通过延时荧光显微镜在贴壁细胞培养中对蛋白质降解速率进行单细胞定量分析

摘要

本方案描述了一种利用脉冲标记和SNAP-标签融合蛋白的荧光延时成像，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。

摘要

蛋白质处于合成与降解的动态平衡状态，其半衰期可在不同条件下发生调节。然而，目前常用的测定蛋白质半衰期的方法大多仅限于裂解细胞获得的群体平均值，或需要使用蛋白质合成抑制剂。本实验方案描述了一种利用SNAP-tag融合蛋白结合荧光时间延时显微镜技术，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。任何与SNAP-tag融合的目标蛋白均可共价结合一种带有苯甲基鸟嘌呤衍生物的荧光、可穿透细胞的染料，在洗去残留染料后，可监测标记蛋白群体的信号衰减过程。随后通过细胞追踪并量化随时间变化的总荧光强度，可为每个被追踪的细胞生成一条指数衰减曲线，进而通过曲线拟合确定单个细胞中蛋白质的降解速率。该方法能够估算培养细胞群体中半衰期的异质性，而这种异质性难以通过其他方法轻易评估。本文所述方法适用于表达SNAP-tag融合蛋白的任何类型的培养贴壁细胞。本文以生长在E-钙黏蛋白包被培养板上的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）为例，展示如何测定具有广泛不同半衰期的蛋白质在单细胞水平的降解速率。

引言

众所周知，细胞蛋白质会经历广泛的更新，其合成和降解速率对每种蛋白质具有特异性，并受到生理条件的调控。传统上，蛋白质降解速率的测定依赖于群体水平的方法，例如放射性脉冲追踪分析，或使用蛋白质合成抑制剂（如环己酰亚胺）¹。近年来，细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）结合质谱技术已被建立，用于在全基因组范围内定量蛋白质更新速率²。然而，这些方法受限于对细胞群体的平均化处理，因而丢失了单个细胞之间的变异信息。此外，对于在细胞群体中不同步发生的蛋白质降解的瞬时变化，这些方法也无法识别。

或者，也可采用基于荧光的方法测定蛋白质半衰期，此类方法通常具有单细胞分辨率的优势。例如，已有研究利用光激活型绿色荧光蛋白（paGFP）测定早期哺乳动物胚胎中Oct4的半衰期³另一种在活细胞中监测蛋白质降解的方法是使用SNAP标签结合荧光延时成像技术。SNAP标签是DNA修复酶O⁶-烷基鸟嘌呤DNA-烷基转移酶（AGT），可特异性地与苯甲基鸟嘌呤（BG）衍生物反应，后者可偶联至分子探针^4,5,6因此，任何与SNAP-标签融合的蛋白均可与一种荧光性、可穿透细胞的染料发生不可逆标记。对目标蛋白与SNAP-标签的融合蛋白进行脉冲标记，随后洗去残留染料，即可监测被标记蛋白群体的降解过程，从而测定蛋白的半衰期。SNAP-标签已成功应用于贴壁细胞培养中蛋白的脉冲-追踪标记及蛋白半衰期的测定 体内^5,7,8,9市面上有多种商业化的SNAP-tag底物，覆盖了常用的荧光光谱范围，可根据每种特定应用选择最合适的荧光染料。因此，SNAP-tag可与其他荧光融合蛋白或染料联用，实现多色成像。细胞不可渗透性染料适用于膜锚定蛋白的标记，而细胞可渗透性染料则可用于检测细胞内蛋白和膜结合蛋白。此外，部分探针在未结合SNAP-tag时几乎不产生本底荧光，仅在与SNAP-tag结合后才发出强烈的荧光信号。¹⁰.

