通过延时荧光显微镜在贴壁细胞培养中对蛋白质降解速率进行单细胞定量分析

摘要

本方案描述了一种利用脉冲标记和SNAP-标签融合蛋白的荧光延时成像，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。

摘要

蛋白质处于合成与降解的动态平衡状态，其半衰期可在不同条件下发生调节。然而，目前常用的测定蛋白质半衰期的方法大多仅限于裂解细胞获得的群体平均值，或需要使用蛋白质合成抑制剂。本实验方案描述了一种利用SNAP-tag融合蛋白结合荧光时间延时显微镜技术，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。任何与SNAP-tag融合的目标蛋白均可共价结合一种带有苯甲基鸟嘌呤衍生物的荧光、可穿透细胞的染料，在洗去残留染料后，可监测标记蛋白群体的信号衰减过程。随后通过细胞追踪并量化随时间变化的总荧光强度，可为每个被追踪的细胞生成一条指数衰减曲线，进而通过曲线拟合确定单个细胞中蛋白质的降解速率。该方法能够估算培养细胞群体中半衰期的异质性，而这种异质性难以通过其他方法轻易评估。本文所述方法适用于表达SNAP-tag融合蛋白的任何类型的培养贴壁细胞。本文以生长在E-钙黏蛋白包被培养板上的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）为例，展示如何测定具有广泛不同半衰期的蛋白质在单细胞水平的降解速率。

引言

众所周知，细胞蛋白质会经历广泛的更新，其合成和降解速率对每种蛋白质具有特异性，并受到生理条件的调控。传统上，蛋白质降解速率的测定依赖于群体水平的方法，例如放射性脉冲追踪分析，或使用蛋白质合成抑制剂（如环己酰亚胺）¹。近年来，细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）结合质谱技术已被建立，用于在全基因组范围内定量蛋白质更新速率²。然而，这些方法受限于对细胞群体的平均化处理，因而丢失了单个细胞之间的变异信息。此外，对于在细胞群体中不同步发生的蛋白质降解的瞬时变化，这些方法也无法识别。

或者，也可采用基于荧光的方法测定蛋白质半衰期，此类方法通常具有单细胞分辨率的优势。例如，已有研究利用光激活型绿色荧光蛋白（paGFP）测定早期哺乳动物胚胎中Oct4的半衰期³另一种在活细胞中监测蛋白质降解的方法是使用SNAP标签结合荧光延时成像技术。SNAP标签是DNA修复酶O⁶-烷基鸟嘌呤DNA-烷基转移酶（AGT），可特异性地与苯甲基鸟嘌呤（BG）衍生物反应，后者可偶联至分子探针^4,5,6因此，任何与SNAP-标签融合....

方案

注意：本研究中使用了 E14 胚胎干细胞系。然而，该方案可直接适用于任何其他表达目标蛋白与 SNAP-标签融合蛋白的小鼠胚胎干细胞系，无论是通过标记内源性蛋白还是通过过表达实现。结果部分所示示例采用的是多西环素诱导型 SNAP-标签融合蛋白细胞系（SNAP-标签分别与以下蛋白融合：Nanog、Oct4、Srsf11 或荧光蛋白 mOrange2 和 sfGFP，并由多西环素诱导型启动子调控。有关构建多西环素诱导型 SNAP-标签融合细胞系所用质粒的更多信息，请参见¹¹）。多西环素诱导系统尤为有用，因其可严格控制目标蛋白表达的时间和强度。建议将 SNAP-标签置于蛋白的 C 末端，因为改变 N 末端氨基酸序列更可能影响目标蛋白的半衰期（N-末端规则¹²）。

1. E-钙黏蛋白包被及细胞接种

1. 生成表达目标蛋白与SNAP标签融合的ES细胞系⁴.
2. 用 4 mL 0.1% 明胶（溶于不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）中）包被 100 mm 细胞培养皿²⁺/毫克²⁺孵育1小时。去除明胶，室温干燥1小时。立即使用，或将包被的培养皿于4℃保存，最长可存放2个月。
3. 在 ES 细胞培养基（Glasgow 最低必需培养基，添加 1....

