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基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

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DOI：

10.3791/56589

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2018年1月8日

 ,  , 
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种三维培养方法，用于分析原代乳腺癌细胞的形态，以及研究它们与单核细胞的直接/间接相互作用及其结果，例如胶原降解、免疫细胞募集、细胞侵袭和促进癌症相关炎症。

摘要

嵌入于细胞外基质（ECM）中的正常及肿瘤性上皮细胞与造血和非造血细胞密切相互作用，从而显著影响正常组织稳态及疾病进程。在乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在疾病进展、转移和复发中发挥关键作用；因此，阐明单核细胞向肿瘤微环境趋化的机制及其与肿瘤细胞的相互作用，对于控制疾病具有重要意义。本文详细描述了一种人乳腺癌（BrC）细胞与人单核细胞的三维（3D）共培养体系。BrC细胞基础状态下可高水平分泌活化调节因子、正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF）；而在与单核细胞共培养时，促炎性细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-8，以及基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-2和MMP-10的表达均显著上调。该肿瘤间质微环境可促进MCF-10A细胞形成的3D腺泡样结构抵抗失巢凋亡，诱导单核细胞趋化，并增强侵袭性BrC细胞的侵袭能力。本文所提供的实验方案为研究肿瘤内部通讯提供了一种经济可行的替代方法，并展示了其在肿瘤生物学研究中的巨大潜力。 体外 三维细胞系统可用于研究与肿瘤侵袭性相关的肿瘤生物学特定特征。

引言

肿瘤生物学远比此前认为的更为复杂。越来越多的证据表明，肿瘤细胞不仅仅是无限制增殖的细胞团；相反，不同的肿瘤细胞似乎执行着不同的功能，在肿瘤内部呈现出高度的组织性和层次性1。肿瘤细胞还与非转化细胞密切交流：巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、内皮细胞等均浸润于构成细胞外基质（ECM）的支架蛋白和多糖网络之中。转化细胞与非转化细胞之间以及这些细胞与ECM之间建立了大量直接和间接的相互作用，这些相互作用对疾病的发展进程具有重要影响2,3。以乳腺癌（BrC）为例，尤其重要的是解析BrC细胞与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）之间的通讯机制，因为已有研究发现，TAMs在肿瘤进展中发挥关键作用，可增加转移和疾病复发的风险4,5。

为了分析肿瘤内部的相互作用及其可能的结果，研究人员已开发出基于细胞外基质（ECM）提取物的新型三维体外模型，相较于传统的单层细胞培养（细胞贴附于塑料表面生长），这些模型提供了更为复杂的微环境，更接近肿瘤生物学的真实情况。Petersen 和 Bissell6首次建立了在富含层粘连蛋白的基底膜上培养良性和恶性乳腺上皮细胞的模型，并首次描述了能够区分良性与恶性人乳腺上皮细胞的三维类器官结构。十年后，Debnath、Muthuswamy 和 Brugge7,8,9建立的模型为阐明腺泡恶性转化过程中受损的生物学通路提供了有力工具，例如因增殖失控导致的大腺泡形成、紧密连接蛋白错位表明细胞极性受损，以及由于细胞对失巢凋亡（anoikis）产生抵抗而导致腺泡腔的丧失——失巢凋亡是一种程序性细胞死亡，发生在依赖锚定生长的细胞脱离周围ECM时。Sameni、Jedeszko 和 Sloane 的模型则聚焦于成像细胞的蛋白水解活性，该特性与侵袭性密切相关，是肿瘤恶性表型的另一关键特征10,11,12。这些模型依赖于混合了不同荧光淬灭蛋白底物的蛋白基质（如DQ-明胶、DQ-胶原I型和DQ-胶原IV型），其中荧光信号的出现指示了胶原蛋白的蛋白水解降解。三维模型还被用于研究未转化细胞和肿瘤细胞的干细胞特性，在此类模型中，细胞聚集体（也称为球体）可在悬浮状态或类ECM蛋白中培养，以探究细胞分化、不对称细胞分裂、细胞间黏附及细胞运动等机制13,14。侵袭实验可用于评估肿瘤的内在侵袭能力，并鉴定在侵袭过程中充当趋化因子的分子15。总体而言，三维模型代表了一种经济可行的体外细胞培养多样化手段，能更真实地反映正常组织和肿瘤组织的形态发生过程。