本方案描述了如何利用SNAP标签在单细胞水平上测量不同目的蛋白的降解速率。本文中，我们将该方法应用于培养在E-钙黏蛋白上的小鼠胚胎干细胞（ES细胞），但该方法也可用于任何贴壁培养的细胞类型。我们证明，对SNAP标签融合蛋白进行脉冲标记，随后进行荧光延时成像，可测定各种目的蛋白在单细胞中的半衰期，并可评估培养细胞群体中细胞间半衰期的变异性。

方案

注意：本研究中使用了 E14 ES 细胞系。然而，该方案可直接适用于任何其他表达目标蛋白与 SNAP-tag 融合的鼠源 ES 细胞系，无论是通过标记内源蛋白还是通过过表达实现。在结果部分展示的示例中，使用了多西环素诱导型 SNAP-tag 融合细胞系（SNAP-tag 与以下蛋白融合：Nanog、Oct4、Srsf11 或荧光蛋白 mOrange2 和 sfGFP，并由多西环素诱导型启动子调控。有关用于构建多西环素诱导型 SNAP-tag 融合细胞系的质粒的更多信息，请参见¹¹）。多西环素诱导系统尤为有用，因其可严格控制目标蛋白表达的时间和强度。建议将 SNAP-tag 置于蛋白的 C 末端，因为改变 N 末端氨基酸序列更可能影响目标蛋白的半衰期（N 端规则¹²）。

1. E-钙黏蛋白包被及细胞接种

1. 生成表达目标蛋白与SNAP标签融合的ES细胞系⁴.
2. 用 4 mL 0.1% 明胶（溶于不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）中）包被 100 mm 细胞培养皿²⁺/毫克²⁺孵育1小时。去除明胶，室温干燥1小时。立即使用，或将包被的培养皿在2个月内储存备用。
3. 在明胶包被的培养皿中，使用胚胎干细胞培养基（GMEM，添加10% 胚胎干细胞专用胎牛血清、2 mM 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸、1% 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、100 µM 2-巯基乙醇、白血病抑制因子（LIF）、3 µM CHIR99021 和 0.8 µM PD184352），于37 °C、5% CO₂条件下培养目标细胞系₂ 培养2天，直至每个培养皿细胞汇合度达到1000万至2000万个细胞。
   注意：此处的LIF通过瞬时转染HEK 293T细胞后收集上清液并过滤制备。每批LIF均经过测试其维持多能性的能力，但未测定浓度。然而，重组LIF也可从商业途径获得，常用于小鼠胚胎干细胞培养的浓度为1000 units/mL¹³.
4. 用适用于成像的96孔板，每孔加入30 µL重组小鼠E-cadherin Fc嵌合蛋白（E-cad-Fc）（5 ng/µL，用含Ca²⁺的PBS稀释）进行包被²⁺/毫克²⁺使用100 ng/µL的储存浓度，保存于-80 °C。避免反复吹打，因为E-cad-Fc非常脆弱。在37 °C孵育1.5小时。
   注意：根据显微镜的不同，可能会使用其他格式。
5. 吸去E-cad-Fc，用100 µL含Ca的PBS洗涤一次²⁺/毫克²⁺，加入100 µL预热的ES细胞培养基。
6. 用不含 Ca 的 5 mL PBS 洗涤目标细胞²⁺/毫克²⁺吸弃上清，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育4分钟。加入4 mL ES细胞培养基，重悬细胞，1000 × g离心4分钟。吸弃上清，将沉淀重悬于2 mL新鲜ES细胞培养基中。
   注意：不含 Ca 的 PBS²⁺/毫克²⁺ 应使用其在胰蛋白酶消化前洗涤细胞，以去除 Ca²⁺ 离子，这些离子是细胞黏附所必需的。相比之下，在E-cad-Fc稀释与包被（步骤1.4）时，应使用含Ca²⁺的PBS²⁺/毫克²⁺，因为 ES 细胞在 E-cad-Fc 包被的培养皿上的黏附依赖于 Ca²⁺-依赖的¹⁴.
7. 将重悬的细胞用1 mL ES细胞培养基按1:10稀释，使用计数板计数（加载10 µL至深度为0.1 mm的计数室）。
8. 每平方厘米接种30,000个细胞² 在E-cad-Fc包被的成像板中，每孔加入至200 µL ES细胞培养基。对于可诱导型多西环素（doxycycline）细胞系，使用适当浓度的多西环素进行诱导（需预先优化诱导剂量与时间；本实验所用细胞系在成像前24 h以500 ng/mL多西环素处理）。于37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 在细胞接种后24小时进行脉冲标记和成像。