结果

本方案可评估任意与SNAP标签融合的蛋白质在细胞间的半衰期变异性。利用重组E-cadherin-Fc包被成像培养板，可在胚胎干细胞（ES细胞）中实现单细胞分辨率，这些细胞通常以集落形式生长。在整个成像过程中，可对单个细胞进行独立追踪（图1A）。

为了确定每个单细胞的蛋白质半衰期，必须随时间测量经背景校正的整合SNAP-tag荧光信号（图1B），在细胞分裂的情况下，需将两个子细胞的整合荧光强度相加。由此可获得每个细胞的指数衰减曲线，通过曲线拟合可从中提取衰减速率，进而计算出半衰期（图1C）。重要的是，若要计算平均衰减曲线，应将单细胞轨迹归一化至第一帧，以确保尽管各细胞初始荧光强度可能存在差异，每个细胞在平均值中具有相同的权重。

合适的染料浓度取决于所用染料的类型和细胞系，因此应针对每个实验进行优化。为说明这一点，

讨论

使用 SNAP-标签监测蛋白质降解时最关键的步骤是确保洗涤后培养基或细胞内不残留未结合的染料，否则这些染料可能在实验后续阶段与新合成的 SNAP-标签分子结合，从而影响降解曲线的准确性。一方面，这需要严格按照所述步骤进行充分洗涤；另一方面，染料浓度应尽可能低，同时仍需保持在能够获得良好信噪比的范围内。如图2所示，应通过测试不同稀释度来为每次实验优化染料浓度。在本实验中，多西环素诱导的细胞系具有相对较高的表达水平，因此可使用较低的染料浓度。

本方案描述了一种通过延时荧光成像在单细胞水平定量蛋白质降解的通用方法，该方案的各个部分可根据实验条件和具体实验目的进行相应调整。蛋白质降解通常遵循一级指数衰减规律。对于本文所示的蛋白质衰减曲线，拟合的R²值较高（0.95–0.99），使用多指数模型并未显著改善拟合效果。然而，如果单指数拟合结果不理想，可考虑采用多指数拟合，这可能意味着存在多个以不同速率衰减的标记蛋白亚群。此外，我们的图像分析流程包含大量人工操作，仅适用于分析少量细胞。若需分析大量细胞，应考虑采用更自.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>仪器设备
表达目标 SNAP-tag 融合蛋白的 ES 细胞系	-	-
Falcon 100 mm 细胞培养皿（TC处理）	康宁	353003
96孔，黑色/透明，组织培养处理板	康宁	353219
改进型奈堡计数室，0.1 mm	马里恩费尔德-上部	640030
CO2 培养箱	Panasonic	MCO-170AICUV-PE
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5804000528
InCell Analyzer 2200 细胞成像系统	GE Healthcare Life Sciences	29027886
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>试剂
格拉斯哥最低必需培养基	Sigma-Aldrich	G5154
胎牛血清，胚胎干细胞专用	赛默飞世尔科技	16141-079
丙酮酸钠溶液	Sigma-Aldrich	113-24-6
最低必需培养基  非必需氨基酸	赛默飞世尔科技	11140-035
青霉素-链霉素	生物概念	4-01F00H
L-谷氨酰胺 200 mM	赛默飞世尔科技	25030-024
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	63689-25ML-F
白血病抑制因子	-	-	通过HEK-293T细胞的瞬时转染在实验室中制备，随后收集并过滤上清液。
CHIR99021（GSK-3抑制剂XVI）	默克密理博	361559
PD 0325901	Sigma-Aldrich	391210-10-9
牛皮明胶	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Dulbecco's PBS 10倍浓缩液	生物概念	3-05K00-I
不含 Ca++/Mg++ 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液	生物概念	3-05F29-I
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4049
重组小鼠E-钙黏蛋白Fc融合蛋白	R&D系统	748-EC-050
盐酸多西环素	Sigma-Aldrich	D9891
SNAP-Cell 647-SiR	New England BioLabs	S9102S
FluoroBrite DMEM	赛默飞世尔科技	A18967-01
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>软件
FIJI	-	-	开源图像分析软件
MATLAB R2014a	Mathworks	-
Microsoft Excel	微软	-