我们基于上述模型设计了一种三维细胞共培养系统7,10,11，使用已知侵袭潜能的人类商业乳腺癌细胞系（管腔型和三阴性型）以及从乳腺癌患者体内分离的原代细胞。我们首先建立了一个模型，将非侵袭性（MCF-7）或侵袭性（MDA-MB-231）乳腺癌细胞与U937单核细胞在基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中进行共培养，该系统允许细胞间直接接触。这些共培养体系用于研究这两种细胞谱系之间的相互作用如何影响一组与癌症侵袭行为相关基因的转录。结果显示，环氧合酶-2（COX-2）的转录水平显著升高，并伴随其产物之一前列腺素E2（PGE2）生成增加，突显了炎症在癌症进展中的作用。此外，在含有DQ-胶原蛋白IV的培养体系中，当侵袭性MDA-MB-231细胞与U937单核细胞共培养时，基质金属蛋白酶（MMP）的转录水平升高，并与胶原蛋白降解增强呈正相关。值得注意的是，我们的共培养实验结果并不支持细胞间相互作用机制是胶原降解所必需的这一假设，反而提示两种细胞谱系间的通讯由分泌性分子介导。此外，从这些共培养体系中收集的上清液含有可溶性因子，能够破坏由未转化的MCF-10A细胞形成的腺泡结构13研究发现，侵袭性及原发性乳腺癌（BrC）细胞分泌的单核细胞趋化分子MCP-1、GM-CSF和RANTES水平升高。因此，我们设计了一种三维培养体系，通过将细胞置于细胞培养小室中实现物理分离，以避免细胞间的直接接触。该培养体系用于研究BrC细胞与单核细胞之间的间接通讯。在这些实验中，采用了非侵袭性和侵袭性的商用BrC细胞系以及原发性BrC细胞，同时使用了三种不同类型的人源单核细胞：商用U937和THP-1细胞，以及从健康供体外周血中分离得到的原代单核细胞（PMs）（所有单核细胞均处于非活化状态）。在共培养体系中，观察到炎症性细胞因子IL-1β和IL-8的浓度显著升高。同样，MMP-1、MMP-2和MMP-10在BrC细胞与单核细胞的共培养体系中也呈现上调，从而进一步支持了先前的研究结果。14本文详细介绍了原代BrC细胞在三维培养中分离与检测的逐步实验流程，并提供了代表性结果。这项工作充分展示了该方法所具备的巨大潜力 体外 三维细胞系统可用于研究肿瘤生物学的特定方面。

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方案

乳腺癌患者的样本来自墨西哥联邦戈麦斯儿童医院病毒学与癌症研究单位的组织库。本研究已获得墨西哥联邦戈麦斯儿童医院科学、伦理和生物安全审查委员会的批准：研究委员会（Comité de Investigación）、研究伦理委员会（Comité de Ética en Investigación）和生物安全委员会（Comité de Bioseguridad）。所有患者均为前瞻性入组，并被告知研究的性质；愿意参与的患者在样本采集前签署了书面知情同意书，并根据该机构的伦理准则和最佳临床实践接受治疗。研究期间对参与者的身份信息进行了匿名化处理。纳入的患者均被诊断为浸润性导管癌，组织学分级为2级，临床分期为II期，且在组织切除前未接受过任何新辅助治疗。所有患者均为女性，平均年龄为56.8岁（范围为42至75岁）14。

