本文描述了一种利用荧光标记的DNA探针对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记的方法，用于大肠杆菌（E. coli）中的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验。smFISH是一种可视化技术，可在固定的单个细胞中同时检测、定位并定量单个mRNA分子。
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本文内容
摘要
摘要
一种用于在固定细菌中对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记以用于单分子荧光检测的方法 原位 杂交（smFISH）实验在 E. coli单分子荧光原位杂交（smFISH）可用于测量目的基因在单个细胞间的mRNA拷贝数变异，以及转录本的亚细胞定位。该方法主要包括细菌培养物的固定、细胞膜的通透化处理，以及使用商业化短片段荧光标记寡核苷酸探针与靶标转录本进行杂交。smFISH可实现同一细胞内多个基因转录本的成像，但其多重检测能力受限于不同荧光标记物之间的光谱重叠。完成下文所示实验流程后，可利用配备适合弱荧光成像相机的显微镜对细胞进行成像。结合相位差图像分割获得的细胞轮廓或细胞膜染色结果，这些图像可通过开源或自定义软件分析，计算出细胞群体中mRNA拷贝数的分布情况。本文所述标记方法亦可用于随机光学重建显微镜（STORM）对转录本进行成像。
引言
基因表达中的随机性是一种基本且不可避免的特性，它导致了单个细胞之间在转录本和蛋白质水平上均存在异质性1，这种异质性既体现在转录本层面，也体现在蛋白质层面2,3。在明确定义的条件下量化细胞间的变异，为研究基因表达及其调控背后的基本过程提供了一个独特的窗口。在细菌中，细胞间异质性的一个重要来源发生在转录水平。转录本数量的波动不仅源于转录过程的随机性，还受到小RNA和RNA酶等介导的转录后调控过程的影响2。一种以定量方式直接检测此类异质性的方法是在单分子荧光原位杂交（smFISH）中对特定基因的单个转录本进行荧光标记。该方法能够在固定的单个细菌细胞中检测特定RNA分子并确定其亚细胞定位4。mRNA通过一组设计为特异性结合目标转录本的、约20个碱基长度的荧光标记寡核苷酸进行杂交5,6。多重标记确保信号高于背景荧光水平，单个mRNA分子在荧光显微镜下呈现为衍射极限的亮点7（见图1）。此外还有其他标记mRNA分子的方法，其中互补的....
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方案
1. 探针设计
注意：本方案使用已商业化的、预先标记有荧光染料的寡核苷酸探针。这些探针包含一组与目标 mRNA 互补的特异性序列，每条探针均偶联一个荧光分子。此外，也可按照其他文献所述方法将荧光标记物连接至探针5,16。
- 使用设计smFISH探针 探针设计工具16 由麻省理工学院 Arjun Raj（van Oudenaarden 实验室）开发的算法；本文所用 smFISH 探针序列列于材料表中。
注意：一组探针中产生可检测信号的最少探针数约为30。该精确数目可能因目标基因而异，特别是当检测非常短的转录本时。 - 选择适合光学装置的染料（参见材料表）。
注意：强烈推荐使用Cy3染料或光学性质等效且抗光漂白性能较强的染料。用于双重标记的候选染料为Cy5或光学性质等效的染料（参见材料表）。适用于标记mRNA的STORM成像的染料，其特征在于能够进行多轮荧光发射。某些smFISH染料可用于STORM成像（参见材料表）。若要在同一细胞中对两个（或更多）对应于不同基因的转录本进行成像，应选择偶联染料的寡核苷酸探针，其染料光谱应尽可能无重叠或重叠极少。
2. 试剂准备
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结果
我们对 galK 和 sodB 转录本进行了单分子荧光原位杂交（smFISH）检测 E. coli 细胞。转录本与一组特异性序列杂交，这些序列互补于目标序列，每种探针均偶联一个荧光分子（参见材料表）。MG1655野生型的荧光与相差图像 E. coli 野生型（WT）或 JW0740（Keio 菌种库）19 galK 缺失菌株（ΔgalK) 暴露于 2 mM D-岩藻糖的样本显示于 图1A 和 1B细胞在暴露于D-岩藻糖后至少3 h进行固定。图中各面板 图1A （上图）显示13帧中的一帧，对应于细胞轮廓清晰对焦的高度，代表该层面的 galK 在不同浓度的胞外D-岩藻糖刺激下的诱导情况。荧光图像中细胞内的斑点对应于单个或少数几个galk转录本，每个细胞中转录本数量的确定通过定量局部荧光信号完成。当向细菌培养.......
