本文介绍了一种三维培养方法，用于分析原代乳腺癌细胞的形态，以及研究它们与单核细胞的直接/间接相互作用及其结果，例如胶原降解、免疫细胞募集、细胞侵袭和促进癌症相关炎症。
方法文章
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本文介绍了一种三维培养方法，用于分析原代乳腺癌细胞的形态，以及研究它们与单核细胞的直接/间接相互作用及其结果，例如胶原降解、免疫细胞募集、细胞侵袭和促进癌症相关炎症。
嵌入于细胞外基质（ECM）中的正常及肿瘤性上皮细胞与造血和非造血细胞密切相互作用，从而显著影响正常组织稳态及疾病进程。在乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在疾病进展、转移和复发中发挥关键作用；因此，阐明单核细胞向肿瘤微环境趋化的机制及其与肿瘤细胞的相互作用，对于控制疾病具有重要意义。本文详细描述了一种人乳腺癌（BrC）细胞与人单核细胞的三维（3D）共培养体系。BrC细胞基础状态下可高水平分泌活化调节因子、正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF）；而在与单核细胞共培养时，促炎性细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-8，以及基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-2和MMP-10的表达均显著上调。该肿瘤间质微环境可促进MCF-10A细胞形成的3D腺泡样结构抵抗失巢凋亡，诱导单核细胞趋化，并增强侵袭性BrC细胞的侵袭能力。本文所提供的实验方案为研究肿瘤内部通讯提供了一种经济可行的替代方法，并展示了其在肿瘤生物学研究中的巨大潜力。 体外 三维细胞系统可用于研究与肿瘤侵袭性相关的肿瘤生物学特定特征。
肿瘤生物学远比此前认为的更为复杂。越来越多的证据表明，肿瘤细胞不仅仅是无限制增殖的细胞团；相反，不同的肿瘤细胞似乎执行着不同的功能，在肿瘤内部呈现出高度的组织性和层次性1。肿瘤细胞还与非转化细胞密切交流：巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、内皮细胞等均浸润于构成细胞外基质（ECM）的支架蛋白和多糖网络之中。转化细胞与非转化细胞之间以及这些细胞与ECM之间建立了大量直接和间接的相互作用，这些相互作用对疾病的发展进程具有重要影响2,3。以乳腺癌（BrC）为例，尤其重要的是解析BrC细胞与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）之间的通讯机制，因为已有研究发现，TAMs在肿瘤进展中发挥关键作用，可增加转移和疾病复发的风险4,5。
为了分析肿瘤内部的相互作用及其可能的结果，研究人员已开发出基于细胞外基质（ECM）提取物的新型三维体外模型，相较于传统的单层细胞培养（细胞贴附于塑料表面生长），这些模型提供了更为复杂的微环境，更接近肿瘤生物学的真实情况。Petersen 和 Bissell6首次建立了在富含层粘连蛋白的基底膜上培养良性和恶性乳腺上皮细胞....