1. 三维细胞培养

  1. 将0.1 × 106个MCF-10A细胞或原代BrC细胞接种于25 cm2培养瓶中，使用添加了5%马血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、100 ng/mL霍乱毒素、0.5 µg/mL氢化可的松、10 µg/mL胰岛素和20 ng/mL表皮生长因子（EGF）的DMEM/F12培养基。将0.1 × 106个商业来源的BrC细胞、MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞接种于75 cm2培养瓶中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM/F12培养基。在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育。
  2. 48小时后，用10 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞单层。加入3 mL含0.05%胰蛋白酶和0.48 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的溶液，在37 °C下消化5–10分钟。加入200 µL相应血清以终止消化反应，并加入7 mL不含添加剂的培养基。用移液器吹打重悬细胞，取10 µL细胞悬液用于Neubauer计数板进行细胞计数。
  3. 在8孔腔室载玻片系统的每个孔中，加入40 µL纯ECME作为基底，并在37 °C下孵育30分钟。
  4. 在每个孔中加入800个细胞，细胞重悬于400 µL不含酚红的DMEM/F12培养基中，培养基成分同步骤1.1，但作如下调整：对于原代BrC细胞和MCF-10A细胞，添加4 ng/mL EGF和2% ECME；对于MCF-7和MDA-MB-231细胞，仅添加2% ECME。
  5. 将培养物置于37 °C、含5% CO2的湿化环境中孵育。每48小时更换一次培养基。
  6. 在15天内每隔24小时使用光学显微镜记录细胞的形态学变化。为分析原代BrC细胞的形态，MCF-10A细胞和MDA-MB-231细胞可分别作为有序腺泡结构形成和无序侵袭性癌样结构的良好参照细胞系。
  7. 在100倍和200倍放大倍数下获取明场显微镜图像，并将细胞形态与参照细胞系MCF-10A和MDA-MB-231进行比较（图1）。

2. 从肿瘤组织中获取原代癌细胞

注意： 为获取肿瘤上皮细胞，请使用未经新辅助治疗的乳腺癌患者切除的原发性肿瘤组织；避免坏死区域，并至少使用0.5 cm3的肿瘤组织。

  1. 用无菌 1× PBS 冲洗肿瘤组织，并用手术刀将组织机械解离成 1–2 mm 的碎片。
  2. 将组织置于带盖的无菌 20 mL 玻璃小瓶中，在室温（RT）下用 2 mL 下列溶液消化 2 小时：在含有 100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM/F12 培养基中加入 1 mg/mL I 型胶原酶和 100 U/mL 透明质酸酶，持续搅拌。
  3. 将消化后的悬液通过灭菌的纱网过滤，以去除未消化的大块组织，随后将细胞悬液通过灭菌的 100 µm 孔径滤膜过滤。
  4. 在室温下以 430 × g 离心 5 分钟收集细胞，并用无菌 1× PBS 洗涤两次。将原代细胞培养于添加了 5% 马血清、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、100 ng/mL 霍乱毒素、0.5 µg/mL 氢化可的松、10 µg/mL 胰岛素和 20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）的 DMEM/F12 培养基中。每 48 小时更换一次培养基。将培养物置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。
  5. 采用标准免疫细胞化学方案确认分离的细胞为上皮细胞14。检测三种上皮细胞标志物：广谱细胞角蛋白（PanCK）、黏蛋白-1（Muc-1）和上皮细胞黏附分子（EpCAM）。

