即开始检测。
   注意：每次实验至少进行 3 次技术重复，每种酵母菌株至少进行 3 次生物学重复。
4. 完成样品制备（步骤 4.1–4.3）后，将 96 孔板放入荧光读板仪中并开始检测。使用 GFP 荧光检测所需的 475/509 nm 滤光片组合。在 30 °C 条件下，以 120 rpm 转速、1 mm 振荡直径，持续检测 20 小时（每 10 分钟测量一次）。
   注意：GFP 滤光片组合通常在所有读板系统中均可使用。温度、检测时间窗口、测量间隔和 RTA 浓度可根据实际需求调整。代表性结果见 图 4。
5. 可选：在检测中加入额外的内部对照以进行质量控制。通过加入 30 µL 稳定化亮氨酸缺陷型棉子糖培养基（代替 30% 半乳糖）制备阴性对照（无 GFP 诱导）。此外，加入 70 µL 0.8 M 山梨醇稳定的 G418 溶液（300 µg/mL）。蛋白质翻译抑制剂 G418 可作为蛋白质合成抑制的阳性对照，因其可抑制酵母中 GFP 的表达。
6. 根据以下公式计算 20 小时时间点的相对 GFP 荧光强度百分比（见 图 4A）：   其中 NC 代表阴性对照
   1. 或者，使用上述公式计算每个测量时间点（本例中为每 10 分钟，参见步骤 4.4）的相对 GFP 荧光强度。如 图 4B 所示，通过将 GFP 荧光强度（y 轴）对时间（x 轴）作图，绘制曲线图。

结果

本论文所述实验方案的整体工作流程如图1所示，大致概括了成功纯化RTA以及后续GFP报告基因实验的各个步骤。每个步骤的详细说明可在实验方案部分找到。图2展示了通过亲和层析成功纯化RTA（图2A）以及空载体对照（图2B）的预期结果。图2C显示了脱盐实验的代表性结果，图中清晰分离出蛋白峰（蓝色）和盐洗脱峰（棕色）。图3以考马斯亮蓝染色的SDS凝胶形式展示了有效的RTA纯化结果。最后，图4总结了通过这种简单且稳健的基于GFP的报告基因检测方法获得的一些原始结果⁶。图4A

讨论

在执行上述方案时，我们建议遵循以下建议，以确保实验取得成功。

在异源蛋白表达过程中，IPTG 浓度不应超过 1 mM。IPTG 浓度 >1 mM 会抑制启动子诱导的 RTA 表达，导致毒素产量降低。此外，为防止包涵体形成、折叠效率低下以及毒素失活，细胞培养温度不应高于 28 °C。在较低温度（例如，20–28 °C）下表达 RTA 是可行的，也能产生具有生物活性的毒素。然而，进一步降低温度对 RTA 活性或折叠的改善并不显著，且与 28 °C 相比，总毒素产量反而更低（数据未显示）。

亲和层析的纯化参数（表1）是针对配备5 mL Ni²⁺ 亲和柱的自动化纯化系统进行优化的，若RTA纯度或得率不理想，应根据所使用的其他自制或商用柱系统进行相应调整。若RTA纯度不理想（表现为考马斯亮蓝染色的SDS凝胶中出现额外蛋白条带），通常可通过提高结合缓冲液中的咪唑浓度，以减少带正电荷蛋白与柱料的非特异性结合，从而提高RTA的整体纯度。若RTA得率不理想，可尝试...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌和酵母菌株
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 缺失突变体	Dharmacon	YSC1054	完整文库
名称	公司	目录编号	备注
本实验方案中使用的质粒
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
名称	公司	目录编号	备注
试剂
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	用于去除细胞壁的裂解酶
LB 肉汤培养基	Thermo Scientific	10855021	制备平板时添加 15 g 琼脂
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
硫酸铵	Sigma-Aldrich	A4418-100G
不含亮氨酸的酵母缺陷型混合补充剂	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
琼脂	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-棉子糖	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-山梨醇	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
咪唑	Roth	3899.1
PAGE Ruler 预染蛋白 Marker	Fermentas	26616	用于 Western 印迹分析的蛋白分子量标准
名称	公司	目录编号	备注
RTA 纯化、脱盐及读数测量所用材料
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		旧型号，其他型号可用
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	旧型号，已不再供应
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	产品已停产并被替代
HisTRAP HP 柱	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP 脱盐柱	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart 无菌滤器	Sartorius	16534K	0.2 µm 孔径
BCA 蛋白检测试剂盒	Pierce	23225
660 nm 检测试剂盒	Thermo Scientific	22660
96 孔板	Thermo Scientific	260860
名称	公司	目录编号	备注
抗体（可选）
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	一抗；1:1,000 稀释
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	二抗，1:10,000 稀释