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讨论
我们在实验室中使用单分子荧光原位杂交（smFISH）方法测量了大肠杆菌（E. coli）细胞中不同基因的转录本数量2。简而言之，该实验流程包括以下步骤：细胞固定、膜通透化以允许探针进入、探针杂交，以及利用标准荧光显微镜对样品成像。本方法基于先前已发表的方法，并进行了部分改进6,7,16。已有研究报道，为获得显著高于背景的信号，smFISH要求寡核苷酸探针的数量应处于48–72的范围内7。我们已证明，该数量实际上可能更少20，具体取决于目标基因序列、光学装置配置以及特定的实验条件。
每个探针的长度应为17-22个核苷酸，探针之间的间隔至少为两个核苷酸，GC含量约为45%，以减少非特异性、脱靶结合的影响。某些探针可能无法与目标结合，而结合的整.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由以色列科学基金会资助项目514415（资助J.S.）以及BSF-NSF（MCB）资助项目2016707（资助J.S.）支持。同时感谢Siegfried和Irma Ullman讲席教授基金（资助J.S.）提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 右旋糖酐硫酸钠盐 | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| 纯乙醇，99.5%，ACS级，无水 | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| 无RNase 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| 无RNase 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）BioUltra，分子生物学用 | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| 无核酸酶水 | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| 分子生物学用甲醛溶液，36.5-38%水溶液 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 去离子甲酰胺，无核酸酶 | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| 大肠杆菌tRNA（转移型核糖核酸，来自大肠杆菌） | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA（50 mg/ml） | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| 钒酰-核糖核苷复合物（VRC），200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P4707 | |
| 半胱胺和氧气 | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| 黑曲霉来源葡萄糖氧化酶，VII型，50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-岩藻糖 | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO 细胞标记溶液 | Life Technologies | V2286 | |
| 低熔点琼脂糖，试剂级 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| 粘性硅胶隔离器 24-2mm 直径 × 1.8 mm 深度 JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| 聚-D-赖氨酸包被玻璃底培养皿 | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life 丁腈无粉检查手套 | Supermax | TC-N-9889 | |
| 品牌灭菌培养箱胶带 | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| 微量离心管（1.8 ml） | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon 圆底聚丙烯管（14 ml） | BD Biosciences | 352059 | |
| 锥底聚丙烯离心管（50 ml） | Corning | 430828 | |
| 移液管（Corning 5 ml） | Corning Life Sciences | 4051 | |
| 移液管（Corning 10 ml） | Corning Life Sciences | 4488 | |
| 移液管（Corning 25 ml） | Corning Life Sciences | 4251 | |
| 分光光度计比色皿 | Sarstedt | 67.742 | |
| 无RNase移液器吸头 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| 无RNase移液器吸头 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| 无RNase移液器吸头 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| 无RNase移液器吸头 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| 一次性注射器 10 mL 针头 G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 μm 注射式滤器 | Sartorius | 16534 K | |
| 尼康仪器显微镜专用浸油 A型，8cc | Nikon | MXA20233 | |
| 显微镜载玻片 76×26，3"×1"×1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 盖玻片 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| 旋转摇床 | M.R.C | TOU-50 | |
| 加热金属块 | M.R.C | ||
| 涡旋振荡器 | Fried Electric Company | G-560-E | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5427R | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 便携式移液控制器 Pipet-Aid XP2 | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| 用于细菌生长速率测定的OD600分光光度计（DiluPhotometer） | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD相机 | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti 显微镜 | Nikon | MEA53100 | |
| CFI 平场复消色差 DM 100X 油镜 lambda PH-3 数值孔径 1.45 工作距离 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| 滤光片组（TRITC/CY3）：激发 - ET545/30X；发射 - ET620/60M；二向色镜 - T570LP | Nikon | 49005 | |
| 滤光片组（CY5）：激发 - ET640/30X；发射 - ET690/50M；二向色镜 - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR 自动研究软件 | Nikon | MQS31000 | |
| STORM 显微镜 | Vutara | SR-200 | |
| 数值孔径 1.2 水浸物镜 | Olympus | ||
| SRX 图像采集与分析软件 | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD相机 | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH 探针，定制检测，含 CAL Fluor® Red 590 染料 | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| galK mRNA 探针序列： | |||
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| Stellaris® FISH 探针，定制检测，含 Quasar Fluor® Red 670 染料 | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
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参考文献
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14)....
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