3. 从外周血中分离PM细胞

  1. 从健康志愿者体内抽取约 40 mL 外周血，用无菌无内毒素的 1× PBS 按 1:3 比例稀释血液，并进行密度梯度分离。
  2. 在锥形管中加入 2 mL 密度为 1.077 g/mL 的聚蔗糖-泛影酸钠介质，小心且缓慢地将 8 mL 稀释后的血液覆盖于其上层。在室温下以 765 × g 离心 30 分钟，使用离心机最慢的加减速速度。
    注意： 离心后自下而上将形成四层：红细胞沉淀层、密度梯度介质层、单个核细胞层（呈细白色环状）和血浆层。
  3. 用无菌巴斯德吸管小心收集梯度中的单个核细胞层，并用 1× PBS 洗涤三次，每次均在室温下以较慢速度离心（分别为 430、275 和 191 × g）10 分钟。
  4. 采用阴性筛选方案以避免细胞活化。此类方案示例如下：
    1. 用洗涤缓冲液（含 0.5% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA 的 1× PBS）洗涤单个核细胞一次。在血球计数板中计数细胞，并将其调整至每 30 µL 缓冲液中含有 1 × 107 个细胞的密度。
    2. 每 1 × 107 个细胞加入 10 µL FcR 封闭试剂和 10 µL 生物素标记的单核细胞抗体混合物（包含抗人 CD3、CD7、CD16、CD19、CD56、CD123 和血型糖蛋白 A，可从商业试剂盒中获得）。
    3. 混匀细胞，在 4 °C 下孵育 15 分钟；再加入额外的 30 µL 洗涤缓冲液和 20 µL 抗生物素微珠（包含在试剂盒中），混匀后在 4 °C 下继续孵育 20 分钟。
    4. 用缓冲液洗涤细胞一次，在室温下以 430 × g 离心 5 分钟，然后重悬于 1.5 mL 缓冲液中用于磁性分离。
    5. 将细胞悬液加载至预先冲洗过的磁性分离柱上，加入 7 mL 缓冲液。收集富含单核细胞的组分至 15 mL 锥形管中，计数细胞；若不立即培养，则将单核细胞以每 1 mL 含 2 × 106 个细胞的密度重悬于添加了 50% FBS 和 10% DMSO 的 DMEM/F12 培养基中，并在 −80 °C 冻存。
      注意： 避免使用冻存超过两个月的单核细胞，因其活力可能受损。
  5. 将腹膜巨噬细胞（PMs）培养于补充有 6% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM/F12 培养基中，在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中维持培养。
  6. 每组实验应独立使用至少两个不同供体来源的 PMs，因为混合不同供体的单核细胞可能导致细胞活化。