2. SNAP标签的脉冲标记

注意：进行蛋白质降解实验时，使用适当的SNAP染料浓度至关重要。染料浓度应足够高，以确保在时间序列成像初期获得明亮的荧光信号，因为荧光会随着时间推移而减弱。然而，若染料浓度过高，即使经过洗涤步骤，仍可能有残余染料留在培养基或细胞内。这些游离染料可能在后续成像过程中与新合成的SNAP标签蛋白结合，从而干扰降解曲线的准确性。所观察到的荧光信号强度取决于染料的特性、所使用的细胞系以及相应蛋白的表达水平。因此，必须通过测试不同稀释度来优化染料浓度，起始浓度可参考生产商推荐用于活细胞成像的稀释比例。本研究中使用了一种远红荧光底物，针对强力霉素诱导型过表达细胞系，确定最佳浓度为12 nM。

1. 将 SNAP 染料用预热的 ES 细胞培养基稀释至适当浓度。用移液器轻轻吸去先前接种于 96 孔板中细胞的培养基，每孔加入 50 µL 稀释后的 SNAP 染料。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
2. 用移液器吸去稀释的染料，用 200 µL 预热的不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 洗涤 3 次。每孔加入 200 µL ES 细胞培养基，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
3. 重复上述洗涤步骤两次。
   注意：充分洗涤对于去除未结合的染料至关重要。通过 PBS 多次洗涤可去除培养基中残留的胞外染料，而每次 15 分钟的孵育则可确保在开始成像实验前 SNAP-tag 融合蛋白被稳定标记。然而，洗涤操作应使用轻柔的移液操作，避免使用自动吸液装置，因为接种在 E-cad-Fc 上的细胞容易脱落。
4. 加入 200 µL 成像培养基。为降低荧光背景，使用不含酚红的培养基（补充 10% 经 ES 细胞验证的胎牛血清、2 mM 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸、1% 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、100 µM 2-巯基乙醇、LIF、3 µM CHIR99021 和 0.8 µM PD184352）。

3. 时间序列显微镜观察

1. 使用适用于活细胞成像的显微镜，确保可控制温度和 CO₂ 浓度。使用前将温度设置为 37 °C，CO₂ 浓度设置为 5%，并预热平衡 1 - 2 小时。
2. 将培养板放入显微镜中，选择适合成像的视野。应选择细胞分布均匀但不过于密集的区域，以利于后续分析。根据分析所需的细胞数量调整所选视野的数量。本研究中，每种细胞系记录 3 - 5 个视野。
3. 选择物镜。对于胚胎干细胞（ES 细胞）的尺寸，20X 物镜是合适的。
4. 选择待记录的荧光通道照明参数。根据目标细胞的荧光信号强度调整激光功率和曝光时间。应确保获得较强的初始信号，因为信号在成像过程中会逐渐减弱；但应避免使用超过 30% 的激光功率，以尽量减少光毒性和光漂白。本研究中采用的参数为：激发滤光片 632/22 nm（波长/带宽），发射滤光片 679/34 nm（波长/带宽），激光功率 10%，曝光时间 100 ms。
5. 设置延时成像的时间间隔和总时长。对于预期半衰期为 2 - 20 小时的蛋白质，建议采集时间为 12 - 24 小时，时间间隔为 15 分钟。对于寿命较短的蛋白质，应缩短时间间隔和采集时间；对于寿命较长的蛋白质，则相应延长。
6. 开始成像。