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乳腺癌患者的样本来自墨西哥联邦戈麦斯儿童医院病毒学与癌症研究单位的组织库。本研究已获得墨西哥联邦戈麦斯儿童医院科学、伦理和生物安全审查委员会的批准：研究委员会（Comité de Investigación）、研究伦理委员会（Comité de Ética en Investigación）和生物安全委员会（Comité de Bioseguridad）。所有患者均为前瞻性入组，并被告知研究的性质；愿意参与的患者在样本采集前签署了书面知情同意书，并根据该机构的伦理准则和最佳临床实践接受治疗。研究期间对参与者的身份信息进行了匿名化处理。纳入的患者均被诊断为浸润性导管癌，组织学分级为2级，临床分期为II期，且在组织切除前未接受过任何新辅助治疗。所有患者均为女性，平均年龄为56.8岁（范围为42至75岁）14。
1. 三维细胞培养
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三维培养中 BrC 细胞的形态学分析：
在低密度和高密度条件下，对三维培养中原代BrC细胞的形态进行了为期5天的观察。在培养的前48小时内，细胞附着于ECME并保持低密度状态。此时可明显观察到细胞呈细长的梭形，部分细胞具有两个或多个细长的胞质突起，且未见明显的细胞间接触。培养5天后，细胞在保持初始形态的同时发生增殖。此外，它们形成了类似网状的结构，但无特定的空间组织排列，并呈现出堆积生长、缺乏接触抑制的特征。研究同时与非转化的MCF-10A细胞进行了对比，后者可形成类似腺泡的球形结构，表现为大小均一（约50 µm）、边界清晰且排列有序的典型圆形结构。相比之下，原代BrC细胞的形态特征与侵袭性较强的BrC细胞MDA-MB-231更为相似（图1）。
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上皮细胞以三维空间构象生长，其与细胞外基质（ECM）蛋白的相互作用对组织稳态至关重要。许多癌症研究基于在单层（2D）培养的细胞，尽管这些研究对理解肿瘤形成与进展的诸多方面具有关键作用，但单层培养无法重现细胞外基质赋予细胞的特性，例如：增殖受限、依赖黏附的细胞存活、顶-基底极性、细胞外基质重塑、细胞分化 等等。 重要的是，不仅肿瘤细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用对癌症进展至关重要，肿瘤细胞与非肿瘤细胞（如免疫细胞）之间的通讯也同样关键。本文提供的实验方案有助于理解在细胞外基质所构建的微环境中免疫细胞与癌细胞之间的相互作用、这些相互作用所引发的炎症反应，以及这种炎症状态如何形成正反馈循环，促进单核细胞的趋化募集和癌细胞的进一步侵袭。
使用ECME的一大优势在于其可提供一种适合构建多种实验性三维模型的生物支架22富含细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、entactin、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）以及生长因子，这些成分 体内 将与上皮细胞相互作用。其缺点在于，由于该物质来源于小鼠肉瘤的裂解物，.......
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作者声明不存在任何利益冲突。
本工作由 CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE 项目（编号 233061）资助 Ezequiel M. Fuentes-Pananá，以及由墨西哥联邦儿童医院 Federico Gómez 研究支持基金（项目编号 HIM-2014-053）资助。Espinoza-Sánchez NA 是墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学科学博士项目在读博士生，并获得 CONACYT 编号为 231663 的奖学金。E-S NA 还感谢墨西哥社会保险研究所（IMSS）提供的财政支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | 单核细胞系/组织细胞淋巴瘤 |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | 单核细胞系/急性单核细胞白血病 |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | 非转化乳腺细胞系 |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | 乳腺癌细胞系 |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | 乳腺癌细胞系 |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | 乳腺癌细胞系 |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | 乳腺癌细胞系 |
| RPMI 1640 培养基 | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM 高糖 | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L 葡萄糖 |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| 抗生素/抗真菌剂 | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，以及 0.25 µg/mL 两性霉素B |
| 胎牛血清 | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| 马血清 | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X（磷酸盐缓冲液） | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| 表皮生长因子（EGF） | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| 胰岛素 | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| 氢化可的松 | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| 霍乱毒素 霍乱弧菌 | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤，细胞外基质提取物，-20°C 保存，使用前置于 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| 结晶紫 | Hycel México | 541 | |
| 多聚甲醛 | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell 可渗透支持膜（插入式） | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm 直径，8 µm 孔径/24孔板 |
| Transwell 可渗透支持膜（插入式） | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm 直径，0.4 µm 孔径/24孔板 |
| 人单核细胞分离试剂盒 II | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 人细胞因子/趋化因子磁珠检测试剂盒（96孔板） | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix 荧光分析系统及 xPonent 软件（基于激光的荧光分析仪器） | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek 带盖腔室载玻片（8孔） | Nalge Nunc International | 177402 | |
| 玻璃底微孔 35 mm 培养皿 | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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