4. 建立三维共培养体系

  1. 间接相互作用的3D共培养
    注意：     在24孔平底培养板中进行这些实验，使用孔径为0.4 µm的聚碳酸酯细胞培养小室。在此实验中，实验结束时可同时回收上清液和细胞。
    1. 在37 °C、5% CO2 湿润环境中，将2 × 106 个U937和THP-1单核细胞在10 mL RPMI 1640培养基（含10% FBS、1%抗生素/抗真菌剂）中培养，并将新鲜分离的PMs在补充了相应成分的DMEM/F12培养基中培养（如步骤3.5所述）。
    2. 将4 × 105 个单核细胞接种至每孔1 mL相应培养基中（U937和THP-1单核细胞培养基中添加2% ECME和2% FBS，PMs则添加2% ECME和6% FBS）。
    3. 在每孔中放入一个培养小室，并在相应培养基中加入0.9 mL含4 × 105 个BrC细胞的细胞悬液（商业细胞系培养基中添加2% ECME和2% FBS，原代BrC细胞则添加5%马血清）。每48小时更换一半培养基。
    4. 在37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育5天后收集上清液。如需后续分析，可通过胰酶消化回收细胞。
    5. 设置各细胞单独培养的对照组，使用相应的培养基。
  2. 直接相互作用的3D共培养
    1. 在细胞培养前，用不同的荧光染料标记BrC细胞和单核细胞，以便在培养后独立分选不同细胞谱系，用于mRNA和蛋白表达分析。使用市售的香豆素和罗丹明衍生物，这些染料可自由穿过活细胞的细胞膜。一般标记步骤如下：
      1. 制备目标BrC细胞的单层（2 × 106 个细胞置于25 cm2 培养瓶中），弃去标准培养基，加入足量预热的荧光染料工作液（荧光染料按1:2,000比例溶于无添加物的标准基础培养基中）。在37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育30分钟。吸除染料溶液，用足量1× PBS轻柔洗涤。吸除PBS后加入标准培养基。
      2. 用2 mL含0.05%胰酶和0.48 mM EDTA的溶液在37 °C消化5–10分钟，使细胞单层脱落。加入200 µL FBS终止消化反应，再加入7 mL无添加物的相应培养基。通过移液重悬细胞。取10 µL细胞悬液，在血球计数板中计数。计数完成后继续进行共培养实验。
      3. 在室温下以430 × g离心5分钟收集细胞（优先进行此步骤，因单核细胞为悬浮生长）。弃去上清液，用3 mL预热的荧光染料工作液（染料按1:2,000比例溶于无添加物的标准基础培养基中）轻柔重悬细胞。在37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育30分钟。
      4. 再次离心收集细胞，弃去染料工作液，用5–7 mL 1× PBS轻柔重悬。再次离心，弃去PBS，用5–7 mL标准培养基重悬细胞。取10 µL细胞悬液在血球计数板中计数。计数完成后继续进行共培养实验。
    2. 按如下方式设置共培养体系：在4孔板系统的每个孔底部均匀铺加适量ECME，形成均匀薄层。每孔接种20 µL含5 × 105 个标记BrC细胞的单细胞悬液。
    3. 在37 °C孵育15–20分钟后，加入含2.5 × 105 个标记单核细胞的80 µL检测培养基（含60% ECME）。
    4. 在37 °C孵育15–20分钟，使ECME凝固。
    5. 加入1 mL BrC细胞与单核细胞培养基按1:1比例混合的培养液。
    6. 在37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育共培养体系24小时、48小时或5天，以追踪不同时间点的变化。
    7. 降解ECM蛋白以回收细胞。吸除并弃去培养基，加入0.5 mL含0.1%胰酶和0.25% EDTA的1× PBS，37 °C孵育3小时。孵育结束后，加入0.5 mL含10% FBS的1× PBS以中和胰酶活性，并剧烈吹打使细胞重悬，获得单细胞悬液。
    8. 在室温下以765 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，用5 mL含10% FBS的1× PBS重悬细胞。重复此步骤一次。
    9. 使用适当的仪器对细胞悬液进行荧光激活细胞分选（FACS），确保最终分选细胞纯度至少达到95%。
    10. 分选后，用无菌1× PBS洗涤细胞，离心（430 × g，5分钟，室温），再用无菌1× PBS重悬。细胞可根据特定实验方案进行RNA提取或蛋白分析。
    11. 每项实验重复三次，并包括各细胞谱系的3D单独培养作为对照。
  3. 通过3D共培养直接相互作用评估胶原降解
    1. 按照步骤4.2建立3D细胞共培养体系，额外步骤为：在ECME中加入终浓度为32.5 µg/mL的异硫氰酸荧光素标记的IV型胶原，使ECME中胶原IV的终浓度为0.5%。将培养物置于放置于培养皿中的35 mm盖玻片上进行培养。
    2. 在培养皿底部铺加40 µL ECME，置于37 °C使其凝固。
    3. 加入10 µL含2.5 × 105 个BrC细胞的培养基，静置使细胞沉降。
    4. 加入含1.25 × 105 个U937单核细胞的40 µL检测培养基（含60% DQ-Collagen IV标记的ECME）。
    5. 在37 °C孵育15–20分钟，使ECME凝固。
    6. 加入2 mL BrC细胞与单核细胞培养基按1:1比例混合的培养液。
    7. 在37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育5天，每48小时更换一次培养基。
    8. 使用共聚焦扫描显微镜分析荧光发射信号，并测量每50 µm2 培养面积的积分光密度（IOD）。将IOD值与单独培养组及零时点培养组进行比较（图2）。