4. 图像处理与分析

1. 以 TIFF 格式将采集的图像作为图像栈收集。为进行后续处理和分析，请使用 FIJI 软件¹⁵。如果显微镜软件未将延时数据采集为图像栈，请在软件中打开延时实验的所有帧（可通过点击 文件 | 打开…，或直接将对应文件拖拽至工具栏），然后点击 图像 | 栈 | 图像合成为栈。
2. 使用“减去背景”功能从图像栈中的所有图片中去除背景。操作方法为：点击 处理 | 减去背景。在弹出窗口中选择滚动球半径，所选半径应至少等于成像细胞的尺寸。若要将背景减除应用于图像栈中的所有细胞，请在弹出的 处理栈？ 窗口中选择 是。
3. 选择一个目标细胞，并使用工具栏在其周围绘制感兴趣区域（ROI）。对于核信号，可先点击工具栏中对应的 椭圆 选项，然后点击目标细胞核并调整椭圆范围将其包围。对于胞质信号或非常密集的区域，建议使用自由手绘选择工具，以便更紧密地贴合细胞轮廓。应避免包含过大的背景区域，尽管由于后续将减除所有背景像素（见步骤 4.8–4.9），因此无需精确贴合细胞轮廓。
4. 通过点击 分析 | 工具 | ROI 管理器 | 添加，或按键盘上的 T 键，将该感兴趣区域添加至 ROI 管理器。
5. 通过移动图像栈窗口中的滑块，或按键盘上的 Shift + <，进入下一帧，然后重复前述操作。在整个视频过程中持续追踪目标细胞，并将每一帧的 ROI 添加至 ROI 管理器。通过在 ROI 管理器中点击 更多 | 保存…，保存每个被追踪细胞的最终 ROI 集合。
   注意：细胞分裂后，应分别追踪两个子细胞，并在背景减除后（见步骤 4.6–4.9）将其积分强度相加，以校正细胞分裂过程中的蛋白稀释效应。请保存两个子细胞的 ROI 集合。
6. 当目标细胞在整个视频中完成追踪后，点击 测量，以获取 ROI 的平均强度和面积值。将所得数值复制到电子表格程序中，并按下式计算每个时间点细胞的原始积分强度：
   
   其中 Mean_c 为平均强度， Area_C 为对应 ROI 的面积。
7. 为估算局部背景，需在每个时间帧中于目标细胞附近添加一个 ROI。应避免包含任何细胞荧光信号。使用一个大小约等于细胞的圆形 ROI，并在必要时（例如邻近细胞干扰时）进行移动或缩小调整。例如，当邻近细胞干扰时，应相应调整 ROI 位置或大小。按照前述细胞 ROI 集合的操作方法，获得一组背景 ROI，并将测得的强度值复制至电子表格中。
8. 为获得细胞积分强度的背景校正值，首先计算每个时间点的背景积分强度：
   
   其中 Mean_BG 为背景信号的平均强度，Area_C 为包围细胞的 ROI 面积。请勿使用背景 ROI 的面积，除非两个区域面积相同。
9. 计算每个时间点细胞最终的背景减除后积分强度：
   
10. 为归一化单细胞衰减曲线，将每个时间点的强度值除以第一个时间点的强度值。
    注意：曲线拟合（见步骤 4.11）可针对每个单细胞进行，也可基于群体平均值进行。若计算群体平均值，则必须进行归一化，以避免因细胞间荧光强度差异导致的偏差。归一化可确保每个细胞对最终衰减曲线的贡献权重相同。此外，归一化有助于独立于绝对荧光强度来可视化单细胞衰减过程（见 图 3A–3C）。然而，若仅需确定单细胞半衰期且数据不进行平均处理，则可省略归一化步骤，直接对原始数据进行曲线拟合。
11. 为估算蛋白半衰期，使用曲线拟合工具。本研究中使用了 MATLAB 曲线拟合工具箱 3.4.1，该工具箱默认位于 MATLAB 用户界面的 应用程序 区域。通过点击 导入数据 选项卡，将电子表格中的荧光强度和时间值导入 MATLAB。打开曲线拟合工具箱，在 X 数据 和 Y 数据 选项卡中选择时间点和荧光衰减数据。在曲线拟合选项卡中选择 自定义方程，并输入指数衰减方程：
    
    其中 f(t) 为给定时间点的荧光强度，a 为初始强度，b 为衰减速率。在 拟合选项… 选项卡中，将 a 和 b 的下限均设为 0。拟合后，a 和 b 的估计值将显示在结果窗口中。按下式计算半衰期：
    