5. 间接相互作用的3D共培养上清液分析

  1. 共培养5天后，收集3D共培养体系中上室和下室的上清液，以及单独的3D培养对照组的上清液。用移液器充分混匀每份上清液，分装后于−20°C保存至使用（最长一个月）。
    注意：若保存时间超过一个月，应将上清液置于−80°C保存。
  2. 采用多重检测平台、酶联免疫吸附测定（ELISA）或基于微球的免疫分析法，按照制造商推荐的操作流程分析上清液。
    注意：上清液也可通过Western blot检测，或使用特定孔径的滤膜进行浓缩，以获得按分子量富集的蛋白组分，进而开展酶谱分析16,17。此外，可将上清液作为条件培养基用于其他实验，具体方法如下所述。条件培养基通常来源于5天的培养（图3）。

6. 原代BrC细胞上清液对腺泡形成及腺泡结构影响的表征

  1. 在8孔板培养系统每个孔中加入40 µL的ECME作为基底，并在37 °C下孵育30分钟使其凝固。
  2. 每孔接种800个MCF-10A细胞，加入400 µL含补充物的DMEM/F12培养基，具体操作如步骤1.2所述。
  3. 每孔加入400 µL条件培养基或含20 ng/mL人重组IL-1β的补充DMEM/F12培养基。
  4. 将培养板置于玻璃培养皿中，并在其中放置一个盛有2 mL PBS的35 mm培养皿，以形成湿润环境。
  5. 每48小时更换一次培养基/上清液。
  6. 连续14天，每隔24小时使用光学显微镜记录腺泡结构的形成情况。
  7. 培养14天后，用100 µL浓度为100 nM的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶于1×PBS中对腺泡进行染色，以观察细胞核。室温下持续振荡孵育25分钟，随后在室温持续振荡条件下用1×PBS漂洗三次，每次5分钟。使用适用于荧光染色的封片剂封片，再用透明指甲油封固，避光保存于4 °C。
  8. 使用共聚焦显微镜对腺泡进行分析，获取腺泡不同深度的横截面层扫图像（图4A, B, C）。
  9. 通过适当的染色方法可视化腺泡中的不同细胞蛋白。例如，使用E-钙黏蛋白（E-cadherin）染色以评估细胞间黏附、细胞极性及/或管腔形成18（图4D）。

7. 迁移实验

注意：使用24孔平底培养板和孔径为8 µm的聚碳酸酯细胞培养小室，对U937、THP-1和新鲜PMs进行迁移实验。先前研究表明，在侵袭性BrC细胞系的个体3D培养物中，可检测到GM-CSF、MCP-1和RANTES等趋化因子以高浓度分泌。这些细胞因子被认为在募集单核细胞至原发性肿瘤部位过程中起关键作用；本研究通过以这些细胞因子作为趋化剂的迁移实验对此进行了验证。

  1. 按照步骤4.1.1所述培养U937、THP-1或新鲜PMs。
  2. 用200 µL不含血清的RPMI 1640溶液冲洗每个插入物一次，以润湿膜。
  3. 向其中加入50 µL冷的ECME，将插入物置于24孔平底培养板中，并在37 °C下孵育1小时，使ECME聚合。
  4. 在培养板的上室中加入180 µL不含FBS的RPMI；在下室中轻柔加入800 µL含100 ng/mL GM-CSF、MCP-1或RANTES作为趋化因子的RPMI，避免产生气泡。以不含细胞因子的培养基作为空白对照。在37 °C下孵育30分钟，建立趋化因子梯度。
  5. 将每种单核细胞各1.5 × 105个置于无菌离心管中，用1 mL 1× PBS洗涤两次，于室温下以430 × g离心5分钟。用20 µL不含FBS的RPMI重悬单核细胞，将其加入插入物中，并小心混匀细胞悬液（上室最终体积为200 µL）。
  6. 在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育24小时，使细胞迁移进行。
    注意：由于单核细胞为非贴壁性迁移细胞，迁移后的细胞通常位于下室培养基中。
  7. 取出插入物，收集下室培养基，使用血细胞计数板或流式细胞仪在2、4、6和24小时时间点计数细胞；或者，特别是在培养基中未发现细胞的情况下，使用数码相机拍摄插入物底部的图像。分析时取三个随机视野（100倍放大）的平均细胞数（图5）。

8. 侵袭实验

注意：使用24孔平底培养板和孔径为8 µm的聚碳酸酯细胞培养小室进行BrC细胞的侵袭实验。在我们最初的研究中，IL-8是BrC细胞与单核细胞三维共培养上清液中富集的细胞因子之一。本实验旨在验证该细胞因子是否参与了BrC细胞系的侵袭过程。

  1. 在75 cm2培养瓶中扩增BrC细胞。MCF-7、T47D、HS578T和MDA-MB-231细胞的培养方法如步骤1.2所述（但不添加ECME），原代BrC细胞的培养方法如步骤2.4所述。
  2. 用200 µL无血清培养基（培养基种类取决于所测试的细胞系）洗涤每一片聚碳酸酯8 µm孔径的细胞培养小室插入物，以润湿膜表面。
  3. 向插入物中加入50 µL冷的ECME（按1:4比例稀释的ECME:无FBS冷培养基），将插入物放入24孔平底培养板中，在37 °C下孵育1小时，使ECME聚合。
  4. ECME聚合完成后，在插入物内加入180 µL不含FBS的相应细胞培养基，并通过插入物的切口加入800 µL不含FBS的培养基。在37 °C下孵育30分钟，以建立IL-8浓度梯度。
    注意：避免在培养基中产生气泡。所用培养基不含FBS，但添加100 ng/mL IL-8作为趋化因子；或仅使用不含FBS的纯培养基作为阴性对照。
  5. 按以下步骤获取每种细胞系共6 × 105个细胞：
    1. 弃去上清液，用10 mL 1× PBS冲洗一次，加入2 mL含0.05%胰蛋白酶/0.48 mM EDTA的溶液，在37 °C下作用2分钟以消化贴壁细胞。加入4 mL含血清的完全培养基终止胰酶反应，并通过移液剧烈重悬细胞。
  6. 取10 µL细胞悬液，在Neubauer计数板中进行细胞计数。取含有6 × 105个细胞的细胞悬液体积，于室温下以430 × g离心5分钟，弃去上清液，用1 mL 1× PBS重悬细胞并清洗一次。重复清洗一次。
  7. 将细胞重悬于20 µL不含FBS的相应培养基中，加入已含有180 µL不含FBS相应培养基的插入物中。通过移液小心混匀细胞悬液。
  8. 将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中，孵育48小时，使细胞侵袭过程进行。
  9. 48小时后，取出插入物，弃去上清液，并用200 µL 1× PBS极其小心地冲洗插入物一次。用棉签轻轻吸除多余的PBS。
    注意：侵袭性细胞通常附着在插入物膜的另一侧，尤其是在细胞为贴壁型的情况下。
  10. 将插入物放入含有1 mL/孔4%多聚甲醛的24孔平底培养板中，室温固定15分钟。随后，用1× PBS冲洗插入物一次。
  11. 将插入物放入含有1 mL/孔含0.2%结晶紫的1× PBS溶液的24孔平底培养板中，室温染色45分钟。用棉签小心地从膜上表面去除未迁移细胞所在的ECME层，并用蒸馏水极其小心地冲洗，以避免冲走已固定的侵袭细胞。
  12. 在倒置显微镜下观察插入物的下表面，对侵袭细胞进行计数。取3个随机视野（100倍放大）的平均细胞数作为结果。当细胞以簇状侵袭且难以单独计数时，使用数码相机获取3个随机视野（100倍放大）的图像。利用图像分析软件对图像进行分析，并采用IOD值定量细胞侵袭能力（图6）。

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结果

三维培养中 BrC 细胞的形态学分析：

在低密度和高密度条件下，对三维培养中原代BrC细胞的形态进行了为期5天的观察。在培养的前48小时内，细胞附着于ECME并保持低密度状态。此时可明显观察到细胞呈细长的梭形，部分细胞具有两个或多个细长的胞质突起，且未见明显的细胞间接触。培养5天后，细胞在保持初始形态的同时发生增殖。此外，它们形成了类似网状的结构，但无特定的空间组织排列，并呈现出堆积生长、缺乏接触抑制的特征。研究同时与非转化的MCF-10A细胞进行了对比，后者可形成类似腺泡的球形结构，表现为大小均一（约50 µm）、边界清晰且排列有序的典型圆形结构。相比之下，原代BrC细胞的形态特征与侵袭性较强的BrC细胞MDA-MB-231更为相似（图1）。