结果

本方案可估算任意与SNAP标签融合的蛋白质在细胞间的半衰期变异情况。利用重组E-cadherin-Fc包被成像培养板，可在胚胎干细胞（ES细胞）中实现单细胞分辨率，而这些细胞通常以集落形式生长。在整个成像过程中，可对单个细胞进行独立追踪（图1A）。

为了确定每个单细胞的蛋白质半衰期，必须随时间测量经背景校正后的整合SNAP-tag荧光信号（图1B），在细胞分裂的情况下，需将两个子细胞的整合荧光强度相加。由此可获得每条单细胞的指数衰减曲线，通过曲线拟合可从中提取衰减速率，进而计算出半衰期（图1C）。值得注意的是，若要计算平均衰减曲线，应将各单细胞轨迹归一化至第一帧，以确保尽管各细胞初始荧光强度可能存在差异，但每个细胞在平均值中具有相同的权重。

合适的染料浓度取决于所用染料的类型和细胞系，因此应针对每个实验进行优化。为说明这一点，

讨论

使用 SNAP-标签监测蛋白质降解时最关键的步骤是确保洗涤后培养基或细胞内不残留未结合的染料，否则这些染料可能在实验后续阶段与新合成的 SNAP-标签分子结合，从而影响降解曲线的准确性。一方面，这需要严格按照所述步骤进行充分洗涤；另一方面，染料浓度应尽可能低，同时仍需保持在能够获得良好信噪比的范围内。如图2所示，应通过测试不同稀释度来为每次实验优化染料浓度。在本实验中，多西环素诱导的细胞系具有相对较高的表达水平，因此可使用较低的染料浓度。

本方案描述了一种通过延时荧光成像在单细胞水平定量蛋白质降解的通用方法，该方案的各个部分可根据实验条件和具体实验目的进行相应调整。蛋白质降解通常遵循一级指数衰减规律。对于本文所示的蛋白质衰减曲线，拟合的R²值较高（0.95–0.99），使用多指数模型并未显著改善拟合效果。然而，如果单指数拟合结果不理想，可考虑采用多指数拟合，这可能意味着存在多个以不同速率衰减的标记蛋白亚群。此外，我们的图像分析流程包含大量人工操作，仅适用于分析少量细胞。若需分析大量细胞，应考虑采用更自...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>仪器设备
表达目标 SNAP-tag 融合蛋白的 ES 细胞系	-	-
Falcon 100 mm 细胞培养皿（TC处理）	康宁	353003
96孔，黑色/透明，组织培养处理板	康宁	353219
改进型奈堡计数室，0.1 mm	马里恩费尔德-上部	640030
CO2 培养箱	Panasonic	MCO-170AICUV-PE
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5804000528
InCell Analyzer 2200 细胞成像系统	GE Healthcare Life Sciences	29027886
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>试剂
格拉斯哥最低必需培养基	Sigma-Aldrich	G5154
胎牛血清，胚胎干细胞专用	赛默飞世尔科技	16141-079
丙酮酸钠溶液	Sigma-Aldrich	113-24-6
最低必需培养基  非必需氨基酸	赛默飞世尔科技	11140-035
青霉素-链霉素	生物概念	4-01F00H
L-谷氨酰胺 200 mM	赛默飞世尔科技	25030-024
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	63689-25ML-F
白血病抑制因子	-	-	通过HEK-293T细胞的瞬时转染在实验室中制备，随后收集并过滤上清液。
CHIR99021（GSK-3抑制剂XVI）	默克密理博	361559
PD 0325901	Sigma-Aldrich	391210-10-9
牛皮明胶	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Dulbecco's PBS 10倍浓缩液	生物概念	3-05K00-I
不含 Ca++/Mg++ 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液	生物概念	3-05F29-I
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4049
重组小鼠E-钙黏蛋白Fc融合蛋白	R&D系统	748-EC-050
盐酸多西环素	Sigma-Aldrich	D9891
SNAP-Cell 647-SiR	New England BioLabs	S9102S
FluoroBrite DMEM	赛默飞世尔科技	A18967-01
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>软件
FIJI	-	-	开源图像分析软件
MATLAB R2014a	Mathworks	-
Microsoft Excel	微软	-