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讨论

上皮细胞以三维空间构象生长，其与细胞外基质（ECM）蛋白的相互作用对组织稳态至关重要。许多癌症研究基于在单层（2D）培养的细胞，尽管这些研究对理解肿瘤形成与进展的诸多方面具有关键作用，但单层培养无法重现细胞外基质赋予细胞的特性，例如：增殖受限、依赖黏附的细胞存活、顶-基底极性、细胞外基质重塑、细胞分化 等等。 重要的是，不仅肿瘤细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用对癌症进展至关重要，肿瘤细胞与非肿瘤细胞（如免疫细胞）之间的通讯也同样关键。本文提供的实验方案有助于理解在细胞外基质所构建的微环境中免疫细胞与癌细胞之间的相互作用、这些相互作用所引发的炎症反应，以及这种炎症状态如何形成正反馈循环，促进单核细胞的趋化募集和癌细胞的进一步侵袭。

使用ECME的一大优势在于其可提供一种适合构建多种实验性三维模型的生物支架22富含细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、entactin、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）以及生长因子，这些成分 体内 将与上皮细胞相互作用。其缺点在于，由于该物质来源于小鼠肉瘤的裂解物，...

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披露

作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

本工作由 CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE 项目（编号 233061）资助 Ezequiel M. Fuentes-Pananá，以及由墨西哥联邦儿童医院 Federico Gómez 研究支持基金（项目编号 HIM-2014-053）资助。Espinoza-Sánchez NA 是墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学科学博士项目在读博士生，并获得 CONACYT 编号为 231663 的奖学金。E-S NA 还感谢墨西哥社会保险研究所（IMSS）提供的财政支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
U937American Type Culture Collection ATCC CRL-1593.2单核细胞系/组织细胞淋巴瘤 
THP-1American Type Culture Collection ATCC TIB-202单核细胞系/急性单核细胞白血病 
MCF-10AAmerican Type Culture Collection ATCC CRL-10317非转化乳腺细胞系
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22乳腺癌细胞系
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133乳腺癌细胞系
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126乳腺癌细胞系
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26乳腺癌细胞系
RPMI 1640 培养基GIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM 高糖 GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L 葡萄糖
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
抗生素/抗真菌剂GIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，以及 0.25 µg/mL 两性霉素B
胎牛血清GIBCO BRL Life Technologies16000-044
马血清 GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X（磷酸盐缓冲液）GIBCO BRL Life Technologies20012-027
表皮生长因子（EGF）PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
胰岛素SIGMA-ALDRICHI1882-100MG
氢化可的松SIGMA-ALDRICHH088-5G
霍乱毒素 霍乱弧菌SIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤，细胞外基质提取物，-20°C 保存，使用前置于 4°C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
结晶紫Hycel México541
多聚甲醛SIGMA-ALDRICHP6148
Transwell 可渗透支持膜（插入式）Corning Inc34226.5 mm 直径，8 µm 孔径/24孔板 
Transwell 可渗透支持膜（插入式）Thermofisher Scientific1406206.5 mm 直径，0.4 µm 孔径/24孔板 
人单核细胞分离试剂盒 II Miltenyi Biotec130-091-153
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
人细胞因子/趋化因子磁珠检测试剂盒（96孔板）EMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix 荧光分析系统及 xPonent 软件（基于激光的荧光分析仪器）Luminex Corporation40-072
Lab-Tek 带盖腔室载玻片（8孔）Nalge Nunc International177402
玻璃底微孔 35 mm 培养皿 MatTek Corp.P35G-1.5-14-C

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